專利名稱：一種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及使用熒光定量PCR技術檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒。
背景技術：
單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,簡稱Lm)是一種人畜共患食源性致病菌，可使人畜患腦膜炎、心肌炎、敗血癥、早產等疾病，危害較大。李斯特氏菌亦是食源性四大病原菌之一，在環境中無處不在，在絕大多數食品中都能找到李斯特氏菌。肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等都已被證實是李斯特氏菌的感染源，這使得食品在儲運加工過程中容易被Lm污染。該菌在4°C環境下仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此,在食品衛生微生物檢驗中必須加以重視。李斯特氏菌中毒嚴重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經采取措施來控制食品中的李斯特氏菌，并制定了相應的標準。其中，單核細胞增生李斯特氏菌是唯一能引起人類疾病的。Lm的致病性與多種毒力因子有關，包括李斯特氏菌溶血素(KListeriolysin0，簡稱LL0)、內化素、磷脂酶C、ActA蛋白等，由hly基因(GenBank:HM589598.1)編碼的LLO是該菌侵染力的重要組成成分，是Lm的主要毒力因子。因此，針對Lm DNA中的hly基因提供一種簡便、快速、靈敏、特異性高的檢測方法成為目前食品衛生微生物檢驗的迫切需要
發明內容
本發明的一個目的在于提供一種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，該方法利用針對單核細胞增生李斯特氏菌的毒力相關基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌。該方法能夠快速、簡便、敏感、特異地檢測食品中的單核細胞增生李斯特氏菌的存在。本發明利用熒光定量PCR技術，針對李斯特氏菌屬特異性毒力相關基因(hly基因)設計引物和Taqman突光探針。hly 基因上游引物序列:5’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)hly 基因下游引物序列:5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’ (SEQ ID NO:2)Taqman 熒光探針:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。對探針進行5’端FAM標記。反應條件為:95°C 5分鐘；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個循環。本發明的另一個目的在于提供一種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:針對單核細胞增生李斯特氏菌的毒力相關基因hly基因的特異性引物和Taqman熒光探針，其中，hly基因上游引物序列:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1) ;hly 基因下游引物序列:5，-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ (SEQ ID NO:2) ；Taqman 熒光探針:5’ -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。
本發明的試劑盒中，優選地，進一步包括聚合酶及反應緩沖液，優選地，所述聚合酶為Taq酶。優選地，使用本發明的試劑盒進行檢測的反應條件為:95°C 5分鐘；95°C 15秒、60 0C 45秒、(收集熒光)，共40個循環。本發明的優點和效果如下:(1)敏感:熒光PCR檢測技術是綜合了 PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數碼顯像技術為一體的技術，因此它的檢測靈敏度很高。(2)特異:使用特異性引物和探針雙重對靶分子進行識別，特異性好、準確性高、假陽性低。(3)簡便安全:操作簡單、安全、自動化程度高、防污染。擴增和檢測可以在同一管內檢測，不需要開蓋，不易污染。(4)快速:速度快、高通量，可在2內小時完成。
圖1為顯示Lm陽性的擴增曲線的圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例實施例1.引物和探針設計l)hly基因引物設計設計可擴增一段80_120bp片段的引物，相關參數為:Tm值55.(TC -60.0°C，GC值40.0% -60.0%，引物大小20±3bp。所設計的引物序列如下:上游引物:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物:5’-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3，(SEQ ID NO:2)3)探針設計在引物擴增片段內設計探針，相關參數為:Tm值68.0 °C -70.0 °C，GC值40.0% -70.0%，對探針進行5’端FAM標記，其序列如下:探針:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)上述引物和探針均由上海生工合成。實施例2.Lm菌的熒光定量PCR檢測方法Lm標準菌株(中國藥品生物制品檢定研究所)經LB培養基培養過夜后采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)按照說明書的步驟提取DNA。具體過程為PCR儀上將30 μ I包括下表中組分的反應體系(其中樣本基因組DNA是從Lm標準菌株中提取的基因組DNA)進行PCR反應。
權利要求
1.一種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，該方法利用針對單核細胞增生李斯特氏菌的毒力相關基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針來特異性檢測單核細胞增生李斯特氏菌，其中，所述hIy基因的上游引物序列為5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’;所述hIy基因的下游引物序列為5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’;所述Taqman熒光探針的序列為5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
2.如權利要求1所述的方法，其中，反應條件為95°C5分鐘；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個循環。
3.—種檢測單核細胞增生李斯特氏菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:針對單核細胞增生李斯特氏菌的毒力相關基因hly的特異性引物和Taqman熒光探針，其中，所述hly基因的上游引物序列為5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’ ；所述hly基因的下游引物序列為5 ’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ ；所述Taqman熒光探針的序列為5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其中，使用所述試劑盒進行反應的條件為95°C5分鐘；950C 15秒、60°C 45秒、(收集熒光)，共40個循環。
5.如權利要求3所述的試劑盒，其進一步包括聚合酶及反應緩沖液。
6.如權利要求5所 述的試劑盒，其中，所述聚合酶為Taq酶。
全文摘要
本發明提供了一種一步檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法和試劑盒，該方法利用熒光定量PCR技術，對Lm菌的毒力相關基因hly進行特異性擴增，從而進行是否污染了Lm的檢測。該方法能快速、簡便、特異地檢測單核細胞增生李斯特氏菌的存在。
文檔編號C12R1/01GK103215344SQ201210017868
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者賈斌, 姜君, 陳唯軍, 馮華華, 劉利成, 吳偉立 申請人:北京世紀盈和科技發展有限公司, 北京華大基因研究中心有限公司