專利名稱：一種植物雙元表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物雙元表達載體。
背景技術：
植物表達載體是在植物進行轉基因過程中，將外源基因導入植物細胞并整合于植物染色體上的DNA介質。在植物基因工程上應用最廣泛的是雙元表達載體，含有根癌農桿菌來源的T-DNA序列，可實現外源基因與植物染色體的整合。目前，已有一系列的植物表達載體得到應用，如pCambia系列載體。這些雙兀表達載體一般含有標記基因、報告基因和多克隆位點。但所使用的報告基因大多為GUS。相對GUS而言，報告基因GFP的檢測比較簡便，只需熒光顯微鏡或激發光源，無需反應底物或其它輔助因子材料；GFP檢測時無需前處理，可進行活體觀察。植物表達載體上常用的標記基因為新霉素磷酸轉移酶(neomycin phosphotransfe-rase, NPT II)基因、鏈霉素憐酸轉移酶(streptomycinphosphotransferase, SPT)基因、潮霉素憐酸轉移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因和抗除草劑基因等。相對而言，卡那霉素抗性的NPTII基因使用卡那霉素進行篩選，是相對比較安全的一種標記基因。RNA干涉技術(RNA interference, RNAi)是近年來發展起來的一種特異基因阻斷技術，是將雙鏈RNA (double strained RNA, dsRNA)導入細胞內引起特異靶基因mRNA降解的一種細胞反應過程，它是一種轉錄后的基因沉默(PTGS)現象。在植物中，觸發RNAi的主要方法是構建可轉錄 為發卡RNA(hairpin RNA, hpRNA)的植物表達載體轉化植物來產生RNAi，因此構建高效的RNAi表達載體是利用轉基因RNAi的關鍵。研究表明:在啟動子下游插入反向重復片段的重組雙元載體，是產生RNAi的基本結構。而用含內含子的發夾RNA(intron-contain-1ng hairpin RNA, ihpRNA)結構表達dsRNA 的植物,其沉默效率更高。通過構建及優化各種RNAi載體，可大大方便植物的RNA干涉研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種植物雙元表達載體。本發明提供的植物雙元表達載體，是按照如下方法得到:在出發載體PBI121中構建熒光蛋白報告基因表達盒和外源基因表達盒；所述外源基因表達盒由啟動子、內含子和終止子依次連接而成，所述啟動子與所述內含子之間具有若干個酶切位點，所述內含子與所述終止子之間具有若干個酶切位點；構建得到的植物雙元表達載體中其它位置的酶切位點與所述內含子兩側的酶切位點均不相同。上述植物雙元表達載體中，所述啟動子與所述內含子間的若干個酶切位點為:XbaKAge I,Kpn 1.Avr II和BamH I，所述內含子與所述終止子之間的若干個酶切位點為:EcoR 1、Sac 1、Sal I 和 SnaB I。上述任一所述植物雙元表達載體中，所述外源基因表達盒的核苷酸序列如序列4所示。
上述任一所述植物雙兀表達載體中，所述構建突光蛋白報告基因的表達盒的方法為用熒光蛋白報告基因替換所述出發載體PBI121中的GUS基因表達盒中的GUS基因，得到所述熒光蛋白報告基因的表達盒。上述任一所述植物雙元表達載體中，所述熒光蛋白報告基因的為EGFP報告基因。上述任一所述植物雙元表達載體中，所述外源基因表達盒的表達方向與所述熒光蛋白報告基因的表達盒的表達方向相反。上述任一所述植物雙元表達載體在將目的基因導入出發植物中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述任一所述植物雙元表達載體在使出發植物中的目的基因功能喪失中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述任一所述應用中，所述使出發植物中的目的基因功能喪失是通過RNA干擾實現的。上述任一所述應用中，所述出發植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草或棉花；所述單子葉植物具體為洋蔥。