專利名稱:一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)中的人類干細(xì)胞分離領(lǐng)域,具體來說,涉及一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法。
背景技術(shù):
現(xiàn)有技術(shù)中,用于人類血液細(xì)胞分離的方法包括免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法、血細(xì)胞分離機(jī)法和培養(yǎng)擴(kuò)增法等方法。免疫磁珠法是將已知的抗體包被在磁珠微粒上,使磁珠微粒與人類血液混合。呈抗原抗體陽性的細(xì)胞粘附在磁珠上,通過一條磁性管道,磁珠被吸附在管壁上;其它沒有結(jié)合磁珠的細(xì)胞都流走后,去除管道磁性,搜集所有含有磁珠的細(xì)胞。存在問題造價(jià)高,中低收入患者不適用。對(duì)細(xì)胞本身活性有損傷,影響細(xì)胞治療療效。流式細(xì)胞儀法的分選功能是由細(xì)胞分選器完成的。其過程是由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴,根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選,而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電,帶電液滴攜帶細(xì)胞通過靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn),落入收集器中;其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉,某些類型的儀器也有采用捕獲管來進(jìn)行分選的。存在問題,一臺(tái)流式細(xì)胞儀造價(jià)300-500萬元,標(biāo)記用抗體1500-5000元一支,造價(jià)高,標(biāo)記物有致癌性,應(yīng)用于臨床不安全,只能適用于科研。血細(xì)胞分離機(jī)法主要用于分離外周血,先給患者注射動(dòng)員劑,然后使患者外周血經(jīng)過血細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)過濾,得到一定范圍直徑的細(xì)胞,用于細(xì)胞治療。存在問題打動(dòng)員劑增加治療負(fù)擔(dān),分離后細(xì)胞液體積過大,患者承擔(dān)一定的生命危險(xiǎn)。培養(yǎng)擴(kuò)增法是在采集人類血液后,加入試劑置于培養(yǎng)箱擴(kuò)增,I周后清洗使用。存在問題污染率高,干細(xì)胞向未知方向分化為未知干細(xì)胞,時(shí)間長(zhǎng)?,F(xiàn)有技術(shù)中,已經(jīng)公開的涉及骨髓和血液分離專利文獻(xiàn)包括申請(qǐng)?zhí)?00510130326. 7,名稱一種分離細(xì)胞的方法及專用細(xì)胞分離液。該分離細(xì)胞的方法缺點(diǎn)上述方法針對(duì)雞,牛,人血液需要做各種調(diào)整,準(zhǔn)確度堪憂,由于添加了表面活性劑,分離出的細(xì)胞未知,只能用于簡(jiǎn)單的細(xì)胞試驗(yàn)使用。申請(qǐng)?zhí)?00610035900. 5,名稱一種干細(xì)胞分離液及其用于干細(xì)胞分離的方法。 該干細(xì)胞分離液和干細(xì)胞分離的方法的缺點(diǎn)需要配制工作液,需要調(diào)節(jié)密度,只能搜集密度在1.083g/ml范圍內(nèi)的細(xì)胞,即搜集到的細(xì)胞較雜,而可用于治療所需要的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量少,并且對(duì)于臍帶血來說,使用該方法去除紅細(xì)胞不凈,最終臨床應(yīng)用的時(shí)候會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生排異反應(yīng)。申請(qǐng)?zhí)?00610114475. 9名稱用于分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒。使用該試劑盒的缺點(diǎn)使用該試劑盒直接分離血液中的干細(xì)胞,數(shù)量不足以臨床治療使用,所以該方法進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)的細(xì)胞污染率高,體外模擬體內(nèi)環(huán)境使細(xì)胞擴(kuò)增,導(dǎo)致培養(yǎng)出的細(xì)胞有形態(tài)沒功能,不能用于臨床治療。
