光活化嵌合視蛋白及其使用方法

光活化嵌合視蛋白及其使用方法
【專利摘要】本文提供包含在質膜上表達的光活化嵌合蛋白的組合物；和使用所述組合物來選擇性地使興奮性或抑制性神經元去極化的方法。
【專利說明】光活化嵌合視蛋白及其使用方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2010年11月5日提交的美國臨時專利申請號61/410，736 ;于2010年11月5日提交的美國臨時專利申請號61/410，744;以及于2011年7月26日提交的美國臨時專利申請號61/511，912的優先權，這些專利申請各自的公開內容以引用的方式全部并入本文。
【技術領域】
[0003]本申請涉及包含在質膜上表達光活化嵌合蛋白的動物細胞的組合物；和使用所述組合物來選擇性地使存在于前額葉皮質中的相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法。
[0004]背景
[0005]對大多數精神病障礙的神經生理學底物的了解不多，盡管關于與復雜的行為表型，如在孤獨癥和精神分裂癥中所觀察到的那些表型相關的遺傳因素的信息快速涌現(Cichon 等，The American Journal of Psychiatryl66(5):540(2009) ;0，Donovan等，Human Geneticsl26 (I): 3 (2009))。一個正顯露的值得注意的原則是極為廣泛的看起來似乎不相關的遺傳異常可以引起同一類別的精神病表型(如社會行為機能障礙^olstein和Rosen-Sheidley, Nature Reviews2 (12):943(2001))。這個出人意料的型態指出需要鑒別出可以在普通病理生理學原則下統一不同的遺傳因素的簡化回路級(circuit-level)見解。
[0006]一種這樣的回路級假設是皮質細胞的興奮與抑制的比率(細胞的E/I平衡)提高可以引起孤獨癥的社會性和認知性缺陷(Rubenstein, CurrentOpinion in Neurology23 (2): 118 ；Rubenstein 和 Merzenich,Genes,Brain,andBehavior2 (5): 255 (2003))。這種假設可以潛在地統一大量不同的病理生理學證據，包括觀察到許多孤獨癥相關基因與離子通道和突觸蛋白的功能獲得性表型有關(Bourgeron, Current Opinion in Neurobiologyl9 (2), 231 (2009))并且約 30% 的孤獨癥患者還表現出臨床上明顯的癲癇發作(Gillberg和Billstedt, Acta PsychiatricaScandinavica，102(5):321 (2000))。然而，還不清楚此種不平衡(與疾病癥狀相關的)是可以在長期(例如在發展過程中)還是在短期時間跨度上操作。此外，這種假設并未得到普遍接受，部分是因為它還不易于直接測試。在社會性和認知性任務期間，無論在臨床環境中還是在自由行為的實驗哺乳動物中，藥理學和電學的干預缺乏必要的特異性來選擇性地促進新皮質興奮性細胞而非抑制性細胞的活性(以根本不同于受體調節的方式)。這也許涉及到多種挑戰，如已證明孤獨癥和精神分裂癥的社會性和認知性缺陷對于臨床中的常規精神藥理學治療基本上無反應。
[0007]光遺傳學是遺傳學方法和光學方法的組合，被用來控制活組織(甚至是自由移動的哺乳動物和其它動物體內的活組織)的靶細胞中的特定事件，具有為比肩功能完整的生物系統所需要的時間精確度(毫秒時間跨度)。光遺傳學的特點是將快速光活化通道蛋白引入靶神經元細胞的質膜，從而允許在時間上精確地操縱神經元膜電位同時通過使用特異性靶向機制來維持細胞類型解析。可以用來研究神經系統的功能的微生物視蛋白包括被用來促進響應于光的去極化的視紫紅質通道蛋白(ChR2、ChRU VChRl、以及SFO)。在短短的幾年中，光遺傳學領域已深化了對特定細胞類型如何在活體內促進生物組織(如神經回路)的功能的基礎性科學理解。此外，在臨床方面，光遺傳學帶動的研究使得對帕金森氏(Parkinson's)病和其它神經障礙和精神病障礙獲得了深入了解。
[0008]然而，現有的用于探究皮質E/Ι平衡的比率提高可能與孤獨癥和其它障礙(如精神分裂癥)的社會性和認知性缺陷相關的假設的光遺傳學工具存在限制。常規的視紫紅質通道蛋白光電流展現出顯著的脫敏作用，這妨礙了 E/Ι平衡的階梯狀變化的產生(轉為要求斜坡或脈沖，這將不適合用于研究細胞的E/Ι平衡的穩定變化)；此外，SFO和常規的ChR兩者均由藍光驅動，這妨礙了驅動不同回路元件(如興奮性和抑制性神經元)群體的作用的制劑內比較。因此，需要允許操縱皮質E/Ι平衡和監測皮質切片中的Y振蕩的工具，以便容許研究這些操縱如何影響存在于前額葉皮質中的相同微回路中的下游神經元。
[0009]發明概述
[0010]本文提供一種組合物，其包含嵌合光活化蛋白陽離子通道，當用光照射細胞時，所述嵌合光活化蛋白陽離子通道能夠介導細胞中的去極化電流。
[0011]本文提供包含在細胞膜上表達的光活化蛋白的動物細胞，其中所述蛋白是(a)來源于來自強壯團藻(Volvox carteri)的VChRl和來自萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardti)的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；(b)對光可響應；并且(c)當用光照射細胞時，能夠介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，所述細胞是分離的或在細胞培養基中。
[0012]本文還提供包含在細胞膜上表達本文所描述的嵌合蛋白的細胞的細胞群。本文還提供包含在細胞膜上表達本文所描述的嵌合蛋白的細胞的非人動物和腦組織切片。
[0013]本文提供包含編碼在細胞膜上表達的光活化蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；對光可響應；并且當用光照射細胞時，能夠介導細胞中的去極化電流。還提供包含所述多核苷酸的載體(如表達載體)。在一些實施方案中，所述表達載體是病毒載體(例如，AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體、或慢病毒載體)。
[0014]本文還提供使用在細胞膜上表達本文所描述的嵌合蛋白的動物細胞的方法，所述方法包括用光活化所述嵌合蛋白。
[0015]本文還提供選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，其中所述第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化，其中所述第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時被去極化。在一些實施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實施方案中，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0016]一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經元中表達第一光活化蛋白；并且在抑制性神經元中表達第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時被獨立地去極化，并且其中所述第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時被獨立地去極化。在一些實施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0017]本文還提供用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元的去極化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波長的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，或用具有第二波長的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化；(b)測量響應于選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)，或測量響應于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC) ；(c)使興奮性神經元或抑制性神經元與化合物接觸；(d)測量興奮性突觸后電位(EPSP)或測量抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使興奮性神經元或抑制性神經元與化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經元的去極化。在一些實施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述第一光活化蛋白包含與SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ IDNO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 95% 相同的氨基酸序列。