本發明所構建的植物雙元表達載體可用于植物轉基因過表達研究和RNAi研究，可以將所述載體上TUB intron基因替換成目的基因，改造成含目的基因的植物表達載體，也可以在TUB intron基因片段兩側的多克隆位點上分別加上目的基因片段的正反向片段，改造成目的RNAi載體。所 述植物雙元表達載體具有GFP報告基因，可以方便的進行轉基因植株的檢測；所述植物雙元表達載體具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因較為安全，可以高效的進行篩選和生產的應用。
圖1是載體pCRI1210的酶切位點驗證結果示意圖。圖2是載體pCRI1210的圖譜示意圖。圖3是質粒載體pCRI1210和pBI121雙酶切結果示意圖。圖4是GUS基因的特異性檢測引物進行PCR檢測擴增的結果示意圖。圖5是⑶S基因的雙酶切檢測結果示意圖。圖6是載體在洋蔥表皮中的瞬時表達檢測報告基因GFP表達的結果示意圖。圖7是載體的在棉花愈傷組織中的瞬時表達檢測GUS表達的結果示意圖。圖8是轉化V煙早幼牙⑶S染色結果不思圖。圖9是轉化煙草葉片⑶S染色結果示意圖。圖10是轉化煙草根部⑶S染色結果示意圖。圖11是用轉化棉花愈傷組織檢測報告基因EGFP的表達結果示意圖。圖12是轉化煙草⑶S基因組DNA特異性檢測引物PCR檢測結果示意圖。圖13是轉化和非轉化煙草幼苗生長狀態對比圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、構建雙元表達載體pCRI1210一、構建干涉表達框以含有CaMV 35S啟動子的pBI121載體(GenBank:AF485783.1)為模板，分別用引物35S1/35S2和35S1/35S3通過兩次PCR擴增獲得了兩端添加了酶切位點的CaMV35S啟動子片段(其核苷酸序列如序列表中序列I所示，5'端添加的酶切位點為Hind II1、SmaI和XmaI, 3;端添加的酶切位點為BglII,KpnI,XbaI和XhoI)，并連接到pMD19_T simple載體(該載體購自大連TAKARA公司，產品目錄號為:D104A)上，得到中間載體pMD19T_35S。引物序列如下:35S1:5，-AAgCTTCCCgggTATTggCTAgAgCAgCTT_3，，35S2:5， -TACCggTgATCTAgAAgCTCgAgAgAgATAgAT-3，，35S3:5， -CCgAgATCTATAggTACCTgACCggTgATCTAgAAgC-3，。以含有Ca MV 35SpolyA終止子的pCADS1341載體為模板，用引物35SpolyAl/35SpolyA2和35SpolyAl/35SpolyA3通過兩次PCR擴增獲得了兩端添加了酶切位點的CaMV 35SpolyA終止子(其核苷酸序列如序列表中序列2所示，5^端添加的酶切位點為Sac1.Sal I和SnaBI, 3;端添加的酶切位點為BglII)并連接到pMD19-Tsimple載體上,得到中間載體pMD19T-polyA。引物序列如下:35SpolyAl:5，-TTgCTAgATCTCCgTACTgAATTAACgCCgAAT-3，，35SpolyA2:5， -gTCgACTCTACgTATCTgTCgATCgACAAgCT-3，，35SpolyA3:5， -ATgAgCTCTCTTgTCgACTCTACgTATCTgT-3，。從陸地棉的基因組DNA中用引物AF1/AF3通過PCR擴增得到TUB intron內含子片段，用引物AF2/AF4通過PCR擴增在TUB intron片段兩端添加酶切位點(其核苷酸序列如序列表中序列3所示，5'端添加的酶切位點為Kpnl、AvrII和BamHI，3'端添加的酶切位點為 Bglll、SacI 和 EcoRI)，T/A 克隆到 pMD19_T simple 中，得到中間載體 pMD19T_AF。引物序列如下:AFl:5’ -CCTAggTATggATCCACTCCAAgTTgTAAgTAT-3’ 和AF3:5， -gAgCTCACTgAATTCTgAACATCAAACATTACA_3，；AF2:5， -TAggTACCAATTACCTAggTTATggATCCACT-3’ 和AF4:5，-AgATCTTgAgAgCTCACTgAATTCTgAACAT_3，。