申請(qǐng)?zhí)?00610106875. 5名稱一種有核細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。缺點(diǎn)此試劑盒及其應(yīng)用方法所用的HIST0PAGUE1077為密度I. 077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液, 經(jīng)此分離后的細(xì)胞絕大多數(shù)為淋巴細(xì)胞,這樣導(dǎo)致細(xì)胞中能夠用于治療的干細(xì)胞占少數(shù), 影響臨床療效。申請(qǐng)?zhí)?00710137781. 9名稱骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法。 缺點(diǎn)該試劑盒的使用中添加了 Lin抗體,導(dǎo)致成本大大提高,投入到臨床使用后,給中低收入患者造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),導(dǎo)致患者看不起病,接受不起細(xì)胞治療,并且使用了 Lin抗體對(duì)細(xì)胞清洗造成了較大負(fù)擔(dān),此種物質(zhì)進(jìn)入人體后會(huì)發(fā)生何種變化還是未知數(shù)。以上專利文獻(xiàn)公開的試劑盒或其使用方法存在原料來源復(fù)雜,配制繁瑣,對(duì)于分離哪種血液針對(duì)性不強(qiáng)(因?yàn)槿祟愌蛣?dòng)物血細(xì)胞存在一定差異),獲得的分離液用與治療難以控制等缺點(diǎn)。因此,以上僅適用于實(shí)驗(yàn),現(xiàn)今臨床治療應(yīng)用較多的提取干細(xì)胞得方法大致有3 種I :過篩方法,例如血細(xì)胞分離機(jī),是將血液直接過篩,篩選細(xì)胞體積較大的細(xì)胞用于治療,其中包含部分紅細(xì)胞,部分干細(xì)胞,部分白細(xì)胞,部分淋巴細(xì)胞等,體積較大約在 50ml-150ml左右,直接注入人體治療心臟無法承受;2 :標(biāo)記法用抗體對(duì)所需要細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,然后再洗脫標(biāo)記物,用于治療,對(duì)于未知的標(biāo)記物致癌性有待研究;3 :負(fù)篩選,標(biāo)記血液中所不被治療需要的細(xì)胞,不需要清洗,保持細(xì)胞原始活性, 這種方法較好,治療效果也很明顯,但是對(duì)于細(xì)胞是否處于治療最佳狀態(tài)有待研究,因?yàn)楸娝苤?,每種細(xì)胞存在于血液中都是平衡的,使用負(fù)篩選方法篩選出不用于治療的細(xì)胞就打破了血液中各種細(xì)胞中的平衡,導(dǎo)致電位紊亂,并且分離過程中需要稀釋液和離心作用, 細(xì)胞受擠壓后再被吸取稀釋,清洗,這樣導(dǎo)致細(xì)胞功能下降,干細(xì)胞不是治療中最良好的狀態(tài),治療效果大打折扣,細(xì)胞數(shù)量活率也在急劇減少,導(dǎo)致采血量增大,給患者帶來痛苦。現(xiàn)有技術(shù)中需要解決的技術(shù)問題是I.治療成本高。完成細(xì)胞分離工作的儀器設(shè)備(如血細(xì)胞分離機(jī)及流式細(xì)胞儀) 價(jià)格昂貴,導(dǎo)致治療成本升高,增加了患者的治療費(fèi)用,不利于項(xiàng)目的推廣和普及。2.細(xì)胞活性低。免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀法篩選出來的均是被標(biāo)記了的細(xì)胞,這些分選方法均存在篩選細(xì)胞范圍小、細(xì)胞負(fù)重后活性降低以及標(biāo)記物留在人體內(nèi)會(huì)變成什么還是未知等問題。3.細(xì)胞液體積大。