一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法

專利名稱：一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種適合單子葉植物遺傳轉化的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法。
背景技術：
RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是指內源或外源雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介導的內源靶基因的mRNA發生特異性降解，進而抑制基因的表達，產生相應的功能表型缺失的現象。RNAi技術目前已成為基因功能研究和作物品質改良的重要方法，其中靶基因RNAi載體的構建是其核心技木。為提高干擾效率，促進RNAi技術在植物遺傳改良中的應用，國內外對RNAi載體的構建方法開展了較多研究。在植物RNA干擾表達載體構建中必需考慮的因素主要有兩個方面(1)方法簡便、快捷、干擾效率高；(2)構建過程中對骨架載體和導入的目的片段限制較少。目前，植物RNAi載體構建方法主要有三種，包括以酶切一連接為基礎的RNAi載體傳統構建方法，以同源重組為基礎的植物RNA干擾表達載體構建方法如基于(Gateway 技術的載體構建及以重組PCR技術為基礎結合酶切一連接的植物RNA干擾載體構建方法。總體而言，傳統RNAi載體構建方法耗時長，但技術比較成熟，適用范圍廣；基于(Gateway 技術的RNAi載體構建方法是ー種簡便、快捷的選擇，適于自動化、高通量的研究工作，但成本較高；如果骨架載體上缺乏所需酶切位點吋，基于重組PCR技術的RNAi載體構建方法比較有效，但該技術較新，尚需進ー步優化。在利用RNAi技術改良作物品質和植物遺傳改良研究中，所構建的RNAi載體能否成功轉化并達到改良的目的是RNAi技術尚需解決的另ー技術問題。玉米籽粒的蛋白質含量為10%左右，其中50-60%為人畜不能吸收利用的醇溶蛋白。國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)在20世紀70年代開始利用隱性突變基因Op叫iw_2 (οの及其修飾基因將醇溶蛋白含量由55. 1%降至22. 9%，使賴氨酸含量水平達普通玉米的 2倍，進而選育了大批高賴氨酸玉米即優質蛋白玉米并在全世界廣泛應用(譚靜等.優質蛋白玉米育種研究進展.玉米科學2006，14( : 15-19)，但該方法轉育周期長(7-10年)、 效率低、預見性差，加之選育出的高賴氨酸玉米胚乳呈軟質及抗病性差等問題，已越來越不適應現代育種目標的需要。優質蛋白玉米的營養價值相當于牛奶蛋白的90%，在全球許多以玉米為主食的國家和地區均可作為代用營養食品，因此對改善以玉米為主食的人群特別是學齡兒童的營養不良問題有重要意義。此外用優質蛋白玉米為主體的飼料養豬，比普通玉米飼料日增重30%以上，喂雞可提高產蛋量15%以上。研究表明，由于醇溶蛋白特別是 22-kD和19-kD醇溶蛋白基因的表達對賴氨酸含量有顯著的負面效應，然而傳統的育種方法難于找到理想的優質種質，獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋白低表達的玉米品種難度很大， 主要原因在于其表型鑒定即賴氨酸含量測定需要使用高壓液相色譜(HPLC)進行分析，由于 HPLC運行成本很高，很難在大規模種質篩選及新品種選育過程中的大批量后代選擇中廣泛應用。因此，如果能通過RNA干擾技木，構建RNAi載體并轉化獲得賴氨酸含量高而醇溶蛋
5白低表達的轉基因玉米，將是ー種簡便，快捷和有效的途徑。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術(利用OJ 基因及其修飾基因轉育獲得醇溶蛋白含量低而賴氨酸含量高的玉米品種)轉育周期長、效率低、預見性差，以及用現有技術選育出的高賴氨酸玉米品種由于oJ 基因的連鎖效應導致其籽粒呈軟質胚乳及抗病性差等缺陷和不足，其目的是提供兩個玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD和 pUC19-RNAi-19KD的構建方法，實現抑制玉米醇溶蛋白的表達，提高賴氨酸的含量水平的目的。本發明所提供的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建方法，包括以下步驟
(1)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-ZP22/6的重組載體pUC19-p22/6
①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得
以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示序列為引物對， 進行PCR擴增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6;
②構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6序列的重組載體pUC19-p22/6
用Mc I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應酶切位點的胚乳特異性表達啟動子， 然后與同樣經Mc I和)(ba I酶切的骨架載體PUC19連接，得到帶有胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；
(2)構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl
①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的獲得
以玉米籽粒總RNA為模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO: 5所示序列，進行RT-PCR擴增，然后以此RT-PCR產物為模板，以SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 7所示序列為引物對，再進行RT-PCR，得到如SEQ ID N0:8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P ；
②構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl
用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl ；
(3)構建插入反向目的片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2
用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重組載體pUC19_22KD2 ；
(4)構建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)
以表達載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進ー步用)(ho I 和Hind III雙酶切帶有相應酶切位點的終止子poly(A)，然后與同樣經Bio I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體PUC19-22KD2連接，得到含有終止子poly (A)的重組載體 pUC19-22KD2-poly(A)；
