專利名稱：肝癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種肝癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因水平評估肝癌發病的風險級別，并作為預防和治療肝癌的方向指導。
背景技術：
肝癌是全球第五位常見惡性腫瘤，也是今年來發病率上升最快的腫瘤之一，其病死率位于因癌癥而死亡的第三位。據世界衛生組織(WHO)統計，肝癌高發于非洲東南部和東南亞，我國多見于東南沿海。我國每年有11萬人死于肝癌，其中男性8萬，女性3萬，占全世界肝癌死亡人數45%。引起肝癌的危險因素很多，我國主要是由乙型肝炎病毒感染引起，其中 25 % -30 %的乙型肝炎患者可發展為肝硬化進而演變為肝癌。近年來，國內外學者針對肝癌的危險因素做了大量的研究，發現遺傳易感性是肝癌發病的內因，相關基因的變異可引起相應酶表達的異常，導致個體對毒物或致癌物產生不良反應。最近的研究表明，肝癌的發生與EPHX1、GSTMU GSTTU CYPlAl四個遺傳易感基因密切相關。EPHXl為環氧化物水解酶編碼基因，屬于II相代謝酶，該酶的主要功能是催化各種環氧化物水解，形成可溶性的物質排出體外。環氧化物很容易與DNA、蛋白質等生物大分子共價結合，導致細胞毒性或基因突變。EPHXl Tyrll3His單核苷酸多態性位點是EPHXl 基因第3號外顯子上一個C/T多態性位點突變，該多態位點的基因型有CC、CT、TT三種， CC (His/His)和CT(His/Tyr)風險基因型攜帶者，其EPHXl基因編碼蛋白的第113個氨基酸由Tyr(Y)變為His (H)，使該酶活性下降，從而使環氧化物水解速度降低，引起DNA單鏈斷裂，增加肝癌的易感性。谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進各種親電子的化合物(包括環境致癌物及其中間代謝產物)與谷胱甘肽結合，形成易溶于水的化合物排除體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發生的關系最為密切。GSTMl具有present和null兩個等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結構基因缺失的純合子，又稱為空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。 GSTTl基因多態現象與GSTMl類似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl 和GSTTl酶活性可能通過促進致癌劑的親電作用及從體內的排除而保護易感組織，防止體細胞的DNA突變，而GSTMl或GSTTl基因的純和缺失可能會降低或喪失機體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險性。因此，GSTMl、GSTT1基因缺失可以作為肝癌發生的重要危險因素。細胞色素P450家族基因CYPlAl也是肝癌發生相關的重要基因，該基因編碼一種重要的活化多環芳烴類致癌物的主要酶類細胞色素P4501A1，該酶是肝臟微粒體中重要的代謝酶之一，它的異常表達會促使大量致癌物在肝臟中聚集，且被激活的CYPlAl能將多種環境中的有機物質轉變為細胞毒素或其他致癌物質，從而增加癌癥發生的危險。大量研究顯示，CYPlAl基因與環境因素的交互作用會影響包括肝癌在內的多種癌癥的發病風險。比如，當CYPlAl酶蛋白462位氨基酸由Ile變為Val時，CYPlAl酶的活性增強，導致具有致癌能力的環氧化物濃度增加，引起DNA的損傷及染色體畸變，導致包括肝癌在內的多種腫瘤的發病風險。綜上所述，鑒于EPHXl、GSTM1、GSTT1和CYPlAl基因與肝癌的發生有著重要的關聯關系，可以做為預測和篩查肝癌的潛在指征，通過這些肝癌易感基因的檢測，能在預防和治療肝癌以及降低肝癌發生率等方面起到不容忽視的重要作用。
發明內容
本發明基于EPHXl 基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/ Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估肝癌發病的危險因子的基礎上，研制一種肝癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測EPHXl基因上Tyrll3His(rsl042522)，GSTM1 基因是否缺失(Null/Present)， GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl 基因上 Ile462Val (rsl048943)的 4 個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 測序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液 Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(I)EPHXl (Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl(Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;(3)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應條件為94°C預變性5min，然后94°C變性lmin，50°C Imin退火，72°C延伸 50s，35個循環后，72°C延伸10分鐘。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul，lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR 擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)EPHXl (Tyrll3His)測序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物Iul，25% Bigdye mixlul,3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.篩查肝癌風險人群的基因無創檢測服務I.無創采樣
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔粘膜上皮細胞取樣，樣本用細胞保存液常溫保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法對采集到的口腔粘膜細胞進行DNA抽提。3.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present)，CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA 測序，確定這4個SNPs位點的基因型。4.肝癌發病高危人群生物信息學分析及風險評估通過對受檢者SNPs基因型的生物信息學分析和風險評估模型鑒定，出具肝癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740) ,GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/ Present), CYPlAl基因上Ile462Val (rsl048943)的4個SNP位點基因檢測信息、肝癌風險評估結果和防治方案。根據受檢者的風險等級，由醫師向受檢者詳細說明并解讀肝癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測肝癌易感基因的無創檢測試劑盒，其組成成分為檢測EPHXl基因上單核苷酸多態性位點 Tyrl 13His (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYPlAl基因上單核苷酸多態性位點Ile462Val (rsl048943)基因型的PCR特異引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、 BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的特異性引物對是指針對 EPHXl基因上單核苷酸多態性位點Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl基因是否缺失(Null/Present), CYPlAl基因上單核苷酸多態性位點 Ile462Val (rsl048943)，能特異性擴增出包含4個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的DNA測序引物是針對EPHXl基因上 Tyrll3His(rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失 (Null/Present)，CYPlAl基因上單核苷酸多態性位點Ile462Val (rsl048943)，能通過DNA 測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其所含的4對特異性引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)正向引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'EPHXl (Tyrll3His)反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)GSTMl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(3)GSTTl(Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(4)CYPlAl(Ile462Val)正向引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'CYPlAl (Ile462Val)反向引物5' CAGGCTGAACCTTAGACCACA3'
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)EPHXl(Tyrll3His)測序引物5' CCACCTTTGGAGGACAGC3'(2)GSTMl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'(3)GSTTl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYPlAl(Ile462Val)測序引物5' CTTGCCTGTCCTCTATCCTTTG3'
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1) 0 反應體系10父？0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶O. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本項發明提供了一種檢測肝癌易感基因的無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測EPHX1基因上單核苷酸多態性位點Tyr113His(rs1051740)，GSTM1基因是否缺失(Null/Present)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，CYP1A1基因上單核苷酸多態性位點Ile462Val(rs1048943)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應體系、PCR產物純化體系、DNA測序反應體系等。本項發明的試劑盒通過檢測與肝癌發生密切相關的4個單核苷酸多態性位點的基因型來評估中國人群肝癌患病的風險級別，并根據受檢者基因檢測結果從基因方向指導中國人群有針對性的預防肝癌的發生，以降低肝癌的發病概率。本項發明所使用樣本為口腔粘膜細胞，采集方法無痛、無創、可避免交叉感染。基因測序過程采用ABI 3730型測序儀，方法簡便，結果準確，可靠，適合推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586430SQ20121002198
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月1日 優先權日2012年2月1日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司