使用血細(xì)胞分離機(jī)分離的一般為外周血,且需要采集前打2-7 天動(dòng)員劑,將骨髓中干細(xì)胞動(dòng)員到外周血里,經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)分離后篩選出的細(xì)胞液體積較大,一般都超過50ml,且紅細(xì)胞去除不干凈。最后得到的細(xì)胞懸液體積大、質(zhì)量不佳,只能用于自體皮下注射。4.獲取細(xì)胞時(shí)間過長(zhǎng)。培養(yǎng)擴(kuò)增一周后才能用于臨床治療,時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)延誤治療的最佳時(shí)機(jī),影響治療效果,培養(yǎng)期間造成污染率提高。5.傳統(tǒng)的分離方法僅限于實(shí)驗(yàn)室及科研使用。許多分離方法操作過程繁瑣,對(duì)人員的專業(yè)要求較高,既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。從實(shí)驗(yàn)方法到臨床應(yīng)用還需要技術(shù)改進(jìn)。不能產(chǎn)業(yè)化。 實(shí)驗(yàn)成本高、操作環(huán)節(jié)中污染機(jī)率大、細(xì)胞液的保存運(yùn)輸條件不備,導(dǎo)致提取的細(xì)胞液數(shù)量有限,滿足不了臨床治療的大量需求。申請(qǐng)?zhí)?00910187212. 4、名稱為“人類骨髓、臍帶血、外周血細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法”是本申請(qǐng)人之前提出的一篇專利申請(qǐng)。該申請(qǐng)中提到了利用O. 9%的Nacl注射液或PBS液作為稀釋劑、6%羥乙基淀粉或O. 2-1 %甲基纖維素作為沉淀劑、由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 075+0. 001作分層液。本申請(qǐng)的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠安全有效快捷的分理出適合臨床使用的干細(xì)胞。但是本發(fā)明尚存的缺陷是分離出的干細(xì)胞混有一定量纖維蛋白,干細(xì)胞的數(shù)量在臨床治療中有所不足,并且由于缺乏進(jìn)入人體治療中輔助的氨基酸和肽,因此后期營養(yǎng)供給不足,不能在進(jìn)入人體后發(fā)揮最大的治療作用。此外,腦蛋白水解物為豬腦組織經(jīng)過酶解再提取分離出的無菌制劑,含有大量的人體所需的氨基酸和肽。目前腦蛋白水解物的應(yīng)用主要是作為一種藥物直接用于患者。其治療的領(lǐng)域有1血管性癡呆(如多發(fā)梗塞性癡呆等)和中風(fēng)后的認(rèn)知功能障礙。2混合性癡呆。3顱腦手術(shù)后腦功能障礙。4腦挫傷或腦震蕩后遺癥等。迄今為止,還沒有公開腦蛋白水解物用于干細(xì)胞提取的技術(shù)方案。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中目標(biāo)干細(xì)胞的回收數(shù)量不夠高、并且存活率不夠理想的缺陷,本發(fā)明提供了一種人類骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞樣本密度分離液及使用它分離人類骨髓干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞或外周血干細(xì)胞的方法。本發(fā)明提高了人類骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞的分離數(shù)量和回收率。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,發(fā)明人設(shè)計(jì)了多種方案,在進(jìn)行了大量的試驗(yàn)和對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析后,驚奇的發(fā)現(xiàn)在分離干細(xì)胞的過程中,加入適量腦蛋白水解物有助于提高目標(biāo)干細(xì)胞的回收數(shù)量,而對(duì)目標(biāo)干細(xì)胞的存活率不產(chǎn)生不利影響。