(5)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)
將步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構建的重組載體 pUC19-22KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 22-KD-P和終止子poly㈧的酶切產物22KD2_poly㈧連接到步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特異性表達啟動子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因內含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建
以質粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所
示序列的GUS基因內含子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 14所示序列的GUS基因內含子；進ー步用)(ba I單酶切帶有相應酶切位點的GUS基因內含子，然后與同樣經)(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)連接， 得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi 載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。 本發明提供的另ー個玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi_19KD的構建方法， 包括以下步驟
(1)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6
①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得
以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示序列為引物對， 進行PCR擴增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6;
②構建含有胚乳特異性表達啟動子ZP22/6序列的重組載體pUC19-p22/6
用Mc I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應酶切位點的胚乳特異性表達啟動子， 然后與同樣經Mc I和)(ba I酶切的骨架載體PUC19連接，得到帶有胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；
(2)構建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl
①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的獲得
以玉米籽粒總RNA為模板，以SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:17所示的序列，進行RT-PCR 擴增，然后以此RT-PCR產物為模板，以SEQ ID N0:18和SEQ ID N0:19所示序列為引物對，再進行RT-PCR，得到如SEQ ID N0:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段 19-KD-P ；
②構建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl
用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段19-KD-P，然后與同樣經Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl ；
(3)構建插入反向目的片段19-KD-P的重組載體pUC19-19KD2
用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段19-KD-P，然后與同樣經Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重組載體pUC19_19KD2 ；
(4)構建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-19KD2-poly(A)
以表達載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進一歩用)(ho I 和Hind III雙酶切帶有相應酶切位點的終止子poly (A)，然后與同樣經Bio I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體pUC19-19KD2連接，得到含有終止子poly(A)的重組載體 pUC19-19KD2-poly(A)；
(5)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)
將步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構建的重組載體 pUC19-19KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 19-KD-P和終止子poly㈧的酶切產物19KD2_poly㈧連接到步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特異性表達啟動子P_zp22/6，正、反向目的基因 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；
(6)⑶S基因內含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的構建
以質粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所
示序列的GUS基因內含子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO 14所示序列的GUS基因內含子；進ー步用)(ba I單酶切帶有相應酶切位點的GUS基因內含子，然后與同樣經)(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)連接， 得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi 載體pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示。 本發明的RNAi載體構建策略是以對玉米賴氨酸含量具有重要決定作用的醇溶蛋白為對象，采用先分段構建中間載體，再將各中間載體連接，最后插入內含子的方式，即將特異性啟動子和正向目的片段構建到同一個骨架載體PUC19上；同時在另ー個pUC19上插入反向目的片段和終止子poly(A)；再將反向目的片段和終止子poly(A)插入到含有啟動子和正向目的片段的重組載體上；最后插入⑶S基因內含子構成本發明所述的RNAi載體；由于22-KD和19-KD醇溶蛋白基因均是胚乳特異性表達，因此本發明中克隆了一個特異性啟動子，然后插入RNAi載體上。所述的RNAi載體構建示意圖如圖1所示；所述載體的構建方法的優點是
