專利名稱：一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，屬于有機廢棄物利用和可再生能源生產技術領域。
背景技術：
近年來，社會對能源的需求不斷增加，石油、煤炭等化石能源資源不斷減少，價格持續攀升，給人們的生產生活帶來不利影響，因此可再生能源的開發利用越來越受到各國政府和科研工作者的重視。沼氣是潔凈的可再生能源，取之不盡用之不竭。秸稈、禽畜糞便、 城市有機垃圾等有機物可經過厭氧消化轉化成沼氣，為人類提供清潔能源。參與沼氣發酵的微生物包括發酵性細菌、產氫產乙酸細菌、產甲烷古菌等。首先， 發酵性細菌將纖維素類物質降解為乙酸、丙酸等有機酸，將蛋白質降解為有機酸和氨，將脂肪降解為乙酸、丙酸、H2和(X)2 ；然后，產氫產乙酸細菌將產生的有機酸分解成乙酸、H2和 CO2 ；最終，產甲烷菌將4/CO2、甲基化合物、乙酸等小分子物質轉化成甲烷，其中任何一個環節的缺失都達不到產甲烷的目的。沼氣干發酵是近年來研究的熱點，它具有發酵固性物含量高、節約水、發酵裝置體積小，發酵后產物處理簡單，環境污染小的優點。但是干發酵濃度高、傳質困難，啟動時對接種物的要求很高。據相關文獻報道，沼氣干發酵啟動所采用的接種物主要是老沼氣池的發酵液、陰溝污泥、污水處理廠的脫水污泥、厭氧活性污泥等，未提及使用專門制備的沼氣干發酵復合菌劑。中國專利說明書CN101705199A公開了一種產甲烷復合菌劑及制備方法，該方法利用5株產甲烷菌作為菌種進行逐級液體擴培后混合成一種產甲烷復合菌劑，再用污泥或豬糞進行吸附，以實現固體復合菌劑的生產。該菌劑可以加快新建沼氣池或大換料后產沼氣的啟動時間，提高沼氣池的產氣效率和產氣穩定性。該專利菌系組成單一，未提及用于干發酵的啟動。中國專利說明書CN101948752A公開了一種用于沼氣發酵的復合菌劑，該菌劑是一種微生物發酵菌液的復合制劑，包含了纖維素擬桿菌、巴氏芽孢梭菌發酵液、黑海甲烷袋狀菌、馬氏甲烷八疊球菌等微生物，主要針對以牛糞為主要原料的常規沼氣發酵，發酵濃度為5-10%。該菌劑使用范圍窄，也未提及用于干發酵。中國專利說明書CN101705199公開了一種產甲烷復合菌劑及其制備方法，該菌劑由甲烷八疊球菌、甲酸甲烷桿菌、嗜樹甲烷短桿菌、廷達爾甲烷葉菌、肯氏鬃發甲烷菌組成， 在厭氧條件下接種于液體甲烷菌培養基，使用該菌劑可以提高正常運行沼氣池的產氣速率。該菌劑僅由產甲烷古菌組成，沒有發酵性細菌及產氫產乙酸菌等，功能單一，未提及用于干發酵。中國專利說明書CN 1014759 和CN101481676 B分別公開了一種厭氧降解纖維
素產甲烷復合菌和制作方法。該復合菌包含厭氧發酵性細菌、產氫產乙酸菌和產甲烷菌等13株菌。但其微生物組成主要針對纖維素的降解設計，用于稻草秸稈為主要原料的常規沼氣發酵，該菌劑使用范圍窄，也未提及用于干發酵。
發明內容
本發明的目的在于提供一種特別應用于沼氣干發酵的復合菌劑的制備方法，依照本方法所制作的沼氣干發酵復合菌劑中的微生物細胞總數至少為1. OX 101°個/g，產甲烷菌細胞總數至少為1. OX IO8個/g，將其用作干發酵的接種物能夠實現快速啟動和穩定運行。為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下
一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于將纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌組成的復合菌作為接種物，將接種物與發酵底物混合，在35士2°C條件下厭氧發酵6(Γ90天后，獲得沼氣干發酵復合菌劑。所述復合菌中，按細胞數量百分比為259Γ45%的纖維素分解細菌、99Tl5%的蛋白分解細菌、89Γ15%的脂肪分解細菌、89^1 產氫產乙酸細菌、189Γ31%的硫酸鹽還原菌和 2. 59Γ9. 5%的產甲烷古菌，各組份的微生物細胞總數至少為2 X 101°個/g，產甲烷古菌細胞總數至少為5 X IO8個/g。所述用作接種物的復合菌涉及到的11株菌如下