本發(fā)明之一的人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液是這樣實(shí)現(xiàn)的所述的干細(xì)胞樣本密度分離液分別由I號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成,按照重量百分比計(jì),其各自組份的含量為I號(hào)液為稀釋劑,選自下列水溶液之一 0. 1-30%氯化鈉注射液和O. 1-20%的腦蛋白水解物組成的水溶液、或者O. 1-30%的pH為7-7. 5的磷酸鹽緩沖液和O. 1% -20%的腦蛋白水解物組成的水溶液;2號(hào)液為沉淀劑,選自O(shè). 1-30%羥乙基淀粉水溶液或O. 1_30%甲基纖維素水溶液;3號(hào)液為分層液,其為密度為I. 0-1. 2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。在實(shí)施中,所述的腦蛋白水解物為選自下列產(chǎn)品之一國藥準(zhǔn)字H20052182國藥準(zhǔn)字 H20003386、國藥準(zhǔn)字 H20003384 或國藥準(zhǔn)字 H20003385 ;所述的腦蛋白水解物的組分含量?jī)?yōu)選為O. 3-20% ;所述的水溶液的水為滅菌注射用水。更具體地說,所述I號(hào)液的氯化鈉注射液組分含量可以為O. 3-12%、優(yōu)選O. 5_2%、更優(yōu)選為
O.9% ;
所述I號(hào)液的的磷酸鹽緩沖液的pH可以為7. 1-7. 4優(yōu)選7. 2-7. 4、更優(yōu)選為7. 4 ;所述的的腦蛋白水解物組分含量可以為O. 8-15 %、優(yōu)選I. 5-4. 5 %、更優(yōu)選為 3 % ;所述2號(hào)液的羥乙基淀粉組分含量為O. 5-18%、優(yōu)選I. 5_12%、更優(yōu)選為6% ;所述2號(hào)液的甲基纖維素組分含量為O. 2-8%、優(yōu)選O. 3_5%、更優(yōu)選為O. 5% ;所述3號(hào)液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為I. 01-1. 088g/ml、優(yōu)選I. 035-1. 08g/ml、 更優(yōu)選為1.075g/ml。在具體實(shí)施中,所述的I號(hào)液在超濾條件下除菌,2 3號(hào)液可以在100_130°C、優(yōu)選105_120°C的溫度下,滅菌10-50、優(yōu)選15-20分鐘。本發(fā)明之二是使用上述的干細(xì)胞樣本密度分離液提取人類骨髓、臍帶血或外周血分離干細(xì)胞的分離方法,所述的方法包括如下包括(I)將采集、抗凝后的骨髓、臍帶血或外周血樣品加入到含有I號(hào)液稀釋劑的大容量培養(yǎng)液瓶中,得到稀釋樣品;(2)在步驟(I)的稀釋樣品中加入2號(hào)液沉淀劑混勻,靜置,待分層后吸取上層細(xì)胞液離心濃縮后得到濃縮樣品;(3)將步驟⑵的濃縮樣品鋪到3號(hào)液上層,然后離心分離,得到干細(xì)胞層。在具體實(shí)施中所述步驟(I)的骨髓、臍帶血或外周血樣品的采集、抗凝、稀釋均需在無菌條件下完成,其采集、抗凝方法分別為骨髓血采集采用髂后上棘,局麻骨穿方法,使用采髓針采集骨髓,采集骨髓用的針管中先抽取1-1. 5ml枸櫞酸鈉抗凝液,再抽取骨髓與枸櫞酸鈉抗凝液合計(jì)為5ml,依次方法采集,收集采集的骨髓注入無菌瓶中,得到骨髓血預(yù)處理樣品;臍帶血的采集在產(chǎn)婦胎盤脫落后,使用單包含枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋,將其采血袋上的針頭插入臍靜脈中,一邊采集一邊輕輕晃動(dòng)采血袋,使抗凝液與臍帶血充分結(jié)合, 得到臍帶血預(yù)處理樣品;外周血采集對(duì)被采血者手臂進(jìn)行消毒,使用含有枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋,將采血袋上的針頭插入手臂靜脈采集過程中慢慢搖動(dòng)采血袋,使抗凝液與外周血充分結(jié)合,得到外周血預(yù)處理樣品;在所述步驟(I)中,經(jīng)采集、抗凝后的骨髓血、臍帶血或外周血預(yù)處理樣品與I號(hào)液的體積比為I : 