專利名稱：一種高正變率菌種選育方法
技術領域：
本發明屬于工業微生物領域，具體涉及一種消除中間產物代謝積累的高正變率菌種選育方法。
背景技術：
生物醫藥、生物化工的科研與工業生產，菌種選育是提高產物水平或產量最常用、 最有效的方法之一，優良的高產菌種是發酵生產的關鍵。目前，菌種選育普遍采用的方法有隨機篩選、推理選育、原生質體融合、基因工程技術等，傳統的隨機篩選費時、正變率極低， 已不多用；基因工程技術適合于生物合成途徑簡單的小分子產物的菌種改良；對于合成途徑復雜的次級代謝產物的菌種改良，多采用方向性比較強、正變率較高的推理選育，這也是目前工業微生物改造最有效、使用最多的一種方法。推理選育通常選擇生物合成途徑的兩端起始點(前體)和終點(目的產物)篩選抗性突變株，而微生物合成的中間反應少則幾十步，多則數千步反應，真正存在問題(如代謝抑制造成中間產物積累)的限制性步驟很難找到，因而常被忽視。
發明內容
本發明的目的是通過找到并制備積累量多的途徑中間產物，篩選其抗性/忍耐突變株，消除生物合成途徑中限制性步驟的代謝抑制和阻塞，建立一種方向性、目的性非常強的選育高產菌株的方法。本發明的技術方案概述如下
一種高正變率菌種選育方法，其特征在于包括如下步驟
(1)代謝產物的檢測分析出發菌株經發酵培養，培養物經分離去除營養物質，然后通過LC/MS檢測分析，找出積累量最多的途徑中間產物，并進行初步結構分析和確證；
(2)途徑中間產物的分離制備通過色譜制備柱分離菌株的代謝產物，制備積累量最多的途徑中間產物；
(3)確定最低抑菌濃度考查確定步驟(2)中制備得到的途徑中間產物對于所述出發菌株的最低抑菌濃度；
(4)篩選將出發菌株經誘變劑誘變處理后，涂布于含有最低抑菌濃度途徑中間產物的選擇性平板，適宜溫度下培養1-15天，挑選上述平板上生長的菌落，接種于固體斜面培養基，上述適宜溫度下培養至菌落成熟，轉接至搖瓶發酵培養基，上述適宜溫度下搖瓶培養至發酵終點，測定產物含量，發酵水平最高的菌株，進行保藏備用；
所述適宜溫度和所述培養基根據出發菌株確定。所述的出發菌株為細菌、真菌或放線菌。所述途徑中間產物為目的產物生物合成途徑中的中間步驟產物，其結構的分析和確證，結合生物合成途徑以及目的產物的一、二級質譜圖進行。
步驟(2)中所述途徑中間產物的制備量以滿足步驟(4)中篩選平板用量為準。步驟(3)中所述誘變劑為單一物理或化學誘變劑、或兩種以上的復合誘變劑，誘變劑的選擇以復合誘變的突變譜廣為佳；誘變劑劑量以使菌株致死率達到20-99%為準。所述誘變劑劑量優選為使菌株致死率達到70-90%。步驟(3)中若途徑中間產物在5% (w/w)以上相對較高濃度下對出發菌株沒有抑菌性，則選擇一個1-5% (w/w)的較高濃度，在所述較高濃度下進行步驟(4)篩選出發菌株的忍耐突變株。步驟(4)所得菌株循環重復所述步驟(I)、(2)、(3)、(4)，降低不同途徑中間產物的積累，提高菌株合成產物的能力。本發明的優點是
本發明在推理選育的基礎上更進一步，重點關注代謝途徑過程中的復雜反應，找出發生積累的限制性步驟，某一中間產物若有積累，說明這一步存在代謝抑制，對應的酶活性或酶量不夠。本發明將通過篩選MIC濃度下的積累中間產物的抗性/忍耐突變株，只有消除了中間產物的積累和代謝抑制作用，消除了關鍵步驟酶抑制的有效突變株才能生長，將其篩選出來，消除了中間產物的積累，更多地流向目的產物，從而篩選到高產突變株。采用本發明的方法進行菌種選育，直接找到并消除代謝途徑中關鍵步驟的代謝抑制，消除中間產物的積累，更多地流向目的產物，目的性、方向性非常強，正向突變率最高可達80-90%，提高幅度可達到20-100%，甚至更高。本發明公開的篩選方法，過程不復雜，可以大幅提高菌種篩選效率，適合原始菌株選育，也適合于工業上的生產菌株選育；適合生物合成途徑簡單的菌種改良，更適合于生物合成途徑復雜的菌種改良。