Kpn Ι/BglII分別雙酶切上述中間載體pMD19T-35S和pMD19T-AF，分別回收3.5kb和590bp的片段，連接后得到的中間載體再進行Sac Ι/BglII雙酶切，回收4.1kb片段，所回收的片段與Sac Ι/BglII雙酶切載體pMD19T-polyA得到的240bp的片段進行連接，得到含有干涉表達框的中間載體PMD19T-35SAP。將載體pMD19T_35SAP進行測序驗證，結果在PMD19-T的HindIII和BglII酶切位點間含有干涉表達框，干涉表達框結構如下:自上游至下游依次為:CaMV 35S啟動子(序列表中序列I)、TUB intron內含子(序列表中序列3)和CaMV 35SpolyA終止子(序列表中序列2)，并在TUB intron內含子兩端含有多克隆位點，在 TUB intron 的 5’ 端具有 5 個酶切位點:Xba I, Age I, Kpn I, Avr 11, BanH I，在 3’端具有 4 個酶切位點:EcoR 1、Sac 1、Sal 1、SnaB I。二、修飾 pBI121 載體用Sac !/BamH I雙酶切pBI 121載體，得到的載體片段與報告基因EGFP (GenBank:AF323988.1，其序列見序列表中的序列5)連接，得到pBI121_EGFP表達載體。pBI121_EGFP載體用EcoR I單酶切，進行平末端化后連接，去除載體上的EcoR I酶切位點。用與去除EcoR I酶切位點同樣的方法，分別去除PBI121-EGFP載體上的Sac 1.BamH I和Xba I酶切位點，得到中間載體PBI121-GFPQ。EcoR 1、Sac 1、BamH I和Xba I酶切位點位于pBI121載體中GUS基因的兩側。驗證:通過Sac I/BamH I雙酶切pBI121_EGFP表達載體，瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠得到大約720bp的條帶，說明EGFP已經正確連接到pBI121-EGFP表達載體中。采用Sac Ι/BglII雙酶切質粒，以未去除酶切位點前的質粒做對照來驗證pBI121上相應酶切位點的去除效果。由于PBI121載體上有2個Bgl II酶切位點，而所去除的4個酶切位點均位于這2個Bgl II位點之間。如果酶切位點被去除后，雙酶切只能切開2個Bgl II位點，得到5.6k和8.0k的兩個條帶。如果酶切位點沒有去除，則會切開3條帶。根據驗證結果，EcoR 1、Sac 1.BamH I和Xba I四個酶切位點均已去除。三、構建pCRI1210載體用HindIII單酶切載體pBI121_GFPQ，回收載體片段，進行平末端化反應和去磷酸化反應；用HindIII/BglII雙酶切載體pMD19T_35SAP，回收1.7kb片段，進行平末端化反應后，與上述單酶切載體PBI121-GFPQ后回收的載體片段進行連接，得到雙元載體pCRI 1210(圖2)。利用載體pCRI1210兩側的多克隆位點進行酶切驗證和測序驗證。酶切組合為A:Avr II/EcoR I ；B:Age I/EcoR I ；C:Kpn I/Sal I ；D:Xba I/SacI ；E =SnaB I/BamH I，酶切效果見圖1(圖1 A^dtASAvr II/EcoR I的酶切驗證結果，B為Age I/EcoR I酶切驗證 結果，C Kpn I/Sal I酶切驗證結果，D Xba I/Sac酶切驗證結果，E SnaB I/BamH I酶切驗證結果)，每一對酶切組合均得到了 550bp的酶切片段，表明構建的載體中只在內含子左右具有以上多克隆酶切位點外，其余位置沒有以上多克隆酶切位點，說明該載體得到了正確的連接，其上的多克隆位點也是可用的。并送測序公司，結果干涉表達框的序列為序列4所示，進一步驗證該表達載體正確。