(1)通過加入⑶S基因內含子，提高RNAi載體的沉默效率；
(2)常規RNAi載體的構建方法是按啟動子、正向目的片段、一段不表達序列、反向目的片段、終止子poly㈧的順序逐一連接到骨架載體上，本RNAi載體的構建將啟動子和正向目的片段、反向目的片段和終止子poly(A)分別連接在骨架載體pUC19上，然后再將兩個載體進行酶切和連接，進而將反向目的片段和終止子Poly(A)插入到含有啟動子和正向目的片段的重組載體上。由于兩個中間載體可同時構建，因此縮短了載體構建的時間，提高了效卓。(3 )用本發明方法構建的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD和 pUC19-RNAi-19KD轉化玉米品種，得到了高賴氨酸含量轉基因植株，與非轉基因植株相比， 轉基因玉米的籽粒賴氨酸含量提高了 15-60%，與現有常規育種技術培育的高賴氨酸玉米品種相比，賴氨酸含量有同等水平的提高或稍高于常規育種技術培育的高賴氨酸玉米品種， 并且與常規育種(5-7年)相比，轉育周期顯著縮短，只需1-2年。同吋，平行實驗說明基于此RNAi載體的玉米轉基因技術具有較好的重復性與穩定性。此外本發明通過RNA干擾技術調節玉米醇溶蛋白的合成進而提高賴氨酸的含量水平，解決了常規育種中利用oJ 基因選育的高賴氨酸玉米品種胚乳呈軟質及抗病性差等關鍵問題，實現了利用RNA干擾原理創制高賴氨酸含量的玉米新材料的目標，對于玉米品質改良具有重要意義。序列表中SEQ ID N0:1所示的是本發明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD或RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的特異啟動子ρ引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:2所示的是本發明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD或RNAi載體pUC19_RNAi_19KD的特異啟動子ρ引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID Ν0:3所示的是胚乳特異性表達啟動子Ρ-ζρ22/6的核苷酸序列。序列表中SEQ ID Ν0:4所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-6引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:5所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-6引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:6所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:7所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的 R22-7引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:8所示的是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO:9所示的是終止子poly (A)的上游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 10所示的是終止子poly (A)的下游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 11所示的是終止子poly (A)的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:12所示的是GUS基因內含子的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:13所示的是⑶S基因內含子的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:14所示的是⑶S基因內含子的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:15所示的是本發明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:16所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:17所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-4引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID N0:18所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的
9R19-5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 19所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的 R19-5引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 20所示的是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的核苷酸序列。序列表中SEQ ID N0:21所示的是本發明所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體 pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO: 22所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_22KD轉化Ttl代再生植株的PCR檢測22TO引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 23所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_22KD轉化Tci代再生植株的PCR檢測22TO引物的下游引物序列。序列表中SEQ ID NO: 24所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_19KD轉化Tci代再生植株的PCR檢測1OT5引物的上游引物序列。序列表中SEQ ID N0:25所示的是RNAi載體pUC19_RNAi_19KD轉化Tci代再生植株的PCR檢測1OT5引物的下游引物序列。


圖 1 是 RNAi 載體 pUC19-RNAi-22KD 或 pUC19_RNAi_19KD 的構建示意圖。圖2是胚乳特異表達啟動子P-zp22/6的PCR鑒定結果，
泳道M. DNA marker, 1.胚乳特異表達啟動子P_zp22/6的PCR產物。圖3是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22_KD_P的PCR鑒定結果，