圖I為利迪鏈霉菌培養液全掃描的ESI - MS譜。圖2為途徑中間產物Str印tolol的LC/MS/MS譜及結構。圖3為消除Streptolol的積累可增加利迪鏈菌素的生物合成示意圖。圖4為消除途徑中間產物Dihydromonacolin的積累可增加桔青霉的生物合成示意圖。圖5為消除中間產物霉菌酸的積累可增加毒三素鏈霉菌合成利普司他汀 (Iipstatin)的能力示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。實施例I
消除途徑中間產物(Streptolol)的積累選育利迪鏈霉菌(5 Iydicus)
出發菌株利迪鏈霉菌AS4. 2501-P28 (天津大學化工學院提供)，其固體斜面培養基(g/ L)組成為淀粉20，葡萄糖5，蛋白胨2，Mg2SO4 ·7Η20 O. 5，NaCl O. 5，玉米漿2，瓊脂20， PH自然。發酵培養基(g/L)為淀粉40，葡萄糖5，蛋白胨2，K2HPO4 I. 0，Mg2SO4 · 7H20 O. 5，NaCl O. 5，pH 6.5。固體斜面接種后于28 °C培養10天，培養好的斜面菌種接種于裝有30 ml發酵培養液的250 ml三角瓶中，220 rpm、28 °C回轉式搖床發酵培養96 h，取20 ml發酵液，加20 ml乙酸乙酯萃取，有機相真空濃縮至干，殘留用甲醇4 ml溶解，作LC/MS 測定，如圖1，最大的離子峰599 [Μ-ΗΓ是目的產物利迪鏈菌素，積累較多的中間產物為m/z 363 [Μ - H]—，其LC/MS/MS譜如圖2，解譜分析其結構，確證為利迪鏈菌素分子結構的Streptolol部分。對此關鍵途徑中間產物Streptolol進行提取,制備2g,平板考查， 其對于出發菌株的最小抑菌濃度(MIC)為O. 16%。試驗選擇誘變條件為UV紫外線照射20 秒(89%致死率)。篩選出發菌株UV照射15秒后，涂布于O. 16%最小抑菌濃度的Str印tolol選擇性平板，28 °C培養10-15天，篩選Str印tolol的抗性突變株。挑選30個菌落傳接斜面，同時接種一個出發菌株作為對照，28 °C培養10天，斜面成熟后，接種搖瓶，28 °C搖床發酵培養96 h，培養液進行HPLC測定產物濃度，結果22株比對照高，正向突變率73. 3%，最高的一株比對照提高56. 1%。實施例2
O. OOlM HNO2溶液誘變處理8min (25%致死率)，替代實施例I中的UV照射20秒，其它同實施例1，得到結果18株比對照高，正向突變率60. 0%，最高一株的產物濃度比對照提高 45%。實施例3
誘變條件UV照射15秒(80%致死率)、0. OOlM HNO2溶液復合誘變處理5min，替代實施例I中的UV照射20秒，其它同實施例1，得到結果26株比對照高，正向突變率86. 7%，最高一株的產物濃度比對照提高106%。實施例4
消除途徑中間產物Dihydromonacolin的積累篩選美伐他汀的高產菌株桔青霉0°. citrinum)