[0018]應理解，可以將本文描述的不同實施方案的一種、一些或全部特性進行組合以形成本發明的其它實施方案。本發明的這些和其它方面對于本領域技術人員將變得顯而易見。
[0019]附圖簡述
[0020]圖1描繪了用于組合性光遺傳學的改進型紅移視紫紅質通道蛋白的工程化。(a)用受CaMKIIa啟動子控制的VChRl_eYFP或ClVl_eYFP轉染的培養海馬神經元的共焦圖像。方框表示最后一幅圖中放大的區域，其示出CIVl-tsYFP的樹突狀膜定位。比例尺:20ym(&)，4ym(S)。(b)來自表達指定視蛋白的培養海馬神經元中的全細胞膜片鉗記錄的峰值光電流。(c) ChRl、ChR2以及VChRl的序列比對。指出兩種ClVl變異體的剪接位點。推定跨膜螺旋1-7(ΤΜ1-7)用條欄指示；突變的氨基酸用灰色指示。(d)在表達ClVl剪接變異體I和2的HEK細胞中所記錄的光電流振幅。(e)用與EYFP融合的指定視蛋白轉染的培養海馬神經元的單個共焦平面圖像。DNA濃度在構建體間匹配。(f)ChR2、VChRl、ClVlwtXlV(E122T) ,ClVl (E162T)、以及 ClVl (E122T/E162T)的作用譜。在 HEK293 細胞中，用2ms光脈沖來收集光電流。(g)ClVl剪接變異體I的離子滲透，所述離子滲透是使用陽離子分離外部溶液通過全細胞膜片鉗在HEK細胞中在_40mV下測得的光電流幅值所測量。將數據歸一化為最大峰值Na電流。(h)ClVl嵌合體的示意圖，其中點突變位置用白色指示。ChRl序列用黑色指示；VChRl序列用灰色指示。
[0021]圖2描繪了測試用于組合光遺傳學的改進型紅移視紫紅質通道蛋白。(a)表達指定視蛋白的培養神經元中的通道閉合時間常數的代表性跡線和匯總圖線(summary plot);將跡線歸一化為峰值電流。(b) C1V1-E122T鈍化與ChR2去活的比較。(c)ClVl雙重變異體E122T/E162T與其它ClVl變異體中的電流鈍化的比較。(d)在表達指定視蛋白的培養神經元中所記錄到的響應于2ms542nm光脈沖的平均峰值光電流。
[0022]圖3描繪了在前額葉錐體神經元中進行短期切片記錄獲得的光電流。(a)峰值光電流顯示始終與積分熒光強度相關。(b)ChR2(H134R)與ClVl (E122T/E162T)中的熒光-光電流關系。黑色線是對數據的線性擬合。(c)在用指定頻率的560nm光脈沖列或電流注入所刺激的前額葉錐體神經元中進行的短期切片記錄。匯總圖形示出了群數據(n=6)。(d)在指定波長和光功率密度下，成功尖峰相對于電流注入(200pA，IOms脈沖；左上)或2ms光脈沖的分數。所有脈沖列由20 X 2ms脈沖組成，所述脈沖通過使用薩特(Sutter) DG-4光源的顯微鏡物鏡遞送、使用20nm帶通濾光片和額外的中性密度濾光片過濾以使光功率減弱(在2種切片中n=6個細胞)。(e)在表達C1V1-E122T或C1V1-E122T/E162T的細胞中的電壓鉗對542nm和630nm光脈沖的響應(上部)。在表達C1V1-E122T的細胞中的電流鉗記錄顯示響應于3.2mff ι?π 2下的50ms630nm光的5Hz列的尖峰(底部)。(f)ClVl (E122T)中的紅光響應的動力學。在540nm和630nm下，從表達C1V1(E122T)的培養神經元中記錄到的光電流的活化時間常數(τ 。應注意，光功率在630nm下是3.2mff mm-2并且在540nm下是
7.7mW mm2(n=5個細胞，ρ=0.0006成對t-檢驗)。(g)電壓鉗跡線顯示在表達ClVl (E122T)的神經元中對630nm光脈沖的響應。脈沖長度指示于跡線上方。從150ms跡線計算出的τ活化是67ms。(h)來自表達ClVl (E122T)的神經元的電流鉗記錄，顯示在630nm下由50ms脈沖(功率密度3.2mff mm 2)引發的尖峰。
[0023]圖4描繪了興奮性錐體神經元和表達小白蛋白的抑制性細胞的獨立活化。(a)響應于560nm或405nm下的2ms光脈沖(5Hz ;在兩個波長下7.6mff/mm2),由表達C1V1(E122T/E162T)或ChR2(H134R)的培養海馬神經元得到的電流鉗記錄。(b)在皮質錐體神經元中表達CIVI并且在抑制性小白蛋白陽性中間神經元中表達ChR2 (H 134R)的雙重注射動物中的記錄配置。為了獨立地表達視蛋白，給PV::Cre小鼠注射含有Lent1-CaMKIl a-ClVl (E122T/E162T)和 AAV5-EF Ia-DIO-Ch R2 (H134R)的雙病毒混合物。
(c)由非表達性PYR神經元得到的電壓鉗記錄，所述神經元接受來自表達ClVl的PYR-細胞和表達ChR2的PV-細胞的突觸輸入。在0mV、405nm光脈沖下鉗制引發短潛伏期IPSC，而560nm脈沖僅引起小的、長潛伏期的抑制性突觸響應。(d)由在c中所示的相同細胞得到的電壓鉗記錄。在_65mV、560nm光脈沖下鉗制引發EPSC,但405nm脈沖不能引起可檢測到的突觸電流。灰色線示出個別事件；黑色線示出光脈沖引發的平均值。(e)在注射CaMKIla::ClVl (E162T)-ts-eYFP 和 Efla-DIO::ChR2_eYFP 的被麻醉的 PV::Cre 小鼠中的mPFC光極記錄(圖表說明實驗設置)。紫色(405nm)光脈沖相對于綠光脈沖(實例跡線)呈現出可變延遲(At)。(f)匯總圖形示出了在紫光脈沖領先綠光脈沖所指示的延遲的情況下綠光引發的尖峰的概率。個別點是來自單個的記錄。黑色線示出所有記錄的平均值(每分區(bin) >3個記錄位點)。(g)來自注射病毒的小鼠的光電極記錄，示出一個推定錐體單元和一個推定PV單元分別響應于561nm刺激(右側，上方波形)和405nm刺激(右側，下方波形)而放電。
[0024]圖5描繪了在不同完整系統制劑中的組合光遺傳學激發。(a)在活體外用C1V1-E122T/E162T和ChR2_H134R進行的組合投射控制。實驗性范例分別示出ClVl和ChR2在皮層丘腦(CT)和腹側基底(VB)丘腦皮質的細胞(TC)中的表達。(b)由從CT和TC細胞兩者中接收投射的nRT細胞得到的電壓鉗記錄。同時刺激(At=O ms)導致來自兩個投射的所引發的EPSC的線性疊加。(c)當輸入是精確重合的時候，來自TC和CT纖維的個別低于閾值的輸入僅在nRT神經元中產生尖峰。(d)CT與TC輸入之間的延遲指示于左側。水平短劃線指示切去頂端的尖峰。由以可變潛伏期(At)活化的CT和TC纖維引發的歸一化數目的動作電位(來自6個nRT細胞)指示只有在5ms內重合的情況下，CT和TC輸入才產生有效的整合。匯總數據表示平均土SEM。
[0025]圖6描繪了光譜時間分離和組合控制:正進行的突觸活動下的E/Ι狀態改變的回路調節和出射型態。(a)針對PV神經元的SSFO活化和錐體神經元中的ClVl活化的實驗性范例。(b)在來自表達CaMKIla::C1V1 (E162T)和DIO-SSFO的PV::Cre小鼠的短期切片制劑中，在OmV下由錐體神經元得到的電壓鉗記錄。SSFO和ClVl由藍光脈沖活化⑵，并且通過持續的SSFO活性使IPSC頻率增加(3 ；比較插圖中針對活化前和活化后IPSC活性的上方和下方跡線)。持續的黃光脈沖使SSFO去活，并且活化ClVl和瞬時增加IPSC頻率
(4)。群功率譜(右側)示出光學興奮性神經元活化(590nm脈沖)過程中的Y頻率活性，所述Y頻率活性在興奮性和PV神經元(470nm脈沖)共同活化過程中增加。在跡線下方的圖表示出實驗過程中的ClVl和SSFO的預測活性。(c)所觀察到的Y頻率峰與先前經由SSFO對PV神經元的刺激無關。(d)基`線時和初始藍光或橙色光脈沖后來自(b)和(c)的匯總IPSC頻率。在跡線下方的圖表示出實驗過程中的ClVl和SSFO的預測活性。
[0026]詳述
[0027]本發明特別提供包含在質膜上表達光活化嵌合蛋白的動物細胞的組合物；和使用所述組合物來選擇性地使存在于前額葉皮質中的相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法。本發明人開發了具有獨特物理化學特性的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白首次容許實驗性操縱皮質E/Ι提高并且能夠監測皮質切片中的Y振蕩。這些獨特的光敏性嵌合蛋白可以在非人動物的前額葉皮質中的興奮性或抑制性神經回路中表達，然后可以響應于具有特定波長的光使所述興奮性或抑制性神經回路去極化。此外，來自非人動物的含有表達本文公開的嵌合光敏性蛋白的皮質興奮性或抑制性神經元的腦切片可以被用來搜尋可以選擇性地抑制存在于相同神經回路內的興奮性或抑制性神經元的去極化的化合物。
[0028]一般技術