(1)Bacteroides cellulosilyticus解纖維素擬桿菌，嚴格厭氧，桿狀，革蘭氏染色陰性，能夠降解各種纖維素類物質，能利用各種糖類生成乙酸、丙酸、琥珀酸，菌株保藏編號為 DSM 14838τ ；
^Clostridium suffIavum黃色梭狀桿菌，嚴格厭氧，菌體為微彎曲桿狀，能運動， 周生鞭毛，最適生長溫度33 °C，最適生長pH 7. 4，能降解纖維素類物質，還能利用木糖，果糖，葡萄糖，纖維二糖，木聚糖，生成乙酸、乙醇、H2和CO2,菌株保藏編號為DSM 19573τ ；
^Clostridium pasteurianum巴氏芽孢梭菌，最適生長溫度37°C，不運動，次極末端形成一個卵圓形芽孢，可分解蛋白質、糖類，能發酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖產生乙酸，菌株保藏編號為DSM 525τ或ATCC 6013τ ；
Desulfobulbus rhabdoformis丙酸脫硫洋蔥狀菌，嚴格厭氧，圓桿狀，革蘭氏染色陽性，最適生長溫度31°C，最適pH6. 8^7. 2，降解丙酸鹽為乙酸和CO2,也能利用延胡索酸和蘋果酸作為碳源和能源，菌株保藏編號為DSM 8777τ或ATCC700652T ；
Syntrophomonas sapovorans長鏈脂肪酸互營單胞菌，嚴格厭氧，微彎曲桿狀，革蘭氏染色陽性，最適生長溫度35°C，能氧化分解解4到18個碳原子的脂肪酸飽和鏈狀脂肪酸產生乙酸和A2,與Methanospirillum hungatei互營，菌株保藏編號為DSM 3441τ ；
Syntrophomonas Wolfei沃氏互養單胞菌，嚴格厭氧，輕微螺桿狀，最適生長溫度 35°C，氧化丁酸產生乙酸和H2,與利用H2AD2的產甲烷菌互營，菌株保藏編號為DSM 4212τ ； (7^Desulfovibrio desulfuricans脫硫脫硫弧菌，嚴格厭氧，S彎曲狀，革蘭氏染色陰性，極生鞭毛，能運動，最適生長溫度37°C，以硫酸鹽作為電子受體異化有機物質獲得能量， 可以代謝乳酸鹽、丙酮酸等脂肪酸，菌株保藏編號為DSM 642τ ；
Methanospirillum hungatei亨氏甲烷螺菌，嚴格厭氧，彎曲桿狀，最適生長溫度CN 37°C，最適pH 7. (Γ7. 5，能利用H2/C02、甲酸產CH4,不利用乙酸、甲基胺、甲醇和其他醇類， 菌株保藏編號為DSM 864τ ；
U、Methanocorpusculum parvum小甲烷粒菌，嚴格厭氧，革蘭氏染色陰性，細胞呈小的不規則球形，最適生長溫度37°C，能以&/C02、甲酸鹽、丙二醇/ CO2、丁二醇/ CO2為底物產甲烷，菌株保藏編號為DSM 3823工或六10 43721τ ；
HQ)Methanosarcina barker!巴氏甲烷八疊球菌，嚴格厭氧，革蘭氏染色可變，不運動，呈不規則的球狀聚集體，單生或典型的多細胞聚集體，最適生長溫度37°C，能利用甲醇、 三甲胺、乙酸和吐/0)2生長產甲烷，但從不利用甲酸，菌株保藏編號為DSM 800τ ；
(.IDMethanosaeta concilii甲烷鬃毛菌，嚴格厭氧，細胞呈桿狀，革蘭氏染色陰性，最適生長溫度35°C，生長pH6. 5^7. 8，只利用乙酸鹽生長產甲烷，菌株保藏編號為DSM 2139τ。以上菌株均可通過德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)或美國典型培養物中心 (ATCC)獲得。所述解纖維素擬桿i Bacteroides cellulosilyticus和黃色梭狀桿菌Clostridium suffIavum力纖維素分解細菌；所述巴氏芽孢梭菌Clostridium ^a1StetfriazHffl 為蛋白分解細菌；所述長鏈脂肪酸互營單胞菌^^iroMoffloaas sapovorans 為脂肪分解細菌；所述沃氏互養單胞菌分/？