出發菌株為美伐他汀的生產菌株桔青霉ci trinum) W- (麗珠集團新北江制藥提供)，斜面孢子培養基是土豆瓊脂培養基，發酵培養基(g/L)為葡萄糖60，甘油 40，玉米漿30，黃豆餅粉10，(NH4)2SO4 1.0，pH 7.0。斜面接種后于23 °C培養14天，將斜面孢子接種于含有滅菌發酵培養基的三角瓶，23 °C搖床發酵培養240 h，取20 ml發酵液， 離心收集菌體5g，加100 ml乙酸丁酯攪拌萃取，過濾棄菌渣，有機相真空濃縮至干，殘留用甲醇10 ml溶解，作LC/MS測定。積累較多的中間產物為318，通過其質譜碎片離子，并結合已知的美伐他汀生物合成途徑，確證為途徑中間產物Dihydromonacolin (圖4)。取2000 ml發酵液，離心收集菌體約lOOOg，加8000 ml乙酸丁酯攪拌萃取，過濾棄菌渣，酯相真空濃縮至干，甲醇2000 ml溶解，經制備柱分離，收集含途徑中間產物 Dihydromonacolin的懼分,真空濃縮至干,得3. 2g。平板考查,此途徑中間產物對于出發菌株的最小抑菌濃度(MIC)為O. 27%。試驗選擇誘變條件為紫外照射40秒，LiCl作用濃度
O.3%,(復合誘變致死率83%)。篩選出發菌株桔青霉MV-7紫外照射40秒后，涂布于最小抑菌濃度O. 27%的 Dihydromonacolin、0. 3%LiCl的選擇性平板,23°C培養10-15天,挑選50個菌落傳接斜面， 同時接種一個出發菌株作為對照，23 °C培養14天，斜面成熟后，分別接種搖瓶，23 °C搖床發酵培養216h，培養液分別進行HPLC測定美伐他汀，結果39株比對照高，正向突變率78%，最聞的一株比對照提聞29%ο實施例5
0.9倍MIC=O. 24%替代實施例3中的MIC O. 27%，其它同實施例3，得到結果正向突變率 90%，最高的一株比出發菌株提高33%。實施例6
1.5倍MIC=O. 405%替代實施例3中的MIC O. 27%，其它同實施例3，得到結果正向突變率56%，最高的一株比出發菌株提高21%。實施例7
消除中間產物霉菌酸的代謝積累篩選高產毒三素鏈霉菌(5 toxytricini)
出發菌株為利普司他汀的生產菌株毒三素鏈霉菌LP-19 (鄭州佰開生物工程公司提供)，固體斜面培養基(g/L)組成為淀粉5，葡萄糖5，酵母提取粉5，干酪素5，ZnSO4WH2O O. 5，FeSO4 O. 5，瓊脂粉20，pH7. O ;發酵培養基(g/L)為麩質粉10，低溫黃豆餅粉28，甘油16，葵花油50，麥芽糊精5，卵磷脂25，ZnSO4WH2O O. LCaCO3 4.0，抗氧化劑5，pH 6.6。 固體斜面接種后于28 °C培養8天，二環接種于含有滅菌發酵培養基的三角瓶，28 °C搖床發酵培養168 h，取20 ml發酵液，離心收集菌體5g，加100 ml乙醇攪拌I小時萃取，過濾棄菌渣，有機相真空濃縮至干，殘留用甲醇10 ml溶解，作LC/MS測定。積累較多的中間產物分子量為334，通過其質譜碎片離子，并結合已知的奧利司他生物合成途徑(圖5)，確證為途徑中間產物霉菌酸。取1500 ml發酵液，離心收集菌體約lOOOg，加2000 ml丙酮攪拌I小時，過濾棄菌渣，1000 ml正庚烷萃取，正庚烷相真空濃縮至干，加甲醇600 ml溶解，經C18反相制備柱分離，收集霉菌酸的餾分，真空濃縮至干，得3. Sg。平板考查，霉菌酸對于毒三素鏈霉菌沒有抑菌性，因而選擇一個較高濃度3. 0%。試驗選擇誘變條件為紫外照射60秒(致死率85%)。篩選出發菌株毒三素鏈霉菌LP-19紫外照射20s后，涂布于3. 0%濃度的霉菌酸選擇性平板，28°C培養6-9天，篩選霉菌酸的忍耐突變株。挑選50個菌落傳接斜面，同時接種一個出發菌株作為對照，28 °C培養8天，斜面成熟后，分別接種搖瓶，28°C搖床發酵培養 168h，培養液分別進行HPLC測定利普司他汀，結果36株比對照高，正向突變率72%，最高的一株比對照提高23%。實施例8
5. 0%濃度的霉菌酸替代實施例6中的3. 0%濃度的霉菌酸加入選擇性平板，其它同實施例6，得到結果正向突變率81%，最高的一株比出發菌株提高27%。實施例9
I.0%濃度的霉菌酸替代實施例6中的3. 0%濃度的霉菌酸加入選擇性平板，其它同實施例6，得到結果正向突變58%，最高的一株比出發菌株提高21%。