[0029]除非另外指出，否則本發明的實踐將采用本領域技術人員所熟知的分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學以及免疫學的常規技術。所述技術已在文獻中得到充分說明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等，1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 和 Russel, 2001)(本文統稱為“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等編著，1987，包括 2001 年增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等編著，1994) ;Harlow和 Lane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications, New York ;Harlow 和 Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (本文統稱為 “Harlow和 Lane，，)，Beaucage 等編著，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Johnffiley&Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology,第四版(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 編著，Blackwell Science Inc., 1987);以及 Gene TransferVectors for Mammalian Cells (J.M.Miller 和 M.P.Calos 編著，1987)。
[0030]定義
[0031]如本文所使用，除非另外指出，否則單數形式“一個/ 一種(a/an) ”和“所述(the) ”包括復數個指示物。
[0032]“動物”可以是脊椎動物，如任何常見的實驗室模式生物或哺乳動物。哺乳動物包括但不限于:人、農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、小鼠、大鼠、以及其它嚙齒類動物。
[0033]如本文所使用的“氨基酸取代”或“突變”意指指定氨基酸序列中的至少一個氨基酸組分改變或取代為另一個氨基酸，從而在細胞內產生活性或表達水平改變的由所述氨基酸序列編碼的蛋白質。
[0034]“嵌合蛋白”是包含一個或多個來源于一種或多種不同蛋白的部分的蛋白。嵌合蛋白可以通過培養轉染有編碼所述嵌合蛋白的核酸的重組細胞來產生。
[0035]意欲在本說明書通篇中給出的每個最大數值限制包括每個較低的數值限制，如同所述較低的數值限制被清楚地寫在本文中一般。在本說明書通篇中給出的每個最小數值限制將包括每個較高的數值限制，如同所述較高的數值限制被清楚地寫在本文中一般。在本說明書通篇中給出的每個數值范圍將包括每個落在所述較寬的數值范圍之內的較窄的數值范圍，如同所述較窄的數值范圍都被清楚地寫在本文中一般。
[0036]VlCl嵌合蛋白和表達所述VlCl嵌合蛋白的細胞
[0037]在一些方面中，本文所公開的動物細胞包含嵌合光敏性蛋白(稱為“C1V1”)，所述嵌合光敏性蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl陽離子通道和來自萊茵衣藻的ChRl陽離子通道。所述蛋白可以由VChRl的氨基酸序列構成，但另外VChRl多肽的至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋可以置換為ChRl的相應第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋。ClVl嵌合視蛋白是從單獨不能在神經元中很好地表達并且是有效、紅移且穩定的視紫紅質通道蛋白的其它視蛋白的片段組裝而來。在一些實施方案中，所述動物細胞可以在細胞的質膜上表達第二光活化蛋白。所述第二光活化蛋白可以能夠介導細胞質膜響應于光活化發生超極化。能夠介導細胞質膜的超極化的光活化蛋白的實例可以例如在國際專利申請號PCT/US2011/028893中找到，所述專利 申請的公開內容以引用的方式全部并入本文。
[0038]本公開內容的實施方案還可以是針對ClVl的修飾或突變型式。這些蛋白可以單獨或與多種其它視蛋白組合使用，以確保對神經元進行光學控制。具體來說，聯合其它視蛋白使用修飾的ClVl被認為適用于對神經系統障礙進行光學控制。ClVl的具體用途涉及光遺傳學系統或方法，所述光遺傳學系統或方法使對神經回路的時間、空間和/或細胞類型特異性的控制與可測量的指標關聯起來。
[0039]VlCl嵌合蛋白
[0040]本文提供在動物細胞質膜上表達的光活化嵌合蛋白。在一些方面中，所述光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白。在一些實施方案中，所述嵌合蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的相應第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的相應第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列，并且進一步包含置換為ChRl的相應部分的位于第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的細胞內環結構域的至少一部分。在一些實施方案中，在嵌合光活化蛋白的第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的整個細胞內環結構域可以置換為ChRl的相應細胞內環結構域。在其它實施方案中，位于第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的置換為ChRl的相應部分的細胞內環結構域的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的A145。在其它實施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及細胞內環結構域置換為ChRl的相應第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及細胞內環結構域的VChRl的氨基酸序列，并且進一步包含置換為ChRl的相應部分的第三跨膜螺旋的至少一部分。在另一個實施方案中，置換為ChRl的相應部分的第三跨膜螺旋的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的W163。在一些實施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-145和VChRl的氨基酸102-316。在一些實施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-162和VChRl的氨基酸119-316。在一些實施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的序列在沒有信號肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:1中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的氨基酸序列。
[0041]在其它實施方案 中，當用光照射細胞時，光活化嵌合蛋白能夠介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，所述光可以是綠光。在其它實施方案中，所述光的波長可以在約540nm至約560nm之間。在一些實施方案中，所述光的波長可以為約542nm。在一些實施方案中，當用紫光照射細胞時，嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，當用波長為405nm的光照射細胞時，嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。
[0042]在一些實施方案中，蛋白可以進一步包含C末端熒光蛋白。在一些具體的實施方案中，所述C末端熒光蛋白可以是增強型黃色熒光蛋白(EYFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、青色熒光蛋白(CFP)、或紅色熒光蛋白(RFP)。在一些實施方案中，通過添加增強蛋白質向細胞質膜的轉運的轉運信號(ts)來修飾光活化嵌合蛋白。在一些實施方案中，所述轉運信號是來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述轉運信號包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。在一些實施方案中，所述蛋白中的信號肽序列可以置換為不同信號肽序列。