實施例2、植物雙元表達載體的功能驗證一、表達載體pCRI1210-GUS的構建用BamHI/SacI雙酶切質粒pBI121中的⑶S基因片段和質粒pCRI1210中的TUBintron部分，酶切產物進行電泳，電泳結果如圖3所示(圖3:1號泳道為MakerIII，2號泳道為質粒PBI121的BamHI/SacI雙酶切圖譜，3號泳道為質粒pCRI1210的BamHI/SacI雙酶切圖譜。)，分別在約1.9kb和15kb處出現了擴增條帶。將回收到的1.9kb和15kb的兩部分DNA片段連接起來，得到含有GUS和GFP基因的載體pCRI 1210-GUS。其中，該載體的抗性篩選基因為卡那霉素抗性基因。將連接產物pCRI 1210-GUS加入到裝有剛剛融化的大腸桿菌DH5a感受態細胞(購自Tiangen公司)的離心管中，輕彈混勻，冰浴30分鐘；將該離心管置于42°C水浴鍋中熱激90秒，取出后立即冰浴2-3分鐘，期間不要晃動離心管；向離心管中加入250-500ul不含卡那霉素的LB液體培養基，150rpm, 37°C震蕩培養45分鐘；將離心管中的菌液混勻，吸取IOOul菌液加入到含有卡那霉素的LB固體培養基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將菌液涂開，待平板表面干燥后，倒置平板；37°C培養12-16小時后，挑取單菌落于含卡那霉素的LB液體培養基中，搖菌約12小時；同時，設計未轉化的大腸桿菌(空白對照)和轉化pBI121載體的大腸桿菌(陽性對照);利用TIANprep Mini Plasmid Kit(購自Tiangen公司)提取質粒，用GUS基因的特異性檢測引物對提取的質粒進行PCR檢測，特異性GUS引物序列為:上游引物⑶SFl:5’ -CTACACCACGCCGAACACCT-3，和下游引物⑶SRl:5，-CACGCTTGGGTGGTTTTTGTC-3，。PCR檢測結果顯示，轉化pCRI1210-GUS載體的大腸桿菌I號和2號單克隆與轉化PBI121載體的大腸桿菌(陽性對照)在690bp處出現了擴增條帶(圖4:1號泳道為MakerIII, 2號泳道為未轉化的大腸桿菌(空白對照)，3號泳道為I號單克隆，4號泳道為2號單克隆，5號泳道為轉化pBI 121載體的大腸桿菌(陽性對照)，表明目的基因GUS已成功構建到載體PCRI1210中。同時，對提取的質粒進行酶切檢測，用BamHI/SacI雙酶切提取的質粒，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示I號和2號單克隆在1.9kb處出現了擴增條帶(圖5:1號泳道為Makerlll，2號泳道為I號單克隆，3號泳道為2號單克隆)，表明gus基因已經連接到PCRI1210-GUS載體上。檢測后再送交測序公司，，確定陽性單克隆，所保存的對應菌落即為目的轉化子。二、表達載體pCRI1210-GUS的功能驗證(一)表達載體的瞬時表達分析(I)將上述步驟一得到的陽性單克隆的菌液，利用TIANprep Mini Plasmid Kit提取 pCRI 1210-GUS 質粒。(2)基因槍轟擊轉化利用基因槍轉化法將PCRI1210-GUS質粒導入棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮中。棉花胚性愈傷組織在轉化 前28°C高滲預培養4h(添加0.6mol.Γ1甘露醇和0.6mol.Γ1山梨醇)，采用Bio-RadPDS 1000/He基因槍進行轟擊，可裂膜壓力為1.1kPa0將基因槍轟擊后的棉花胚性愈傷組織在MS培養基上37°C暗培養48h后進行GUS染色；洋蔥表皮在MS培養基上28.(TC弱光下培養24h后熒光顯微觀察。結果如圖6所示(圖6:A為轟擊了載體pCRI1210-GUS質粒的洋蔥表皮熒光顯微成像圖片，B為轟擊了載體pBI121_GUS質粒的洋蔥表皮熒光顯微圖片，a為A圖視野的相應白光視野圖片，b為B圖視野的相應白光視野圖片)，從結果可知，報告基因EGFP在載體pCRI1210-GUS中得到較強的表達，證明表達載體中的EGFP報告基因能有較好的表達效果。同時以轉化PCRI1210的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空載體對照，以未經轉化的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空白對照。