1,得到稀釋樣品;在所述的步驟(2)中,稀釋樣品與2號(hào)液的體積比為2 1,再經(jīng)過搖勻1-8分鐘, 放置3分鐘-3小時(shí),待分層后吸取上層細(xì)胞液,分裝至50ml離心管中,以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-20分鐘,搜集下層細(xì)胞液,得到濃縮樣品;將步驟(3)得到濃縮樣品用生理鹽水稀釋后鋪在號(hào)液3液上,以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-60分鐘,收集存在于整個(gè)離心管中間位置的約2-4_厚的油狀干細(xì)胞層;將收集的干細(xì)胞層用生理鹽水清洗1-5次,再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積即可。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比最突出的特點(diǎn)是在分離過程中加入含有大量氨基酸和肽的腦蛋白水解物。由于腦蛋白水解物填補(bǔ)了血液中被去除細(xì)胞后的平衡缺陷,及時(shí)給予干細(xì)胞所需營養(yǎng),因此促進(jìn)了干細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,改善了干細(xì)胞能量代謝。另外,腦蛋白水解物還能分解干細(xì)胞在分離過程中產(chǎn)生的纖維蛋白顆粒,避免了在干細(xì)胞治療過程中形成血栓的問題,杜絕了干細(xì)胞在分離過程中由于受到擠壓,外界刺激等因素造成的干細(xì)胞質(zhì)量下降現(xiàn)象。在本發(fā)明的多次試驗(yàn)、研制過程中,發(fā)明人觀察到 在干細(xì)胞分離試驗(yàn)中,由于分離細(xì)胞過程中的離心作用和低溫條件,會(huì)出現(xiàn)纖維蛋白,并且這些纖維蛋白會(huì)形成肉眼可見顆粒。如果這些顆粒混在治療用的干細(xì)胞中,會(huì)導(dǎo)致稍細(xì)血管堵塞,使血液流通不順暢,使干細(xì)胞不能快速作用到病灶部位進(jìn)行恢復(fù)治療。而采用本發(fā)明的方法加入腦蛋白水解物后,就不再會(huì)出現(xiàn)肉眼可見纖維蛋白顆粒,提高臨床治療安全性和有效性。綜上所述,本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是I、本發(fā)明通過腦蛋白水解物提高了干細(xì)胞分離回收數(shù)量。2、本發(fā)明保留了原有干細(xì)胞活性,干細(xì)胞液體積小,干細(xì)胞種類齊全,分離操作時(shí)間短,僅I小時(shí)左右即可完成。3、本發(fā)明特別適用于分離人類骨髓、臍帶血或外周血,針對(duì)性強(qiáng)。4、本發(fā)明安全性高,產(chǎn)品內(nèi)毒素均符合臨床使用要求,制備過程對(duì)環(huán)境及干細(xì)胞本身不會(huì)造成任何污染。5、本發(fā)明原料簡(jiǎn)單易得,造價(jià)低,可操作性強(qiáng)、試劑盒易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此本發(fā)明是臨床上迫切需要的一種分離人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞的分離液及分離方法。
圖I是使用本發(fā)明的試劑盒分離人類骨髓得到的干細(xì)胞的顯微照片;圖2是使用本發(fā)明的試劑盒分離人類臍帶血得到的干細(xì)胞的顯微照片;圖3是使用本發(fā)明的試劑盒分離人類外周血得到的干細(xì)胞的顯微照片。
具體實(shí)施例方式干細(xì)胞樣本密度分離液制備實(shí)施例1-14本發(fā)明的干細(xì)胞樣本密度分離液的具體制備方法是I號(hào)液500ml :0. 1-30%氯化鈉注射液或pH7_7. 5的磷酸鹽緩沖液(PBS)液,分別加入O. 1-20%的腦蛋白水解物(本實(shí)施例中所用的腦蛋白水解物均為海南通用同盟藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用腦蛋白水解物)。其中,磷酸鹽緩沖液的配方為(以總體積500ml為例)氯化鈉4g,氯化鉀O. Ig, 12水磷酸氫二鈉I. 