[0043]在一些實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞、肌肉細胞、或干細胞。在一個實施方案中，動物細胞是神經元細胞。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在其它的實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。
[0044] 在一些實施方案中，動物細胞可以進一步包含在細胞的質膜上表達的第二光活化蛋白。在一些實施方案中，當用光照射細胞時，所述第二光活化蛋白可以能夠介導細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，所述第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。關于其它光活化陽離子通道、陰離子泵、以及質子泵的另外的信息可以在美國專利申請公布號2009/0093403 ;和國際專利申請號PCT/US2011/028893中找到，所述專利申請的公開內容由此以引用的方式全部并入本文。在一些實施方案中，相對于表達其它光活化陽離子通道蛋白的細胞，所述光活化嵌合蛋白在曝露于光的神經細胞中可以具有增強的光電流。在一些實施方案中，由光活化嵌合蛋白提供的光電流增強可以比表達其它光活化陽離子通道蛋白的細胞大I倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍中的任一者，包括所述倍數在內。
[0045]本文還提供在動物細胞質膜上表達的一種或多種光活化蛋白，其中所述一種或多種光活化蛋白包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，并且進一步包含轉運信號(例如，增強向質膜轉運的轉運信號)。所述轉運信號可以融合至核心氨基酸序列的C末端或可以融合至核心氨基酸序列的N末端。在一些實施方案中，所述轉運信號可以通過連接子連接至核心氨基酸序列。所述連接子可以包含5個、10個、20個、30個、40個、50個、75 個、100 個、125 個、150 個、175 個、200 個、225 個、250 個、275 個、300 個、400 個、或 500 個氨基酸中的任一長度。所述連接子可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述轉運信號可以來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述轉運信號可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0046]VlCl嵌合突奪型奪異體
[0047]在一些方面中，本發明包括包含取代的或突變的氨基酸序列的多肽，其中所述突變型多肽保留了前體ClVl嵌合多肽的特征性光可活化性質，但在一些具體方面中也可以具有改變的特性。例如，本文所描述的突變型光活化嵌合蛋白可以展現出在動物細胞內或在動物細胞質膜上的表達水平均增加；當被曝露于不同波長的光(特別是紅光)時，響應性改變；和/或性狀的組合，其中嵌合ClVl多肽具有以下特性:低脫敏作用、快速去活、低紫光活化以便與其它光活化陽離子通道的交叉活化作用最低，和/或在動物細胞中具有強表達。
[0048]包含氨基酸取代或突變的光活化嵌合蛋白包括一個或多個氨基酸殘基經歷過氨基酸取代同時保留對光可響應的能力和控制質膜的極化狀態的能力的那些蛋白。例如，可以通過將一個或多個氨基酸取代為對應于SEQ ID NO:1的氨基酸序列來制備包含氨基酸取代或突變的光活化蛋白。在一些實施方案中，本發明包括包含的氨基酸序列與SEQ ID NO:1中的氨基酸序列相比改變的蛋白質，其中所述改變的光活化嵌合蛋白保留了具有SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的蛋白的特征性光活化性質和/或調控穿過質膜的離子流的能力，但在一些具體方面中可以具有改變的特性。[0049] 天然蛋白序列中的氨基酸取代可以是保守性或非保守性的，并且所述取代的氨基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基。基于側鏈的化學特性，將標準的二十種氨基酸“字母表”分為化學家族。這些家族包括具有以下側鏈的氨基酸:堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族基團的側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基置換為具有化學上類似的側鏈的氨基酸殘基(即，使具有堿性側鏈的氨基酸置換為具有堿性側鏈的另一種氨基酸)。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基置換為具有化學上不同的側鏈的氨基酸殘基(即，使具有堿性側鏈的氨基酸置換為具有芳香族側鏈的氨基酸)。氨基酸取代可以是保守性或非保守性的。另外，氨基酸取代可以位于ClVl視黃醛結合袋、一個或多個ClVl細胞內環結構域和/或視黃醛結合袋或細胞內環結構域兩者中。
[0050]相應地，本文提供在嵌合多肽的VChRl部分的整個視黃醛結合袋的關鍵位置上具有特定氨基酸取代的ClVl嵌合光活化蛋白。在一些實施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸殘基Ε122上具有突變。在一些實施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸殘基Ε162上具有突變。在其它實施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID Ν0:1的氨基酸殘基Ε162和Ε122兩者上具有突變。在一些實施方案中，所公開的突變型ClVl嵌合蛋白各自可以具有可用于使響應于光的動物細胞的膜去極化的具體特性和特征。
[0051]C1V1-E122突變型多肽
[0052]本文提供在動物細胞質膜上表達的本文所公開的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個或多個氨基酸殘基經歷過氨基酸取代同時保留了 Civi活性(即，能夠催化動物細胞響應于光活化的去極化)，并且其中突變可以是在對應于SEQ ID Ν0:1的E122(C1V1-E122)的谷氨酸殘基上。在一些實施方案中，所述C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E122上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對光的敏感性增加、對特定波長的光的敏感性增加、和/或相對于在E122上不具有突變的ClVl嵌合光活化蛋白調控細胞質膜的極化狀態的能力增加。在一些實施方案中，突變可以是保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，在氨基酸殘基E122上的突變可以是突變為蘇氨酸(C1V1-E122T)。在其它實施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的序列在沒有信號肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端轉運信號。在一些實施方案中，所述轉運信號可以通過連接子連接至C1V1-E122突變型嵌合光活化蛋白。所述連接子可以包含5 個、10 個、20 個、30 個、40 個、50 個、75 個、100 個、125 個、150 個、175 個、200 個、225 個、250個、275個、300個、400個、或500個氨基酸中的任一長度。所述連接子可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，所述轉運信號可以來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述轉運信號可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0053]在其它實施方案中，當用光照射細胞時，C1V1-E122嵌合蛋白能夠介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，光可以是綠光。在其它實施方案中，光的波長可以在約540nm至約560nm之間。在一些實施方案中，光的波長可以為約546nm。在其它實施方案中，當用紅光照射細胞時，C1V1-E122嵌合蛋白可以介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，紅光的波長可以為約630nm。在一些實施方案中，當用紫光照射細胞時，C1V1-E122嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，當用波長為405nm的光照射細胞時，嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞、肌肉細胞、或干細胞。在一個實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，動物細胞可以進一步包含在細胞的質膜上表達的第二光活化蛋白。在一些實施方案中，當用光照射細胞時，第二光活化蛋白可以能夠介導細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以是 NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 或 GtR3。