結果:空載體對照未見綠色熒光蛋白；空白對照中未見綠色熒光蛋白。(3)愈傷組織的⑶S染色⑶S染色程序為:將愈傷組織浸泡于⑶S染色液(0.1mol磷酸鈉緩沖液，pH 7.0 ；Ig.171 X-Gluc ;2% DMF;0.2%吐溫20)中，37 °C溫育12h，再在⑶S洗液中漂洗，然后用95%乙醇37°C脫色8 10h，漂洗后重復一次，保存于75%乙醇中，室溫儲存。同時以轉化PBI121的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空載體對照(即陽性對照)，以未經轉化的棉花胚性愈傷組織和洋蔥表皮作為空白對照(即陰性對照)。結果如圖7所示，(圖7:A為轉化pCRI11210-GUS的胚性愈傷，B為轉化pBI121的胚性愈傷(陽性對照)，而C為未轉化任何載體的胚性愈傷(陰性對照))，結果顯示轉化PCRI11210-GUS的胚性愈傷與轉化pBI121的胚性愈傷(陽性對照)中⑶S的表達效率相當。( 二)含有pCRI1210-GUS載體的農桿菌對煙草的轉化1、農桿菌轉化感受態細胞的制備:①用接種針在YEB固體培養基平板上劃線培養農桿菌LBA4404單菌落；②挑取單菌落接種于5ml含適當抗生素的YEB液體培養基中，28 °C，250rpm振蕩培養過夜；③按1: 25-50接種于IOOml含適當抗生素的YEB液體培養基中，繼續培養4_6h ;④將菌液冰浴30min，期間不斷搖動；⑤轉入2個50ml離心管，重懸沉淀，4°C，4000rpm, IOmin 去上清，加入10_15ml滅菌蒸懼水，重懸沉淀，4°C, 4000rpm, IOmin ;⑦去上清，加入IOml滅菌10%甘油，重懸沉淀，4°C,4000rpm, IOmin !⑧去上清,加入IOml滅菌10%甘油，重懸沉淀,4. ,4000Γρπι, IOmin !⑨去上清,用回流的甘油重懸沉淀；⑩用0.5ml離心管分裝，每管20 μ 1，_70°C保存備用。向農桿菌LB4404感受態細胞中，加入步驟2(1)中從陽性單克隆中所提取的質粒10ul，冰上放置30分鐘；浸入液氮中5分鐘，迅速取出37°C水浴5分鐘，然后冰浴2分鐘；加入500ul YEB液體培養基，280C，175rpm震蕩培養3_5小時；利用無菌的彎頭玻璃棒將菌液均勻涂布在含有鏈霉素、利福平和卡那霉素的YEB固體培養基平板上，28°C培養直至生長出單菌落；挑取單菌落進行PCR檢測，各泳道均出現目標條帶。將陽性單菌落搖菌過夜，培養至0D600 = 0.3-0.6用于侵染。2、含有pCRI1210-GUS載體的農桿菌對煙草的轉化用上述步驟I得到的 含有PCRI1210-GUS載體的農桿菌侵染用升汞消毒后的煙草葉片(剪成0.5X0.5cm)3分鐘，移入到共培養基(MS基本培養基+6_BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)中避光28°C共培養48小時。設計未轉化任何載體的煙草葉片為空白對照、轉化PBI121載體的煙草葉片為陽性對照和轉化PCRI1210的為空載體對照。將葉片轉入幼芽增殖固體培養基中(MS基本培養基+6-BA(2mg/L)+IAA(0.2mg/L)+Kan(lOOmg/L)+CB(500mg/L))，置于28°C人工氣候箱中誘導幼芽分化。十天后，出現幼芽。抗性篩選:在幼芽增殖固體培養基中加入卡那霉素(100mg/L)篩選陽幼芽，陽性幼芽生長正常，呈嫩綠色，未轉化成功幼芽則明顯分化遲緩，呈淺白色。EGFP篩選:撕取轉基因煙草幼芽葉片制成水裝片，直接在熒光顯微鏡下觀察EGFP突光，顯微鏡型號:Axioskop 40突光顯微鏡(Zeiss, Germany),激發波長(ExcitationWavelength:480±20nm),發射波長(Emission Wavelength):510±20nm,利用 CCD 進行圖像的采集。葉脈呈現亮綠色熒光的為轉基因陽性植株。統計陽性轉化率。