445g,磷酸二氫鉀O. Ig ;先用少量水溶解上述試劑,然后加水至500ml,即得,用前用5. 6%碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至7-7. 5。2號(hào)液150ml :選用濃度為O. 1_30%的羥乙基淀粉水溶液或濃度為O. 1_30%的甲基纖維素水溶液。3號(hào)液80ml :由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為I. 0-1. 2g/ml的分層液組成,配有500ml大容量培養(yǎng)液瓶,免除臨床現(xiàn)有少量多次分離干細(xì)胞的繁瑣過程,大大降低了污染機(jī)率。其中,上述I號(hào)液在超濾條件下除菌,2號(hào)液經(jīng)過100°C -130°C, 10分鐘-50分鐘滅菌,檢測(cè)1-2號(hào)液內(nèi)毒素含量彡O. 5EU/ml,裝瓶。上述3號(hào)液經(jīng)過100°C -130°C, 10分鐘-50分鐘滅菌,檢測(cè)其內(nèi)毒素含量彡IEU/ ml,裝瓶。實(shí)施例1-14的具體數(shù)據(jù)請(qǐng)見表I。表I制備實(shí)施例1-14的一覽表
權(quán)利要求
1.一種人類骨髓、臍帶血或外周血干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述的干細(xì)胞樣本密度分離液分別由I號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成,按照重量百分比計(jì), 其各自組份的含量為I號(hào)液為稀釋劑,選自下列水溶液之一 0. 1-30%氯化鈉注射液和O. 1-20%的腦蛋白水解物組成的水溶液、或者O. 1-30%的pH為7-7. 5的磷酸鹽緩沖液和O. 1_20%的腦蛋白水解物組成的水溶液;2號(hào)液為沉淀劑,選自O(shè). 1-30%羥乙基淀粉水溶液或O. 1-30%甲基纖維素水溶液;3號(hào)液為分層液,其為密度為I. 0-1. 2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺水溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述的腦蛋白水解物為選自下列產(chǎn)品之一國藥準(zhǔn)字H20052182、國藥準(zhǔn)字 H20003386、國藥準(zhǔn)字 H20003384 或國藥準(zhǔn)字 H20003385 ;所述的腦蛋白水解物的組分含量為O. 3-15% ;所述的水溶液的水為滅菌注射用水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述I號(hào)液的氯化鈉注射液組分含量為O. 3-12%或磷酸鹽緩沖液的pH為7. 1-7. 4,其中的腦蛋白水解物組分含量為O. 8-6% ;所述2號(hào)液的羥乙基淀粉組分含量為O. 5-18%或甲基纖維素組分含量為O. 2-8% ; 所述3號(hào)液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為I. 01-1. 088g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述I號(hào)液的氯化鈉注射液組分含量為O. 5-2%或磷酸鹽緩沖液的pH為7. 2-7. 4,其中的腦蛋白水解物組分含量為I. 5-4. 5% ;所述2號(hào)液的羥乙基淀粉組分含量為I. 5-12%或甲基纖維素組分含量為O. 3-5% ; 所述3號(hào)液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為I. 035-1. 08g/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述I號(hào)液的氯化鈉注射液組分含量為O. 9%或磷酸鹽緩沖液的pH為7. 4,其中的腦蛋白水解物組分含量為3% ;,所述2號(hào)液的羥乙基淀粉組分含量為6%或甲基纖維素組分含量為O. 5% ;所述3號(hào)液聚蔗糖和泛影葡胺的密度為I. 