泳道M. DNA Marker, 1. 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的PCR產物。圖4是終止子poly (A)的PCR鑒定結果，
泳道 M. DNA Marker, 1.終止子 poly (A)的 PCR 產物。圖5是⑶S基因內含子的PCR鑒定結果，
泳道M. DNA marker, 1. GUS基因內含子的PCR產物。圖6是19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19_KD_P的PCR鑒定結果，
泳道M. DNA Marker, 1. 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的PCR產物。圖 7 是 RNAi 載體 pUC19-RNAi-22KD 和 pUC19_RNAi_19KD 的酶切檢測，
A: pUC19-RNAi-22KD 酶切分析，B:是 pUC19_RNAi_19KD 酶切分析。泳道 M. DNA Marker, 1 和 5: Xba I 和 Hind III雙酶切，2 和 6: Xba I 單酶切，3 和 7: Sac I 和 Xba I 雙酶切，4和8: Sac I和Hind III雙酶切。圖 8 是 pUC19-RNAi_22KD 載體圖譜。圖 9 是 pUC19-RNAi_19KD 載體圖譜。圖10是玉米胚性愈傷組織。圖11是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體基因槍轉化后的愈傷組織。圖12是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體基因槍轉化后愈傷組織的再生。
圖13是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉化后分化小苗的壯苗培養。圖14是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉化得到的Ttl代轉基因植株的田間表現。圖15是以pUC19-RNAi_19KD載體為例說明玉米醇溶蛋白基因RNAi載體轉化得到的Ttl代轉基因植株的結實情況。圖16是pUC19-RNAi-22KD載體轉化的Ttl代轉基因植株的PCR鑒定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 陽性對照(pUC19_RNAi_22KD干擾載體擴增)，CK-陰性對照 (B73非轉基因植株擴増)，CK 空白對照(水為模板)，1-9 =T0代轉基因植株擴増。圖17是pUC19-RNAi-19KD載體轉化的Ttl代轉基因植株的PCR鑒定，
泳道M. DNA Marker, CK+ 陽性對照(pUC19-RNAi_19KD干擾載體擴增)，CK-陰性對照 (B73非轉基因植株擴増)，CK 空白對照(水為模板)，1-7 =T0代轉基因植株擴増。
具體實施例方式
實驗中所用的各種試劑均可從商業渠道購買，實驗中使用的骨架載體PUC19、質粒載體 pGreen-0229 backbone、表達載體P3301、T載體及質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Marker、 高保真DNA聚合酶、dNTPs、大腸桿菌DH5 α感受態細胞和bar基因均購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、T4-DNA連接酶購自美國NEB公司；氨芐青霉素、IPTG、X_gal 等試劑均購自大連寶生物工程有限公司；RQ DNA酶、逆轉錄酶、5X反應緩沖液、dNTP、RNA 酶抑制劑購自Promega公司；其他化學試劑為國產分析純；基因槍PDS-1000/He及其消耗品購自Bio-Rad公司。核苷酸測序均由華大基因公司完成。所用的引物序列均由北京奧科生物技術公司合成。實驗中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1 玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi_22KD構建
一、供試材料玉米(Zm mays L.)自交系B73，是目前廣泛應用于玉米遺傳研究及育種實踐的玉米種質，能夠從種子公司(如云南田瑞種業有限公司，地址云南省昆明市北郊龍頭街)直接購買。ニ、實驗方法
1、B73玉米基因組DNA的提取
1)取玉米葉片300mg，加液氮充分研磨；
2)加入700μ 1 65°C預熱的2%CTAB提取液，輕輕混勻；
3)置于65°C水浴 30-60 min ；
4)室溫放置2min，加入300 μ 1氯仿-異戊醇(24:1)，充分震蕩1_2 h ；
5)10，000 rpm 離心 10 min ；
6)取上層水相至新的離心管中，加入600μ 1異丙醇，室溫放置10 min ；
7)10,000 rpm 離心 1 min，棄上清；
8)加入75%的乙醇500μ 1，室溫放置30 min ；
9)重復步驟7和8；
10)10,000 rpm離心30 s，棄上清，自然干燥DNA ；
11)加入100μ 1 TE緩沖液溶解DNA ；
12)檢測后分裝，-70°C保存。2,基因組DNA的PCR擴增
1)反應體系:
Ig
IOXBuffer ( IOitl dMTP ddftO
上游引物(20μπιο1/ ) 下游引物(20μιηο1/ ) Taqil (ευ/μι) 基因組DNA
I—_ I—_ Ii—111
1- U1 β Ur-β-β ΠΓ U1
6 1 5 5 3 ο
--rL-. ■ ■ B ■ ■ ■
■ 1 3 O O O 2
21
總體i
；ο Ο.
1 U.2)反應條件95°C 預變性 5 min，(95°C 變性 50 s，57°C 退火 50 s，72°C 延伸 1 min) 35個循環，72°C延伸10 min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。3、B73玉米籽粒總RNA的提取
1)取自交授粉后18天的玉米籽粒50-100mg，用液氮充分研磨；
2)加入1ml Trizol試劑，劇烈震蕩混勻；
3)12，OOO rpm 離心 10 min，取上清；
4)加入200μ 1氯仿，劇烈震蕩混勻，冰浴3 min ；
5)12，000 rpm 離心 15 min (4°C)；
6)取上層水相至新的離心管中，加入等量體積的異丙醇，-20°C放置10min ；
7)12,000 rpm離心15 min (4°C )，棄上清，加入700 μ 1 70%乙醇洗滌沉淀；
8)8,000 rpm 離心 10 min (4°C)，棄上清;
9)沉淀用30μ 1 DEPC-H2O溶解；
10)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA。4、RNA反轉錄體系
反應體系玉米籽粒總RNA 8 μ ，加入1 μ RQ DNA酶和1 μ RQ緩沖液，37°C水浴 30 min，取出后置于冰上，加入1 μ RQ終止緩沖液，65°C水浴10 min ；然后取出9 μ 1 作為RNA模板，加入OligodT 1 μ ，混勻后置于70°C水浴5 min，然后冰上冷卻2 min ；再加入5倍RT MLV緩沖液4 μ , 10 mM dNTP 4 Pl，RNA酶抑制劑1 μ (20U)，M-MLV反轉錄酶 1 μ (200U)，42°C水浴 1 h;72°C滅活 10 min，冰浴 10 min，于 _20°C保存。
5, RT-PCR反應體系
10XBurfer IOmM dNTP
