專利名稱：一種體外培養牛胚胎的培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及體外培養牛胚胎的技術領域，具體為一種體外培養牛胚胎的培養基。
背景技術：
現有的體外培養牛胚胎的培養基，其一般選取含有牛血清白蛋白(BSA)的CRlaa 培養基，但是現有的培養基在體外培養牛胚胎時，其總囊胚發育率和直質量囊胚(Cl囊胚， IETS標準)的總數并不高，為此，研究人員進行了大量的實驗，具體實驗數據見圖1，其證實檸檬酸鈉和BSA對牛體外受精胚胎的體外發育有有益的影響，同時也確定在BSA和血清中含有的不同的胚胎營養素因子，可能不是檸檬酸鈉，對促進牛桑椹胚和囊胚發育，故發現這種胚胎營養素因子對于體外培養牛胚胎的培養基的成分至關重要。
發明內容
針對上述問題，本發明提供了一種體外培養牛胚胎的培養基，其加入了一種新的胚胎營養素因子，使得在該培養基中培養的牛體外胚胎的總囊胚發育率高，且高質量囊胚的總數提高。一種體外培養牛胚胎的培養基，其技術方案是這樣的 其特征在于培養基中額外加入二價鎂離子。其進一步特征在于
當二價鎂離子的含量為0. 35mM 2. ImM時，培養基可提高高質量牛胚胎的數量和質
量；
當二價鎂離子的含量為1. 4mM 2. SmM時，培養基可提高牛胚胎中的雌性比。其更進一步特征在于
所述二價鎂離子的來源具體為硫酸鎂化合物或氯化鎂化合物中的二價鎂離子； 牛胚胎的所述培養基適合與培養所有牛品種，印系牛(Bos Indicus),歐系牛(Bos Taurus)、以及雜交品系，包括奶牛、肉牛、黃牛、婆羅門牛；
所述牛胚胎包括體內胚胎、體外胚胎、孤雌活化胚胎、克隆胚胎、品種雜交的胚胎； 所述培養基適合于培養所有牛的胚胎，包括新鮮胚胎、慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚
胎；
所述體外培養牛胚胎的培養基適合于培養所有牛的胚胎，包括從一細胞開始到胚胎著床前后的囊胚期。采用本發明的結構后，在現有技術的體外培養牛胚胎的培養基中加入二價鎂離子后，從數據圖表可知，相對于未加入二價鎂離子的培養基，其使得在該培養基中培養的牛體外胚胎的總囊胚發育率高，且高質量囊胚的總數提高。
圖1為現有技術的培養基中BSA、檸檬酸鈉和FBS對體外培養牛胚胎發育的影響效
3果數據表格；
圖2為在培養基中加入二價鎂離子從0到2. ImM對體外培養牛胚胎發育的影響效果數據表格；
圖3為基礎培養基中添加鎂離子濃度為1. 4mM時對體外培養牛胚胎發育的影響效果數據表格；
圖4為基礎培養基中添加二價鎂離子來源分別為硫酸鎂化合物或氯化鎂化合物時對體外培養牛胚胎發育的影響效果數據表格；
圖5為在培養基中加入二價鎂離子從0到5. 6mM對體外培養牛胚胎發育性別的影響效果數據表格。
具體實施例方式實驗一含有二價鎂離子的培養基對體細胞共培養的IVF胚胎的影響
如圖2所示，將加入了 BSA的無血清CRlaa培養基分為A-E五組體外培養牛胚胎，其中 A組不加入二價鎂離子，B、C、D、E組加入0. 35mM,0. 70 mM、l. 4 mM、2. 1 mM的二價鎂離子， A-E五組的表明活性劑均為6 mg/ml的ICPbio BSA，在相同的其余環境下，分別重復四次， 取得實驗數據，圖2說明在培養基中加入二價鎂離子從0. 35mM到2. ImM，胚胎培養的質量從桑葚期開始有顯著的提高，且1. 4mM的濃度下培養的相對0. 35mM濃度下培養的胚胎數量和質量要顯著提高。實驗二 培養基添加鎂離子濃度為0或1. 4mM時對體外培養牛胚胎發育的影響如圖3所示，將無血清CRlaa培養基分為A-F六組體外培養牛胚胎，其中A組不加入鎂
離子且表明活性劑為ICPbio BSA、B組加入1. 4mM的氯化鎂化合物且表明活性劑為ICPbio BSA、C組不加入鎂離子且表明活性劑為Sigma BSA、D組不加入鎂離子且表明活性劑為PVA、 E組加入1. 4mM的氯化鎂化合物且表明活性劑為PVA、F組不加入鎂離子且表明活性劑為 FBS，在相同的其余環境下，分別重復四次，取得實驗數據，圖3說明在基礎培養基中添加鎂離子濃度為1.4mM時，可顯著的提高高質量牛胚胎的數量(這些高質量的胚胎是指適合冷凍保存和胚胎移植的)，并且和添加小牛胎血清(FBS)的效果相當。實驗三基礎培養基中添加二價鎂離子來源分別為硫酸鎂化合物或氯化鎂化合物時對體外培養牛胚胎發育的影響效果
