專利名稱：人胃癌腫瘤干細胞株gam-016s的培養建立的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人胃癌腫瘤干細胞株的培養建立，屬于細胞生物學細胞培養技術領域。
背景技術：
腫瘤組織中存在數量稀少的癌細胞，在腫瘤形成過程中充當干細胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潛能，其眾多性質與干細胞相似，因此被稱為腫瘤干細胞(TIC)。由于在腫瘤的發生、發展、復發和轉移中的重要作用，TIC已成為目前腫瘤研究的熱點。但在腫瘤細胞群落中，Tic數目稀少，培養相對不穩定，因此發展高效的體外培養系統細胞擴增技術以及維持干細胞未分化狀態技術已經成為現今研究的重要任務。TIC的研究材料主要來自3個方面:患者的腫瘤標本、腫瘤細胞株及腫瘤移植瘤。由于腫瘤細胞株容易獲得和培養，目前許多研究者使用細胞株作為TIC研究的重要材料，用以研究TIC調節通路，為臨床治療提供靶點。但腫瘤細胞株能否保持原代腫瘤的等級結構一直遭到質疑。通過體外實驗得到的TIC表面標記或調節通路上的調節分子或基因，最終都要通過體內試驗再進行驗證。以腫瘤移植瘤作為TIC的研究材料的方法則很大程度上解決了這種一致性的問題。異體移植腫瘤是將來自于臨床的腫瘤標本接入裸鼠皮下使其長出實體瘤，再將長出的實體瘤繼續接種裸鼠在裸鼠體內傳代。實體瘤在裸鼠體內傳代次數越多，越容易在短時間內建立腫瘤細胞系。經過異體移植而得到的瘤塊組織在體外進行單細胞懸液的制備，再將制備的單細胞進一步的分離培養從而獲得TIC。雖然原代腫瘤免疫缺陷小鼠的異體移植會改變干細胞的生存環境，但使用這種方法得到的TIC仍是最接近體內真實狀態的Tic。
發明內容
專利的研究目的:胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在全世界癌癥死亡率中排名第二。雖然不斷有文獻報道腫瘤干細胞廣泛存在于各種實體瘤內，但目前對胃癌干細胞的研究卻為數甚少。由于腫瘤干細胞在腫瘤研究和治療上的重要意義，我們使用異源移植裸鼠的實體瘤塊進行了胃癌干細胞的分離和純化培養。專利的研究結果:本發明通過對病人胃癌組織異源移植小鼠瘤塊在體外的原代細胞培養、腫瘤克隆形成實驗和無血清細胞培養獲得了腫瘤干細胞株GAM-016S。該細胞株可在無血清培養條件下形成克隆球；流式細胞檢測(FACS)和免疫組織化學(IHC)分析結果顯示GAM-016S細胞系表達腫瘤干細胞標志分子⑶24、⑶44，但不表達⑶133 ;裸鼠腹腔注射100個克隆球細胞即可形成瘤塊。專利的研究意義:人胃癌腫瘤干細胞株GAM-016S的分離建系，可以實現對腫瘤干細胞的大規模培養，進而建立相應完善的藥物篩選平臺。由于腫瘤干細胞重要的生物學作用，GAM-016S細胞株的建立對探索TIC生物學行為的分子機制、篩選研發胃癌治療新藥以及胃癌的腫瘤臨床研究治療都具有十分重要的理論意義和實用價值。
圖1:GAM_016S克隆形成分析A.無血清培養基B.瓊脂培養基圖2 =GAM-016S干細胞標志分子的FACS和IHC分析圖3:GAM-016S體內致瘤能力分析
具體實施例方式將來自于臨床的胃癌標本皮下接種于B/C雄性裸鼠體內，待長出實體瘤后繼續接種裸鼠在裸鼠體內傳代。將從裸鼠上得到的異體移植腫瘤組織進行胰酶消化分散制成單細胞懸液，再通過原代細胞培養、腫瘤克隆形成實驗和無血清干細胞培養技術分離建立胃癌干細胞。1.腫瘤干細胞培養:將異體移植的瘤塊進行剪切并使用胰酶消化得到單細胞懸液；將獲得的單細胞懸液培養在含有EGF、FGF-2的無血清培養基中；使用低粘附性的培養皿進行培養以降低細胞的粘附力并支持低分化的腫瘤細胞團的生長。細胞培養過程中每隔一周更換一次含培養因子的培養液，直到細胞開始形成懸浮的細胞團為止。2.腫瘤克隆形成實驗:制備0.5%的瓊脂糖凝膠培養基(I: I瓊脂糖/培養液)，均勻地平鋪于培養皿底層制備培養基層。將無血清培養形成的腫瘤細胞團分離成單細胞懸液，計數并用1:1瓊脂糖/培養液重懸，鋪于培養基層。將培養皿其置于5% C02、37°C的濕潤條件下培養。3.流式細胞檢測(FACS)和免疫組織化學檢測(IHC):將腫瘤克隆細胞團制備成單細胞懸液，清洗并與相應的抗體(⑶24、⑶44、⑶133)孵育進行FACS檢測。IHC檢測需要固定石蠟包埋制片脫片制備標本，再將樣品標本進行抗體孵育檢測。4.體內致瘤實驗:將腫瘤克隆細胞團制備成單細胞懸液，計數并重懸于1:1PBS/Matrigel中，將不同數量的細胞皮下接種于BALB/C裸鼠以觀察致瘤性。GAM-016S保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)； 保藏日期為2011年12月9日；保藏編號=CGMCC N0.5572 ；分類命名:人胃癌干細胞。
權利要求
1.本發明培養建立了一株名為GAM-016s的胃癌腫瘤干細胞。
2.本發明使用了腫瘤異體移植技術，再經原代細胞培養、腫瘤克隆形成實驗和無血清干細胞培養獲得了胃癌腫瘤干細胞株GAM-016S。
3.本發明建系的胃癌腫瘤干細胞株GAM-016S，可在無血清培養條件下形成克隆球；裸鼠腹腔注射100個克隆球細胞即可形成瘤塊；流式細胞檢測(FACS)和免疫組織化學(IHC)分析顯示GAM-016S細胞表達腫瘤干細胞標志分子⑶24、⑶44，但不表達⑶133。
4.本發明可 用于針對⑶44，⑶24靶向抗腫瘤藥物的研制。
全文摘要
本發明涉及一種胃癌腫瘤干細胞株的培養建立，適用于細胞學、腫瘤學、免疫學、藥理學、臨床醫學等相關領域的研究，屬于細胞培養技術范疇。本發明通過對病人胃癌組織異源移植小鼠瘤塊在體外的原代細胞培養、無血清細胞培養獲得了腫瘤干細胞株GAM-016S。該細胞株可在無血清培養條件下形成克隆球；裸鼠腹腔注射100個克隆球細胞即可形成瘤塊；流式細胞檢測(FACS)和免疫組織化學(IHC)分析結果顯示GAM-016S細胞系表達腫瘤干細胞標志分子CD24、CD44，但不表達CD133。GAM-016細胞株的建立對胃癌的腫瘤學研究、藥物篩選、臨床治療等方面具有重要的意義和價值。
文檔編號C12R1/91GK103194429SQ20121000126
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者劉巖, 張文娜, 寧金鷹, 陳一友 申請人:中美冠科生物技術(北京)有限公司