[0054]C1V1-E162突變型多肽
[0055]本文提供在動物細胞質膜上表達的本文所公開的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個或多個氨基酸殘基經歷過氨基酸取代同時保留Civi活性(即，能夠催化動物細胞響應于光活化的去極化)，其中突變可以是在對應于SEQ ID N0:1的E162(C1V1-E162)的谷氨酸殘基上。在一些實施方案中，C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E162上引入SEQID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對光的敏感性增加、對特定波長的光的敏感性增加、和/或相對于在E162上不具有突變的ClVl嵌合光活化蛋白調控細胞質膜的極化狀態的能力增加。在一些實施方案中，突變可以是保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，在氨基酸殘基E162上的突變可以是突變為蘇氨酸(C1V1-E162T)。在其它實施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID NO:5中所示的序列在沒有信號肽的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端轉運信號上。在一些實施方案中，轉運信號可以通過連接子連接至C1V1-E162突變型嵌合光活化蛋白。連接子可以包含5個、10個、20個、30個、40個、50個、75個、100個、125個、150個、175個、200個、225個、250個、275個、300個、400個、或500個氨基酸中的任一長度。連接子可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，轉運信號可以來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，轉運信號可以包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
[0056]在其它實施方案中，當用光照射細胞時，C1V1-E162嵌合蛋白能夠介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，光可以是綠光。在其它實施方案中，光的波長可以在約540nm至約535nm之間。在一些實施方案中，光的波長可以為約542nm。在其它實施方案中，光的波長可以為約530nm。在一些實施方案中，當用紫光照射細胞時，C1V1-E162嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，當用波長為405nm的光照射細胞時，嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，C1V1-E162嵌合蛋白可以進一步包含C末端突光蛋白。在一些實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞、肌肉細胞、或干細胞。在一個實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，動物細胞可以進一步包含在細胞的質膜上表達的第二光活化蛋白。在一些實施方案中，當用光照射細胞時，第二光活化蛋白可以能夠介導細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。在一些實施方案中，相對于缺乏E162上的突變的ClVl蛋白或相對于其它光活化陽離子通道蛋白，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有加速的光循環。在一些實施方案中，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E162上的突變的ClVl蛋白或相對于其它光活化陽離子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍的光循環，包括所述倍數在內。
[0057]C1V1-E122/E162雙重突變型多肽
[0058]本文提供在動物細胞質膜上表達的本文所公開的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一個或多個氨基酸殘基經歷過氨基酸取代同時保留Civi活性(即，能夠催化動物細胞響應于光活化的去極化)，其中突變可以是在對應于SEQ ID N0:1的E122和E162(C1V1-E122/E162)的谷氨酸殘基上。在一些實施方案中，C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白可以包含在氨基酸E122和E162上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白對光的敏感性增加、對特定波長的光的敏感性增加、和/或相對于不具有E122和E162上的突變的ClVl嵌合光活化蛋白調控細胞質膜的極化狀態的能力增加。在一些實施方案中，突變可以是保守性`氨基酸取代。在一些實施方案中，突變可以是非保守性氨基酸取代。在一些實施方案中，突變可以是保守性和非保守性的氨基酸取代兩者。在一些實施方案中，在氨基酸殘基E122和E162上的突變均可以是突變為蘇氨酸(C1V1-E122T/E162T)。在其它實施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:7中所示的序列在沒有信號肽序列的情況下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含與SEQ ID N0:7中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它實施方案中，C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白可以融合C末端轉運信號上。在一些實施方案中，轉運信號可以通過連接子連接至C1V1-E122/E162突變型嵌合光活化蛋白。連接子可以包含5個、10個、20個、30個、40個、50個、75個、100個、125個、150個、175個、200個、225個、250個、275個、300個、400個、或500個氨基酸中的任一長度。連接子可以進一步包含熒光蛋白，例如但不限于:增強型黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、或青色熒光蛋白。在一些實施方案中，轉運信號可以來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，轉運信號可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。[0059]在其它實施方案中，當用光照射細胞時，C1V1-E122/E162嵌合蛋白能夠介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，光可以是綠光。在其它實施方案中，光的波長可以在約540nm至約560nm之間。在一些實施方案中，光的波長可以為約546nm。在一些實施方案中，當用紫光照射細胞時，C1V1-E122/E162嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，當用波長為405nm的光照射細胞時，嵌合蛋白可能不能介導細胞中的去極化電流。在一些實施方案中，相對于缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對于其它光活化陽離子通道蛋白，當被曝露于紫光時C1V1-E122/E162嵌合蛋白可以展現出較低程度的活化。在一些實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞、肌肉細胞、或干細胞。在一個實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，動物細胞可以進一步包含在細胞的質膜上表達的第二光活化蛋白。在一些實施方案中，當用光照射細胞時，第二光活化蛋白可以能夠介導細胞中的超極化電流。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0,eNpHr3.0,eNpHr3.1或GtR3。在一些實施方案中，相對于缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對于其它光活化陽離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變型光活化嵌合蛋白可以具有減少的鈍化。在一些實施方案中，與缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白相比或相對于其它光活化陽離子通道蛋白，C1V1-E122/E162突變型光活化嵌合蛋白可以鈍化約 15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、或30%中的任一者，包括所述數據在內。在一些實施方案中，C1V1-E122/E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E122/E162上的突變的ClVl蛋白或相對于其它光活化陽離子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、或10倍的光循環，包括所述倍數在內。