&印力傭如浙Wolfei為產氫產乙酸細菌；所述脫硫脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans和丙酸脫硫洋蔥狀菌Desulfobulbus rhabdoformis為硫酸鹽還原菌；所述亨氏甲烷螺菌ifeiA^o^iri/A/ 小甲烷餘鬼Methanocorpusculum parvum、巴氏甲燒乂、疊球菌辦ar^eri禾口甲燒鬃毛蔑Methanosaeta concilii為產甲燒古菌。所述解纖維素擬桿菌的細胞數量百分比含量為159Γ25%，黃色梭狀桿菌的細胞數量百分比含量為109Γ20%，巴氏芽孢梭菌的細胞數量百分比含量為99Γ15%，丙酸脫硫洋蔥狀菌的細胞數量百分比含量為109Γ15%，長鏈脂肪酸互營單胞菌的細胞數量百分比含量為 89Γ15%，沃氏互養單胞菌的細胞數量百分比含量為89Γ12%，脫硫脫硫弧菌的細胞數量百分比含量為109Γ16%，亨氏甲烷螺菌的細胞數量百分比含量為0. 59Tl%，小甲烷粒菌的細胞數量百分比含量為1% 2%，巴氏甲烷八疊球菌的細胞數量百分比含量為0. 59Γ2. 5%，甲烷鬃毛菌的細胞數量百分比含量為0. 59Γ4%。所述復合菌中微生物細胞總數至少為2. 0 XlOltl個/g，產甲烷古菌細胞總數至少為 5. OX IO8 個/g。所述接種物與發酵底物混合的質量比為3 :10。所述發酵底物可選用豬糞、雞糞、稻草或玉米秸稈，糞便原料與秸稈原料按碳氮含量比例20 30 1 (質量比)組合使用。所述發酵底物應調節TS含量2(Γ30%，在自然溫度條件下堆慪7天。采用本發明的優點在于
一、本發明的菌劑制作方法把發酵濃度控制在209Γ30%，減小了發酵裝置的體積，成本低，生產流程易控制。二、本發明中，以高濃度的干發酵復合菌作接種物，使用劑量小，成本低廉，操作簡單。
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三、本發明制備方法中，復合菌劑由11株厭氧功能菌株組成，其生理特性清楚， 按功能進行分類，分別屬于纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌；在沼氣干發酵復合菌配方中，多株功能明確的菌種混合培養，產酶豐富，可以解除代謝產物的反饋抑制，保障發酵環境的穩定性。將其用于沼氣干發酵時，可以顯著縮短啟動時間，提高沼氣發酵效率，增強發酵過程的穩定性。四、本發明中，用作接種物的纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌在菌劑中的比例可根據發酵物料的不同在所述范圍內調整，使之達到更好的使用效果。五、本發明中，將接種物與發酵底物的混合質量比控制為3 :10，可在發酵啟動階段為菌種的生長代謝提供充足的營養，保證快速、穩定地進入菌劑發酵階段，實現微生物的迅速增殖。六、本發明中作為發酵底物的豬糞、牛糞、雞糞、稻草或玉米秸稈，具有碳氮比例明確，易收集，成本低廉，發酵效果穩定的優點。七、本發明中，通過不同種類的原料的合理搭配，可以保證發酵底物中碳氮含量比例維持在2(Γ30:1，為微生物在生長代謝過程中提供充足碳源和氮源，可以為微生物提供穩定的生長環境，保證微生物快速的增殖。八、利用本發明中所涉及的方法可以獲得一種高生物量的沼氣干發酵復合菌劑， 菌劑的微生物細胞總數至少為l.oxio"1個/g，產甲烷古菌細胞總數至少為1.0X108個/ g;該菌劑水分含量低，易于儲存、方便運輸、使用方法易操作。
具體實施例方式實施例1
本發明的復合菌種由11株菌組成，按照發酵過程中功能的不同，可以將這11株菌分為以下6類
纖維素分角軍細菌fecteroitfes eellulosilyticus , Clostridium sufflavum ； 蛋白分角軍細菌-.Clostridium pasteurianum ； 月旨肪分角軍細菌-.Syntrophomonas sapovorans ；
^^ !^ " -.Desulfovibrio desulfuricans, Desulfobulbus rhabdoformis ； 產氧產乙酸細菌-,Syntrophomonas Wolfei ；