MgE
ddftO
上游引物(20 pmol/1) 下游引物(20腳ol/l) Taq _ (5 /μ·1) 反轉錄產物總體積
11 1 1111 1
=L=I=I=I=L=L=L=L
Oo 7 5 5 3 O O
2 1 Oo O O O 2 O
12
反應條件94°C 預變性 5 min，(94°C 變性 40 s，59°C 退火 45 s，72°C 延伸 1 min) 35個循環，72°C延伸10 min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。
6, PCR產物與T載體的連接反應體系
PCR產物4 μ pEASY- Tl 栽體(5 μ g)1 μ .總體積5 μι
反應條件輕輕混合后室溫反應5mm,然后將離心管置于冰上。7、連接產物向大腸桿菌的轉化
1)取感受態細胞DH5a100 μ ，加入T載體連接物2 μ ，冰浴30 min ；
2)42°C水浴熱激90 s，立即置于冰上2 min ；
3)加入500μ LB培養基，在37°C條件下200Xg搖1 h;
4)；3500 Xg離心1 min，靜置1 h后棄部分上清；
5)カロ人5 μ ZPTG 禾ロ 50 μ X-Gal ；
6)涂板、封ロ；
7)37°C培養 16 h ；
8)挑白色單菌落，37°C進行搖菌。8、重組載體DNA的提取
用北京全式金生物技術有限公司質粒提取試劑盒提取，步驟如下
1)取4ml過夜培養的細菌10，000 X g離心1 min ；
2)加入250μ 1無色RB (含RNase Α)，震蕩懸浮細菌沉淀；
3)加入250μ 1藍色LB，不超過5 min ；
4)加入；350μ 1黃色ΝΒ，室溫靜置2 min ；
5)15，000Xg離心5 min，取上清加入吸附柱中；
6)15，000 Xg離心1 min，棄流出液;
7)加入650μ 1溶液WB，15，000 Xg離心1 min，棄流出液；
8)15，OOOXg離心2 min，徹底去除殘留的WB ；
9)將吸附柱置于干凈的離心管中，在柱中加入50μ 70°C預熱的EB或去離子水 (pH>7.0)室溫靜置 1 min ；
10)10，000Xg 離心 1 min，洗脫 DNA，于-20°C保存。
權利要求
1. 一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建方法，包括以下步驟(1)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-ZP22/6的重組載體pUC19-p22/6①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示序列為引物對， 進行PCR擴增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6;②構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6序列的重組載體pUC19-p22/6用he I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應酶切位點的胚乳特異性表達啟動子， 然后與同樣經Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到帶有胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；(2)構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl①22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的獲得以玉米籽粒總RNA為模板，以SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示序列，進行RT-PCR擴增，然后以此RT-PCR產物為模板，以SEQ ID N0:6和SEQ ID NO: 7所示序列為引物對，再進行RT-PCR，得到如SEQ ID N0:8所示的22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P ；②構建插入正向目的片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl ；(3)構建插入反向目的片段22-KD-P的重組載體pUC19-22KD2用Hind III和)(ba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段22-KD-P，然后與同樣經Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P的重組載體pUC19_22KD2 ；(4)構建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-22KD2-poly(A)以表達載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進一步用Bio I 和Hind III雙酶切帶有相應酶切位點的終止子poly (A)，然后與同樣經Bio I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體PUC19-22KD2連接，得到含有終止子poly (A)的重組載體 pUC19-22KD2-poly(A)；(5)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的片段22-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)將步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構建的重組載體 pUC19-22KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 22-KD-P和終止子poly (A)的酶切產物22KD2_poly (A)連接到步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl上，得到含有胚乳特異性表達啟動子P_zp22/6，正、反向目的基因 22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段22-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_2 2KDl-22KD2-poly(A)；(6)⑶S基因內含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD的構建以質粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所示序列的GUS基因內含子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 14所示序列的GUS基因內含子；進一步用)(ba I單酶切帶有相應酶切位點的GUS基因內含子，然后與同樣經)(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl-22KD2-poly (A)連接， 得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-22KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi 載體pUC19-RNAi-22KD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