[0060]增強型細胞內轉運氨基酸基序
[0061]本公開內容提供通過添加一個或多個增強向哺乳動物細胞的質膜的轉運的氨基酸序列基序而對細胞中表達的光活化嵌合蛋白進行修飾。具有來源于進化上較低等生物的組分的光活化嵌合蛋白可能不能由哺乳動物細胞表達或耐受，或當在哺乳動物細胞中高水平表達時可能展現出亞細胞定位障礙。因此，在一些實施方案中，在細胞中表達的嵌合光活化蛋白質融合至一個或多個氨基酸序列基序，所述氨基酸序列基序選自由以下組成的組:信號肽、內質網(ER)輸出信號、膜轉運信號、以及N末端高爾基(golgi)輸出信號。增強光活化嵌合蛋白向哺乳動物細胞的質膜的轉運的一個或多個氨基酸序列基序可以融合至光活化蛋白的N末端、C末端、或N末端和C末端兩者。任選地，光活化蛋白和一個或多個氨基酸序列基序可以由連接子分開。在一些實施方案中，通過添加增強蛋白質向細胞質膜的轉運的轉運信號(ts)來修飾光活化嵌合蛋白。在一些實施方案中，轉運信號來源于人向內整流鉀通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些實施方案中，轉運信號包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV.可以增強光活化蛋白向細胞的質膜轉運的另外的蛋白質基序描述于美國專利申請號12/041，628中，所述專利申請以引用的方式全部并入本文。在一些實施方案中，嵌合蛋白中的信號肽序列被缺失或取代為來自不同蛋白質的信號肽序列。
_2] 動物細胞、非人動物、以及腦切片[0063]本文提供包含本文所公開的光活化嵌合蛋白的細胞。在一些實施方案中，細胞是動物細胞。在一些實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:3的突變型C1V1-E122T蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:5的突變型C1V1-E162T蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N07的突變型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞、肌肉細胞、或干細胞。在一個實施方案中，動物細胞可以是神經元細胞。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。
[0064]本文還提供包含在動物的細胞的細胞膜上表達的本文所公開的光活化嵌合蛋白的非人動物。在一些實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:3的突變型C1V1-E122T蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N0:5的突變型C1V1-E162T蛋白。在其它實施方案中，動物細胞包含對應于SEQ ID N07的突變型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些實施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的動物是以轉基因方式表達所述光活化嵌合蛋白。在其它實施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的動物已通過病毒用攜帶光活化蛋白的載體(如，但不限于腺病毒載體)進行了轉染。
[0065]本文提供來自非人動物的活腦切片，所述活腦切片包含在這些切片中的細胞的細胞膜上表達的本文所描述的光活化嵌合蛋白。在一些實施方案中，腦切片是來自以轉基因方式表達本文所描述的光活化嵌合蛋白的非人動物。在其它實施方案中，腦切片是來自已通過病毒用攜帶所述光活化蛋白的載體(如，但不限于腺病毒載體)轉染的非人動物。在一些實施方案中，腦切片是冠狀腦切片。在一些實施方案中，腦切片具有約100 μ m、約150 μ m、約 200 μ m、約 250 μ m、約 300 μ m、約 350 μ m、約 400 μ m、約 450 μ m、或約 500 μ m 中的任一厚度，包括所述在內，包括在這些數值之間的任何厚度。
`[0066]分離的多核苷酸
[0067]本文提供分離的ClVl多核苷酸，所述分離的ClVl多核苷酸編碼本文所描述的例如具有ClVl多肽的至少一種活性的任何嵌合多肽。本公開內容提供分離的、合成的、或重組的多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6或SEQ IDNO: 8的核酸在至少約10個，例如至少約15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、75 個、100 個、150 個、200 個、250 個、300 個、350 個、400 個、450 個、500 個、550 個、600 個、650個、700個、750個、800個、850個、900個、950個、或1000個核苷酸的區域上具有至少約 70%,例如至少約 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 或完全(100%)序列同一性的核酸序列。
[0068]本公開內容特別提供編碼ClVl和/或其突變型變異體的核酸。例如，本公開內容提供分尚的核酸分子，其中所述核酸分子編碼:(1)包含與SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(2)包含與 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(3)包含與SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(4)包含與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽。
[0069]啟動子和載體
[0070]本公開內容還提供包含上述核酸的表達序列盒和/或載體。適合的是，編碼本公開內容的嵌合蛋白的核酸可操作地連接至啟動子。啟動子是本領域眾所周知的。在宿主細胞中起作用的任何啟動子都可以用于表達本公開內容的ClVl和/或其任何變異體。有大量適用于驅動ClVl嵌合蛋白或其變異體在特定動物細胞中表達的啟始控制區或啟動子并且是本領域的技術人員所熟悉的。可以使用幾乎任何能夠驅動這些核酸的啟動子。
[0071]具體來說，在希望在興奮性神經細胞中重組表達ClVl嵌合蛋白的情況下，可以使用人鈣調素依賴性蛋白激酶IIa (CaMKIIa)啟動子。在其它實施方案中，可以將延長因子Ia(EF-1a)啟動子與Cre誘導性重組AAV載體聯合用于小白蛋白-Cre轉基因小鼠來使表達ClVl嵌合蛋白靶向抑制性神經元。
[0072]本文還提供包含編碼ClVl嵌合多肽或其任何變異體的本文所公開的多核苷酸的載體。可以根據本發明施用的載體還包括包含編碼當從載體的多核苷酸中轉錄時將引起光活化嵌合蛋白在靶動物細胞的質膜上積聚的RNA(例如，RNA1、核酶、miRNA、siRNA)的多核苷酸的載體。可以使用的載體包括，但不限于:慢病毒載體、HSV載體、以及腺病毒載體。慢病毒包括但不限于:HIV-1、HIV-2、SIV、FIV以及EIAV。慢病毒可以是具有其它病毒的包膜蛋白的假型病毒，所述其它病毒包括但不限于:VSV、狂犬病病毒、Mo-MLV、桿狀病毒以及埃博拉病毒(Ebola)。可以使用本領域中的標準方法來制備此類載體。
[0073]在一些實施方案中,載體是重組AAV載體。AAV載體尺寸相對較小的DNA病毒，所述DNA病毒可以穩定和位點特 異性的方式整合至它們感染的細胞的基因組中。所述AAV載體能夠感染一系列細胞而不會誘導對細胞生長、形態學或分化的任何影響，并且它們似乎不參與人病理學。AAV基因組已進行了克隆、測序和表征。所述AAV基因組涵蓋約4700個堿基并且在每個末端包含具有約145個堿基的反向末端重復(ITR)區，其用作病毒的復制起點。基因組的其余部分分為承載衣殼化功能的兩個必需區域:基因組的左邊部分，所述左邊部分包含參與病毒基因的病毒復制和表達的rep基因；和基因組的右邊部分，所述右邊部分包含編碼病毒的衣殼蛋白的cap基因。