075g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5之一的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述的I號(hào)液在超濾條件下除菌,2 3號(hào)液在100°C _130°C的溫度下,滅菌10-50分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的干細(xì)胞樣本密度分離液,其特征在于所述的2 3號(hào)液在105°C _120°C的溫度下,滅菌15-20分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7之一的干細(xì)胞樣本密度分離液分離干細(xì)胞的方法,其特征在于所述的方法包括如下步驟(1)將采集、抗凝后的骨髓、臍帶血或外周血樣品加入到含有I號(hào)液稀釋劑的大容量培養(yǎng)液瓶中,得到稀釋樣品;(2)在步驟(I)的稀釋樣品中加入2號(hào)液沉淀劑混勻,靜置,待分層后吸取上層細(xì)胞液離心濃縮后得到濃縮樣品;(3)將步驟(2)的濃縮樣品鋪到3號(hào)液上層,然后離心分離,得到干細(xì)胞層。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離干細(xì)胞的方法,其特征在于所述步驟(I)的骨髓、臍帶血或外周血樣品的采集、抗凝、稀釋均需在無菌條件下完成,其采集、抗凝方法分別為骨髓血采集采用髂后上棘,局麻骨穿方法,使用采髓針采集骨髓,采集骨髓用的針管中先抽取1-1. 5ml枸櫞酸鈉抗凝液,再抽取骨髓與枸櫞酸鈉抗凝液合計(jì)為5ml,依次方法采集,收集采集的骨髓注入無菌瓶中,得到骨髓血預(yù)處理樣品;臍帶血的采集在產(chǎn)婦胎盤脫落后,使用單包含枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋,將其采血袋上的針頭插入臍靜脈中,一邊采集一邊輕輕晃動(dòng)采血袋,使抗凝液與臍帶血充分結(jié)合,得到臍帶血預(yù)處理樣品;外周血采集對(duì)被采血者手臂進(jìn)行消毒,使用含有枸櫞酸鈉抗凝液的采血袋,將采血袋上的針頭插入手臂靜脈采集過程中慢慢搖動(dòng)采血袋,使抗凝液與外周血充分結(jié)合,得到外周血預(yù)處理樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離干細(xì)胞的方法,其特征在于(1)在所述步驟(I)中,經(jīng)采集、抗凝后的骨髓血、臍帶血或外周血預(yù)處理樣品與I號(hào)液的體積比為I : 1,得到稀釋樣品;(2)在所述的步驟(2)中,稀釋樣品與2號(hào)液的體積比為2 1,再經(jīng)過搖勻1-8分鐘, 放置3分鐘-3小時(shí),待分層后吸取上層細(xì)胞液,分裝至50ml離心管中,以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-20分鐘,搜集下層細(xì)胞液,得到濃縮樣品;(3)將步驟(2)得到濃縮樣品用生理鹽水稀釋后鋪在3號(hào)液上,以500-4000轉(zhuǎn)/分鐘離心1-60分鐘,收集存在于整個(gè)離心管中間位置的約2-4_厚的油狀干細(xì)胞層;(4)將收集的干細(xì)胞層用生理鹽水清洗1-5次,再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積即可。
全文摘要
本發(fā)明為一種人類骨髓、臍帶血或外周血中干細(xì)胞樣本密度分離液及干細(xì)胞分離方法。所述試劑由1號(hào)液、2號(hào)液和3號(hào)液組成。本發(fā)明在1號(hào)液中加入了腦蛋白水解物,有效提高了處理樣品的干細(xì)胞回收數(shù)量。使用本發(fā)明的干細(xì)胞樣本密度分離液,目標(biāo)干細(xì)胞分離回收率提高了約20~30%,可以有效節(jié)約人類骨髓、臍帶血或外周血樣品,在保持高存活率的基礎(chǔ)上,大大地提高了干細(xì)胞的分離數(shù)量和回收率使用效率,在應(yīng)用干細(xì)胞臨床治療中是一個(gè)前所未有的突破。
文檔編號(hào)C12N5/0789GK102604892SQ20121001798
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者唐明淇 申請(qǐng)人:唐明淇