權利要求
1.一種高正變率菌種選育方法，其特征在于包括如下步驟(1)代謝產物的檢測分析出發菌株經發酵培養，培養物經分離去除營養物質，然后通過LC/MS檢測分析，找出積累量最多的途徑中間產物，并進行初步結構分析和確證；(2)途徑中間產物的分離制備通過色譜制備柱分離菌株的代謝產物，制備積累量最多的途徑中間產物；(3)確定最低抑菌濃度考查確定步驟(2)中制備得到的途徑中間產物對于所述出發菌株的最低抑菌濃度；(4)篩選將出發菌株里誘變劑進行誘變處理后，涂布于含有最低抑菌濃度途徑中間產物的選擇性平板，適宜溫度下培養1-15天，挑選上述選擇性平板上生長的菌落，接種于固體斜面培養基，上述適宜溫度下培養至菌落成熟，轉接至搖瓶發酵培養基，上述適宜溫度下搖瓶培養至發酵終點，測定產物含量，發酵水平最高的菌株，進行保藏備用；所述適宜溫度和所述培養基根據出發菌株確定。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的出發菌株為細菌、真菌或放線菌。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述途徑中間產物為目的產物生物合成途徑中的中間步驟產物，其結構的分析和確證，結合生物合成途徑以及目的產物的一、二級質譜圖進行。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述途徑中間產物的制備量以滿足步驟(4)中篩選平板用量為準。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述誘變劑為單一物理誘變劑、 單一化學誘變劑或兩種以上的復合誘變劑；誘變劑劑量以使菌株致死率達到20-99%為準。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述誘變劑劑量為使菌株致死率達到 70-90%ο
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中若途徑中間產物在5%(w/w)以上相對較高濃度下對出發菌株沒有抑菌性，則選擇一個1-5% (w/w)的途徑中間產物較高濃度，篩選所述較高濃度下出發菌株的忍耐突變株。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(4)所得菌株循環重復所述步驟(I)、(2)、(3)、(4)，降低不同途徑中間產物的積累，提高菌株合成產物的能力。
全文摘要
本發明公開了一種消除中間產物代謝積累的高效菌種選育方法，步驟為(1)LC/MS(液相/質譜聯用)分析檢測出發菌株的代謝產物，找到積累最多的途徑中間產物，確定代謝途徑中關鍵步驟的代謝抑制點；(2)通過色譜制備柱分離菌株的培養物，提取積累最多的途徑中間產物；(3)對步驟(2)獲得的途徑中間產物，篩選其抗性/忍耐突變株，通過消除代謝途徑中關鍵步驟的代謝抑制，消除中間產物的積累，更多地流向目的產物，從而篩選到高產菌株。本發明公開的菌種選育方法，從復雜的生物合成途徑中找到關鍵步驟，消除其中間產物的代謝抑制和積累，從而提高菌株的合成能力，大大提高了篩選效率，具有方向性強、高正變率、提高幅度大、方法簡單等優點，適合于所有微生物的選育，尤其適合于生物合成途徑復雜的次級代謝產物的菌種選育。
文檔編號C12R1/80GK102586222SQ201210015119
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者姚清國, 李小兵, 李海龍, 段書德 申請人:石家莊學院