[0074]AAV作為基因療法的載體的應用已在近年來得到快速發展。野生型AAV可以用相對高的滴度感染分裂的或未分裂的細胞、或哺乳動物(包括人)的組織，并且還可以整合至人細胞中的特定位點(在染色體19的長臂上)(Kotin, R.M.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2211-2215，1990) (Samulski, R.J 等，EMBO J.10:3941-3950，1991，所述參考文獻的公開內容由此以引用的方式全部并入本文)。沒有rep和cap基因的AAV載體失去位點特異性整合的特異性，但仍然可以介導外源基因的長期穩定表達。AAV載體以兩種形式存在于細胞中，其中一種是染色體外的游離基因；另一種被整合至染色體中，其中前者作為主要的形式。此外，迄今為止尚未發現AAV與任何人疾病相關，也沒有觀察到整合引起生物學特征發生任何變化。在文獻中報道了十六種血清型AAV，分別命名為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及 AAV16，其中 AAV5是最初從人中分離出來的(Bantel-Schaal 和 H.zur Hausen.1984.Virologyl34:52-63)，而AAV1-4和AAV6均是在腺病毒的研究中發現的(Ursula Bantel-Schaal, Hajo Delius以及 Harald zur Hausen.J.Virol.1999, 73:939-947)。
[0075]可以使用本領域中的標準方法來制備AAV載體。任何血清型的腺相關病毒都是適合的(參見，例如 Blacklow, “Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison 編著(1988)的第 165-174 頁；Rose, Comprehensive Virology3:1, 1974 ；P.Tattersall “TheEvolution of Parvovirus Taxonomy，，于Parvoviruses(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RMLinden, CR Parrish 編著)第 5-14 頁，Hudder Arnold, London, UK(2006);以及 DEBowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus，，(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RM Linden, CR Parrish編著)第 15-23 頁，Hudder Arnold, London, UK (2006),所述參考文獻的公開內容由此以引用的方式全部并入本文)。用于純化載體的方法可以見于例如美國專利號 6566118、6989264 和 6995006 以及名稱為“Methods for Generating HighTiter Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors” 的 W0/1999/011764,所述專利文獻的公開內容以引用的方式全部并入本文。雜交載體的制備描述于例如PCT申請號PCT/US2005/027091中，所述申請的公開內容以引用的方式全部并入本文。使用來源于AAV的載體用于在活體外和活體內轉移基因已有描述(參見例如，國際專利申請公布號91/18088 和 W093/09239 ;美國專利號 4，797，368,6, 596，535 和 5，139，941，全部所述專利文獻均以引用的方式全部并入本文)。這些公布描述了 rep和/或cap基因被缺失并且置換為相關基因的各種AAV來源的構建體；以及使用這些構建體用于在活體外(轉移至培養細胞中)或活體內(直接轉移 至生物體中)轉移相關基因。根據本發明的復制缺陷型重組AAV可以通過將含有側接有兩個AAV反向末端重復(ITR)區的相關核酸序列的質粒和帶有AAV衣殼化基因(rep和cap基因)的質粒共轉染至用人輔助病毒(例如腺病毒)感染的細胞系中來制備。然后，通過標準的技術來純化所產生的AAV重組體。
[0076]在一些實施方案中，使供本發明方法使用的載體衣殼化成病毒粒子(例如AAV病毒粒子，包括但不限于 AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl 1、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及AAV16)。因此，本發明包括包含本文所描述的任何載體的重組病毒粒子(重組是因為它包含重組多核苷酸)。產生所述粒子的方法在本領域中是已知的，并且描述于美國專利號6，596，535中。
[0077]關于本文所描述的動物細胞，應理解可以對神經細胞、心臟細胞、或干細胞施用一種或多種載體。如果使用多于一種載體，應理解它們可以同時或在不同的時間里施用至動物細胞。
[0078]本發明的方法
[0079]本文提供用于通過在存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元中表達本文所描述的光活化嵌合蛋白而選擇性地使那些神經元去極化的方法。在一些實施方案中，第一光活化蛋白(如本文所公開的那些)可以在興奮性神經元中表達，而第二光活化蛋白可以在抑制性神經元中表達。在一些實施方案中，在興奮性神經元中表達的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神經元中表達的第二光活化蛋白的波長的光活化。在一些實施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人動物或在來自非人動物的活腦切片中表達。[0080]在其它實施方案中，提供用于鑒別選擇性地抑制通過在存在于相同神經回路的興奮性或抑制性神經元中表達本文所描述的光活化嵌合蛋白而引起的那些神經元的去極化的化合物的方法。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以在興奮性神經元中表達，而第二光活化蛋白可以在抑制性神經元中表達。在一些實施方案中，在興奮性神經元中表達的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神經元中表達的第二光活化蛋白的波長的光活化。在一些實施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人動物或在來自非人動物的活腦切片中表達。
[0081]用于選擇性地改變存在于相同微回路中的神經元中的E/Ι平衡的方法
[0082]在一些方面中，提供用于選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，其中所述第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化，其中所述第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時被去極化。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ IDNO: 11 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID勵:13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。關于其它光活化陽離子通道的公開內容的更多信息可見于美國專利申請公布號2007/0054319 ;美國專利申請號61/410，704 ;以及國際專利申請公布號W02010/056970中，所述專利文獻各自的公開內容由此以引用的方式全部并入。
[0083]在其它方面中，提供用于選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經元中表達第一光活化蛋白；并且在抑制性神經元中表達第二光活化蛋白，其中第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時，被獨立地去極化，并且其中第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時，被獨立地去極化。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的蛋白。在其它實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸 序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。