產甲焼古菌-Methanospirillum hungatei，Methanocorpusculum parvum， Methanosarcina barker! , Methanosaeta concilii 0把上述分屬纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌的11株菌按比例直接混合組成復合菌作為接種物，以豬糞、雞糞、稻草或玉米秸稈等有機物為發酵底物。可以將糞便原料與秸稈原料按碳氮含量比例 20^30 :1組合使用，例如糞便原料與秸稈原料按20 :1、25 :1或30 :1。將接種物與發酵底物按3 :10 (質量比)混合后，調節TS含量為20% 30%，例如調節TS含量到20%、25%或30%，pH 值6.5 7.0，在35士21下厭氧培養60 90天。在上述過程中，接種物中的11株功能菌協同作用，降解底物生成甲烷，同時各功能菌株實現增殖，得到一種組成和性能穩定的沼氣干發酵復合菌劑。該菌劑中微生物細胞總數含量可達到LOXIOici個/g，產甲烷古菌細胞總數可達到1. OX IO8個/g。本發明的實施例中“TS含量(％)”指制作出的沼氣干發酵復合菌劑中干物質的含量；“細胞總數(個/克)”指每克上述菌劑中含11種功能微生物的細胞數量；“產甲烷菌細胞數(個/克)”指每克上述菌劑中含產甲烷古菌的細胞數量；PH值指獲得的沼氣干發酵復合菌劑的PH值。所述解纖維素擬桿菌的細胞數量百分比含量為159Γ25%，黃色梭狀桿菌的細胞數量百分比含量為109Γ20%，巴氏芽孢梭菌的細胞數量百分比含量為99Γ15%，丙酸脫硫洋蔥狀菌的細胞數量百分比含量為109Γ15%，長鏈脂肪酸互營單胞菌的細胞數量百分比含量為 89Γ15%，沃氏互養單胞菌的細胞數量百分比含量為89Γ12%，脫硫脫硫弧菌的細胞數量百分比含量為109Γ16%，亨氏甲烷螺菌的細胞數量百分比含量為0. 59Tl%，小甲烷粒菌的細胞數量百分比含量為1% 2%，巴氏甲烷八疊球菌的細胞數量百分比含量為0. 59Γ2. 5%，甲烷鬃毛菌的細胞數量百分比含量為0. 59Γ4%。實施例2
接種物中11株菌的組成比例具體如下Bacteroides cellulosilyticus臺22%, Clostridium suffIavum 占 17%, Clostridium pasteurianum 占 10%, Desulfobulbus rhabdoformis 占 11%, Syntrophomonas sapovorans 占 11%, Syntrophomonas Wolfei 占 10%, Desulfovibrio desulfuricans 占 13%, Methanospirillum hungatei 占 0. 5%, Methanocorpusculum parvum 占 1. 0%, Methanosarcina barker!占 1. 5%, Methanosaeta concilii 占 3%。以豬糞和玉米秸稈的混合物作發酵底物。玉米秸稈粉碎成粉，與豬糞按質量比1 1的比例混合，加水調節TS含量為30%，自然溫度下堆慪7天。堆慪結束后，用石灰粉調節 PH值至7. 0，再按原料接種物=10 3 (質量比)加入上述接種物，混合均勻后，可調節混合料的水分含量至80%，在35士2°C條件下厭氧培養。60^90天后獲得復合菌劑，其各項指標如下表所示
權利要求
1.一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于將纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌組成的復合菌作為接種物，將接種物與發酵底物混合，在35士2°C條件下進行厭氧發酵，發酵6(Γ90天后，獲得沼氣干發酵復合菌劑。
2.根據權利要求1所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述復合系中，按細胞數量百分比為259Γ45%的纖維素分解細菌、99Γ15%的蛋白分解細菌、89^15%的脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、189Γ31%的硫酸鹽還原菌和2. 59Γ9. 5%的產甲烷古菌，各組份的微生物細胞總數至少為2 XlOltl個/g，產甲烷古菌細胞總數至少為5 X IO8個/g。