2. —種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的構建方法，包括以下步驟(1)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體pUC19-p22/6①胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的獲得以玉米品種的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示序列為引物對， 進行PCR擴增，得到如SEQ ID N0:3所示序列的胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6;②構建含有胚乳特異性表達啟動子ZP22/6序列的重組載體pUC19-p22/6用I和)(ba I酶切步驟(1)①得到的帶有相應酶切位點的胚乳特異性表達啟動子， 然后與同樣經Mc I和)(ba I酶切的骨架載體pUC19連接，得到帶有胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6 ；(2)構建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl①19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的獲得以玉米籽粒總RNA為模板，以SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17所示的序列，進行RT-PCR 擴增，然后以此RT-PCR產物為模板，以SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示序列為引物對，再進行RT-PCR，得到如SEQ ID NO:20所示序列的19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段 19-KD-P ；②構建插入正向目的片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl用Sma I和)(ba I雙酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段19-KD-P，然后與同樣經Sma I和)(ba I雙酶切的步驟(1)②構建的重組載體pUC19-p22/6連接，得到插入了正向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和胚乳特異性表達啟動子 P-zp22/6 的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl ；(3)構建插入反向目的片段19-KD-P的重組載體pUC19-19KD2用HindII^n^Cba I酶切步驟(2)①得到的帶有相應酶切位點的目的片段19-KD-P，然后與同樣經Hind III和Xba I酶切的pUC19載體連接，得到插入反向目的基因19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P的重組載體pUC19_19KD2 ；(4)構建含有終止子poly(A)的重組載體pUC19-19KD2-poly(A)以表達載體P3301 DNA為模板，用SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10所示序列的終止子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 11所示序列的終止子poly (A)；進一步用Bio I 和Hind III雙酶切帶有相應酶切位點的終止子poly(A)，然后與同樣經)(h0 I和Hind III雙酶切的步驟(3)得到的重組載體PUC19-19KD2連接，得到含有終止子poly (A)的重組載體 pUC19-19KD2-poly(A)；(5)構建含有胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6，正、反向目的片段19-KD-P和終止子 poly (A)的重組載體 pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)將步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-22KDl和步驟(4)構建的重組載體 pUC19-19KD2-poly (A)分別用)(ba I和Hind III雙酶切，然后將含有反向目的片段 19-KD-P和終止子poly㈧的酶切產物19KD2_poly㈧連接到步驟(2)構建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl上，得到含有胚乳特異性表達啟動子P_zp22/6，正、反向目的基因 19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段19-KD-P和終止子poly (A)的重組載體pUC19-p22/6_l 9KDl-19KD2-poly(A)；(6)⑶S基因內含子的連接和玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD的構建以質粒載體 pGreen-0229 Backbone DNA 為模板，用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所示序列的GUS基因內含子引物進行PCR擴增，得到如SEQ ID NO: 14所示序列的GUS基因內含子；進ー步用)(ba I單酶切帶有相應酶切位點的GUS基因內含子，然后與同樣經)(ba I單酶切后磷酸化處理的步驟(5)構建的重組載體pUC19-p22/6-19KDl-19KD2-poly (A)連接， 得到所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi載體pUC19-RNAi-19KD，所述的玉米醇溶蛋白基因RNAi 載體pUC19-RNAi-19KD的核苷酸序列如SEQ ID N0:21所示。
全文摘要
本發明公開了一種玉米醇溶蛋白基因RNAi載體的構建方法。該方法以pUC19為骨架載體，構建插入正向目的片段和胚乳特異性表達啟動子P-zp22/6的重組載體，構建插入反向目的片段和終止子poly(A)的重組載體，將兩重組載體分別酶切、連接得到重組載體pUC19-p22/6-22KD1-22KD2-poly(A)；再將GUS基因內含子插入到該重組載體，得到玉米醇溶蛋白基因RNAi載體，目的片段是22-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段。用相同方法構建了另一個玉米醇溶蛋白基因RNAi載體，目的片段為19-KD醇溶蛋白基因部分cDNA片段。該方法縮短了載體構建的時間，能成功獲得高賴氨酸含量的轉基因植株。
文檔編號C12N15/66GK102533847SQ20121001054
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者劉麗, 王琨, 番興明, 陳威 申請人:云南田瑞種業有限公司, 云南省農業科學院糧食作物研究所