如圖4所示，將無血清CRlaa培養基分為A-F五組體外培養牛胚胎，其中A組不加入二價鎂離子且牛血清蛋白為Sigma提供、B組加入1. 4mM的氯化鎂化合物且表明活性劑為 Sigma BSAX組加入1. 4mM的硫酸鎂化合物且表明活性劑為Sigma BSA,D組不加入鎂離子且表明活性劑為ICPbio BSA、E組加入1. 4mM的氯化鎂化合物且表明活性劑為ICPbio BSA、 F組加入1. 4mM的硫酸鎂化合物且表明活性劑為ICPbio BSA,在相同的其余環境下，分別重復四次，取得實驗數據，圖4說明鎂離子的來源不會影響胚胎的培養，無論是來自硫酸鎂或氯化鎂的二價鎂離子。實驗四培養基中加入二價鎂離子從O到5. 6mM對體外培養牛胚胎發育性別的影響效果
如圖5所示，在基礎培養基中分別加入數值為0、0. 35mM、0. 70 mM、l. 4 mM、2. 1 mM、2. 8 mM、3. 5 mM、4. 2 mM、5. 6 mM的二價鎂離子后，在相同的其余環境下，分別重復，取得實驗數據，圖5標明二價鎂離子的濃度變化會影響牛胚胎的性別比，濃度1. 4mM 2. 8mM，雌性比顯
者提尚。由于母牛的經濟效益遠遠高于公牛，故當二價鎂離子的含量為1. 4mM 2. SmM時， 培養基可提高牛胚胎中的雌性比，其給養殖業所帶來的經濟效益高。其中
Sigma 美國一家生化公司； ICPbio 新西蘭的一家生物公司； BSA:牛血清白蛋白； FBS 胎牛血清；
CRlaa培養基一種現有技術的培養基； PVA:聚乙烯醇； mM :mmol/L即毫摩爾每升。
權利要求
1.一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于培養基中額外加入二價鎂離子。
2.根據權利要求1所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于當二價鎂離子的含量為0. 35mM 2. ImM時，培養基可提高高質量牛胚胎的數量和質量。
3.根據權利要求1所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于當二價鎂離子的含量為1. 4mM 2. SmM時，培養基可提高牛胚胎中的雌性比。
4.根據權利要求2所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于當二價鎂離子的含量為1. 4mM時，培養基可顯著提高高質量牛胚胎的數量和質量。
5.根據權利要求1至4中任一權利要求所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于所述二價鎂離子的來源具體為硫酸鎂化合物或氯化鎂化合物中的二價鎂離子。
6.根據權利要求1至4中任一權利要求所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于所述的一種體外培養牛胚胎的培養基適合于養所有牛品種，印系牛、歐系牛、以及雜交品系，包括奶牛、肉牛、黃牛、婆羅門牛。
7.根據權利要求6中任一權利要求所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于所述的一種體外培養牛胚胎的培養基適合于培養所有牛的胚胎，包括體內胚胎、體外胚胎、孤雌活化胚胎、克隆胚胎、品種雜交的胚胎。
8.根據權利要求7所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于所述的一種體外培養牛胚胎的培養基適合于培養所有牛的胚胎，包括新鮮胚胎、慢速冷凍胚胎、玻璃化冷凍胚胎。
9.根據權利要求8所述的一種體外培養牛胚胎的培養基，其特征在于所述的一種體外培養牛胚胎的培養基適合于培養所有牛的胚胎，包括從一細胞開始到胚胎著床前后的囊胚期。
全文摘要
本發明提供了一種體外培養牛胚胎的培養基，其加入了一種新的胚胎營養素因子，使得在該培養基中培養的牛體外胚胎的總囊胚發育率高，且高質量囊胚的總數提高。其特征在于培養基中額外加入二價鎂離子。
文檔編號C12N5/073GK102559585SQ20121002363
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者徐捷, 杜福良, 楊瀾, 薛非 申請人:蘭諾生物技術無錫有限公司