結果:轉PCRI1210-GUS載體的幼芽中生長正常且葉脈呈現亮綠色熒光的幼芽213個，不正常且無熒光的幼芽19個，陽性幼芽占總幼芽的91.8%;轉陽性對照載體PBI121的幼芽中生長正常的幼芽241個，不正常幼芽20個，陽性轉化率為92.3% ；轉空載體PCRI1210的幼芽中正常的幼芽235個，不正常幼芽23個，陽性轉化率為91.1%。三種載體的陽性轉化率相當，均達到90%以上。將抗性篩選陽性的幼芽切下放入Gus染液中染色，37°C保溫培養過夜后用70%酒精脫色，組織呈現深藍色的為⑶S檢測陽性。結果顯示，pCRI1210-GUS載體轉化的煙草幼芽與pBI121載體轉化的煙草幼芽(陽性對照)均呈現深藍色，而未進行轉化的煙草幼芽(空白對照)和轉化PCRI1210的煙草幼芽變為無色半透明狀(圖8:A號管為未進行轉化的煙草幼芽(空白對照)，B和C為pBI121載體轉化的煙草幼芽(陽性對照)，D和E為PCRI1210-GUS載體轉化的煙草幼芽)，結果說明pCRI1210_GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動其下游⑶S基因在煙草幼芽中正常表達。對上述培養的煙草幼芽十五天一個周期更換培養基，直至幼芽生長到4cm左右的幼苗，將幼苗轉至生根培養基，同時取葉片進行Gus染色。結果顯示，pCRI1210-GUS載體轉化的煙草葉片與PBI121載體轉化的煙草葉片(陽性對照)均呈現深藍色，而未進行轉化的煙草葉片(空白對照)和轉化PCRI1210的煙草葉片沒有呈現深藍色(圖9:A為PCRI1210-GUS載體轉化的煙草葉片，B為pBI121載體轉化的煙草葉片(陽性對照)，C為未進行轉化的煙草葉片(空白對照)；為提高染色效果，葉片均剪去邊緣并用毛細玻璃管打孔)，結果說明pCRI 1210-GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動其下游⑶S基因在煙草葉片中正常表達。上述煙草幼苗七天后出現不定根，20天后出現大量不定根，打開瓶蓋煉苗24小時，將苗取出后用水沖洗根部，去除培養基，移栽到盆中。同時，取部分根放入Gus染液中染色。結果顯示，PCRI1210-GUS載體轉化的煙草根與pBI121載體轉化的煙草根(陽性對照)均呈現深藍色，而未進行轉化的煙草根(空白對照)和轉化PCRI1210的煙草根沒有呈現深藍色(圖10:A為pCRI1210-GUS載體轉化的煙草根，B為pBI121載體轉化的煙草根(陽性對照)，C為未進行轉化的煙草根(空白對照)；為提高觀察效果，采用不同的背景色)，結果說明PCRI1210-GUS載體中的CaMV 35S能夠正常啟動其下游⑶S基因在煙草根部中正常表達。5、pCRI1210-GUS載體轉化煙草的分子生物學檢測分別取步 驟4中pCRI1210-GUS載體轉化的煙草植株、pBI121載體轉化的煙草植株(陽性對照)、未進行轉化的煙草植株(空白對照)和轉化pCRI 1210的為空載體對照的幼嫩葉片，提取DNA，分別用⑶S基因的特異性檢測弓I物⑶SF2和⑶SR2進行PCR檢測。⑶S引物序列為:⑶SF2:5’ -GAAAGCCGGGCAATTGCT-3’ 和⑶SR2:5， -CACATCACCACGCTTGGGT-3，。檢測結果顯示(圖12:A號泳道為Makerlll，B號泳道為未進行轉化的煙草植株(空白對照)，C-E號泳道為pCRI1210-GUS載體轉化的煙草的不同單株，F-G號泳道為pBI121載體轉化的煙草的不同單株(陽性對照))，PCRI1210-GUS載體轉化的煙草與PBI121載體轉化的煙草(陽性對照)在IlOObp處均出現了擴增條帶，而未進行轉化的煙草植株(空白對照)和轉化PCRI1210的為空載體對照在此處沒有出現擴增條帶，此結果表明目的基因⑶S所在的載體pCRI1210已成功整合到煙草基因組DNA中，同時pCRI1210_GUS載體轉化的煙草植株生長良好(圖13:A為未進行轉化的煙草植株(空白對照)，B為PCRI1210-GUS載體轉化的煙草植株，C為pBI121載體轉化的煙草植株)。