3.根據權利要求1或2所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述的纖維素分解細菌可以為解纖維素擬桿菌fecteroiifes cellulosilyticus和/或黃色梭狀桿菌Clostridium suffIavum ；所述蛋白分解細菌可以為巴氏芽孢梭菌Clostridiumpas teurianum ；所述脂肪分解細菌可以為長鏈脂肪酸互營單胞菌trophomonassapovorans ；所述產氫產乙酸細菌可以為沃氏互養單胞菌wolfei ；所述硫酸鹽還原菌為脫硫脫硫弧菌ifesW/biaT^io desulfuricans和/或丙酸脫硫洋蔥狀菌Desulfobulbus rhabdoformis ；所述產甲燒古菌可以為亨氏甲烷螺菌JfeiAaz7O1^iriB腫hunga tei、小甲燒粒菌 ifethanocorpusculum parvum 、巴氏甲燒乂、疊球菌 Methanosarcinabarker!禾口 / 或甲燒鬃毛菌 JfeiAaflo1Saeia concilii。
4.根據權利要求3所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述解纖維素擬桿菌的數量百分比含量為15 25%，黃色梭狀桿菌的數量百分比含量為1(Γ20%，巴氏芽孢梭菌的數量百分比含量為纊15%，丙酸脫硫洋蔥狀菌的數量百分比含量為1(Γ15%，長鏈脂肪酸互營單胞菌的數量百分比含量為壙15%，沃氏互養單胞菌的數量百分比含量為8 12%，脫硫脫硫弧菌的數量百分比含量為1(Γ16%，亨氏甲烷螺菌的數量百分比含量為0.5 1%，小甲烷粒菌的數量百分比含量為廣2%，巴氏甲烷八疊球菌的數量百分比含量為0.5^2. 5%，甲烷鬃毛菌的數量百分比含量為0. 5 4%。
5.根據權利要求1、2或4所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述接種物與發酵底物混合的質量比為3 :10。
6.根據權利要求5所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述發酵底物為豬糞、雞糞、稻草或玉米秸稈，糞便原料與秸稈原料按碳氮含量比例2(Γ30 1組合使用。
7.根據權利要求6所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述發酵底物應調節TS含量2(Γ30%，在自然溫度條件下堆慪7天。
8.根據權利要求1、2、4或6所述的一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，其特征在于所述復合菌劑中，微生物細胞總數至少為1. OX 101°個/g，產甲烷菌細胞數量至少為1.OX IO8 個/g。
全文摘要
本發明公開了一種沼氣干發酵復合菌劑的制備方法，將纖維素分解細菌、蛋白分解細菌、脂肪分解細菌、產氫產乙酸細菌、硫酸鹽還原菌和產甲烷古菌組成的復合菌作為接種物，將接種物與發酵底物混合，并調節混合料的水分含量至70~80%，pH值7.0，在35℃±2℃條件下進行厭氧發酵，發酵60~90天后，獲得沼氣干發酵復合菌劑。本發明可制備具有較完整沼氣發酵功能微生物的復合菌劑，該菌劑中微生物細胞總數至少為1.0×1010個/g，產甲烷古菌細胞總數至少為1.0×108個/g。將其用作沼氣干發酵的接種物，能夠縮短啟動時間，并且發酵過程穩定、易于控制。
文檔編號C12R1/145GK102559499SQ201210021688
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月31日 優先權日2012年1月31日
發明者代麗蓉, 尹小波, 張云飛, 徐彥勝, 承磊, 李強, 馬詩淳 申請人:農業部沼氣科學研究所