(三)含有RI1210-GUS載體的農桿菌對棉花無菌苗下胚軸切段的轉化用上述(二)中步驟3得到的含有RI1210-GUS載體的農桿菌侵染棉花無菌苗下胚軸切段3分鐘，移入到共培養基(MS基本培養基+6-BA (2mg/L) +IAA (0.2mg/L))中28°C共培養48小時(同時設計空白對照)。將下胚軸轉至脫分化培養基(MSB培養基、IAA、KT、2，4-D各0.lmg/L, 25g/L葡萄糖，2.2g/L Gel, pH = 6.5)上暗培養約20天，在超凈工作臺上用鑷子提取少量的愈傷組織，制成水裝片，直接在熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光，激發波長(Excitation Wavelength)為 480±20nm,發射波長(Emission Wavelength)為 510±20nm，利用CCD進行圖像的采 集。結果顯示，與未轉化的棉花愈傷組織(空白對照)相比，轉化PCRI1210-GUS載體的棉花愈傷組織中報告基因EGFP得到較強表達(圖11:A為未轉化的棉花愈傷組織(空白對照)，B為轉化pCRI1210-GUS載體的棉花愈傷組織)。
權利要求
1.一種植物雙元表達載體，是按照如下方法得到:在出發載體PBI121中構建熒光蛋白報告基因表達盒和外源基因表達盒；所述外源基因表達盒由啟動子、內含子和終止子依次連接而成，所述啟動子與所述內含子之間具有若干個酶切位點，所述內含子與所述終止子之間具有若干個酶切位點；構建得到的植物雙元表達載體中其它位置的酶切位點與所述內含子兩側的酶切位點均不相同。
2.根據權利要求1所述的植物雙元表達載體，其特征在于:所述啟動子與所述內含子間的若干個酶切位點為=Xba 1、Age 1、Kpn 1、AvrII和BamH I，所述內含子與所述終止子之間的若干個酶切位點為:EcoR 1、Sac 1、Sal I和SnaB I。
3.根據權利要求2所述的植物雙元表達載體，其特征在于:所述外源基因表達盒的核苷酸序列如序列4所示。
4.根據權利要求1或2所述的植物雙元表達載體，其特征在于:所述構建熒光蛋白報告基因的表達盒的方法為用熒光蛋白報告基因替換所述出發載體PBI121中的GUS基因表達盒中的GUS基因，得到所述熒光蛋白報告基因的表達盒。
5.根據權利要求4所述的植物雙元表達載體，其特征在于:所述熒光蛋白報告基因的為EGFP報告基因。
6.根據權利要求1或2所述的植物雙元表達載體，其特征在于:所述外源基因表達盒的表達方向與所述熒光蛋白報告基因的表達盒的表達方向相反。
7.權利要求1-6中任一所述植物雙元表達載體在將目的基因導入出發植物中的應用。
8.權利要求1-6中任一所述植物雙元表達載體在使出發植物中的目的基因功能喪失中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述使出發植物中的目的基因功能喪失是通過RNA干擾實現的。
10.根據權利要求7、8或9所述的應用，其特征在于:所述出發植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物具體為煙草或棉花；所述單子葉植物具體為洋蔥。
全文摘要
本發明公開了一種植物雙元表達載體。該植物雙元表達載體是按照如下方法得到在出發載體pBI121中構建熒光蛋白報告基因表達盒和外源基因表達盒；所述外源基因表達盒由啟動子、內含子和終止子依次連接而成，所述啟動子與所述內含子之間具有若干個酶切位點，所述內含子與所述終止子之間具有若干個酶切位點；構建得到的植物雙元表達載體中其它位置的酶切位點與所述內含子兩側的酶切位點均不相同。本發明所構建的植物雙元表達載體可用于植物轉基因過表達研究和RNAi研究；所述植物雙元表達載體具有EGFP報告基因，可以方便的進行轉基因植株的檢測；所述植物雙元表達載體具有卡那霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因較為安全，可以高效的進行篩選和生產的應用。
文檔編號C12N15/82GK103205456SQ20121001080
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者李付廣, 尹國, 洪偉東, 張朝軍, 張雪妍 申請人:中國農業科學院棉花研究所