[0084]在一些實施方案中，可以通過綠光來活化第一光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過波長為約560nm的光來活化第一光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過紅光來活化第一光活化蛋白。在另一個實施方案中，可以通過波長為約630nm的光來活化第一光活化蛋白。在其它實施方案中，可以通過紫光來活化第二光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過波長為約405nm的光來活化第二光活化蛋白。在其它實施方案中，可以通過綠光來活化第二光活化蛋白。在一些實施方案中，通過光脈沖來活化光活化蛋白，所述光脈沖可以具有約I毫秒(ms)、約2ms、約3ms、約4ms、約5ms、約6ms、約7ms、約8ms、約9ms、約 10ms、約 15ms、約 20ms、約 25ms、約 30ms、約 35ms、約 40ms、約 45ms、約 50ms、約 60ms、約70ms、約 80ms、約 90ms、約 100ms、約 200ms、約 300ms、約 400ms、約 500ms、約 600ms、約 700ms、約800ms、約900ms、約I秒、約1.25秒、約1.5秒、或約2秒中的任一持續時間，包括所述數值在內，包括在這些數值之間的任何時間。在一些實施方案中，通過光脈沖來活化光活化蛋白，所述光脈沖的光功率密度可以為約0.05mff mm2、約0.1mff mm2、約0.25mff mm2、約0.5mffmm 2、約 0.75mff mm 2、約 ImW mm 2、約 2mW mm 2、約 3mW mm 2、約 4mW mm 2、約 5mW mm 2、約 6mWrnnT2、約 7mW rnnT2、約 8mW mnT2、約 9mW mnT2、約 10mW mnT2、約 IlmW mnT2、約 12mW mnT2、約 13mWmnT2、約 14mW mnT2、約 mW mnT2、約 16mW mnT2、約 17mW mnT2、約 18mW mnT2、約 19mW mnT2、約 20mWmm2、約 21mW mm2、約 22mW mm2、約 23mW mm2、約 24mW mm2、或約 25mW mm2 中的任一者，包括所述數值在內，包括這些數值之間的任何值。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，抑制性和興奮性神經元可以是在活的非人動物中。在其它實施方案中，抑制性和興奮性神經元可以是在來自非人動物的腦切片中。
[0085]用于鑒別選擇性地改變存在于相同微回路中的神經元中的E/Ι平衡的化合物的述
[0086]在一些方面中，提供用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元的去極化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波長的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，或用具有第二波長的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化；(b)測量響應于選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)或測量響應于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC) ；(c)使興奮性神經元或抑制性神經元與化合物接觸；(d)測量興奮性突觸后電位(EPSP)或測量抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使興奮性神經元或抑制性神經元與化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經元的去極化。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第一光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些方面中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID ΝΟ:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，第二光活化蛋白可以包含與 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些實施方案中，化合物可以是組合化學文庫中的成員。在其它實施方案中，所述方法進一步包括測定化合物以確定它是否不利地影響心臟組織的功能或哺乳動物的心臟動作電位。
[0087]在一些實施方案中，可以通過綠光來活化第一光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過波長為約560nm的光來活化第一光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過紅光來活化第一光活化蛋白。在另一個實施方案中，可以通過波長為約630nm的光來活化第一光活化蛋白。在其它實施方案中，可以通過紫光來活化第二光活化蛋白。在一個實施方案中，可以通過波長為約405nm的光來活化第二光活化蛋白。在一些實施方案中，可以通過光脈沖來活化光活化蛋白，所述光脈沖可以具有約I毫秒(ms)、約2ms、約3ms、約4ms、約5ms、約6ms、約 7ms、約 8ms、約 9ms、約 10ms、約 15ms、約 20ms、約 25ms、約 30ms、約 35ms、約 40ms、約45ms、約 50ms、約 60ms、約 70ms、約 80ms、約 90ms、約 100ms、約 200ms、約 300ms、約 400ms、約500ms、約600ms、約700ms、約800ms、約900ms、約I秒、約1.25秒、約1.5秒、或約2秒中的任一持續時間，包括所述數值在內，包括在這些數值之間的任何時間。在一些實施方案中，可以通過光脈沖來活化光活化蛋白，所述光脈沖的光功率密度可以為約0.05mff mm2、約0.1mffmnT2、約 0.25mff mnT2、約 0.5mff mnT2、約 0.75mff mnT2、約 ImW mnT2、約 2mW mnT2、約 3mW mnT2、約 4mW mnT2、約 5mW mnT2、約 6mW mnT2、約 7mW mnT2、約 8mW mnT2、約 9mW mnT2、約 IOmW mnT2、約llmff mm2、約 12mW mm2、約 1`3mW mm2、約 14mW 1111]12、約碰 mm2、約 16mW mm2、約 17mW mm2、約 18mW mnT2、約 19mW mnT2、約 20mW mnT2、約 21mW mnT2、約 22mW mnT2、約 23mW mnT2、約 24mWmnT2、或約25mW mnT2中的任一者,包括所述數值在內，包括這些數值之間的任何值。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的興奮性神經元。在其它實施方案中，興奮性神經元可以是錐體神經元。在一些實施方案中，神經元細胞可以是位于非人動物的前額葉皮質中的抑制性神經元。在其它實施方案中，抑制性神經元可以是小白蛋白神經元。在一些實施方案中，抑制性和興奮性神經元可以是在活的非人動物中。在其它實施方案中，抑制性和興奮性神經元可以是在來自非人動物的腦切片中。
[0088]示例性實施方案
[0089]本公開內容涉及光活化嵌合體視蛋白，所述光活化嵌合體視蛋白當在膜表達時改變膜電壓。雖然本公開內容不必限制于這些背景，但可以通過使用這些背景和其它背景對實施例進行討論來理解本公開內容的不同方面。
[0090]本公開內容的不同實施方案涉及經過修飾以供在細胞膜(包括哺乳動物細胞)中表達的光活化視蛋白。所述視蛋白來源于兩種不同的視蛋白(團藻視紫紅質通道蛋白(VChRl)和萊茵衣藻視紫紅質通道蛋白(ChRl))的組合。所述視蛋白可以適用于以高于它所來源的任一個別視蛋白的速率水平表達。
[0091]在某些更具體的實施方案中，ChRl/VChRl嵌合體(ClVl)的遺傳序列主要是VChRl。VChRl序列中與轉運相關的部分置換為來自ChRl的同源序列。
[0092]不同實施方案涉及針對添加轉運信號以促進在哺乳動物細胞中的表達的修飾。
[0093]本公開內容的某些方面針對ClVl的進一步修飾型式。例如，某些實施方案包括ClVl的突變E162T，實驗表明所述突變E162T提供了加速的光循環(例如，幾乎3倍)。
[0094]本公開內容的不同實施方案涉及使對神經回路的時間、空間和/或細胞類型特異性控制與可測量的指標相關的光遺傳學系統或方法。光遺傳學系統使用多種視蛋白(包括ClVl和/或ClVl變異體)來確保對神經回路的多個部分進行控制。例如，不同的指標或癥狀可能與神經病癥相關。光遺傳學系統靶向患者體內的神經回路用于對其進行選擇性控制。光遺傳學系統涉及對患者的與神經病癥相關的指標或癥狀進行監測。以此方式，光遺傳學系統可以提供關于神經回路、其功能和/或神經病癥的詳細信息。
[0095]與本文所討論的實施方案一致，特定實施方案涉及使用多種視蛋白來研究和探測病癥。其它實施方案涉及對表型和內在表型的鑒別和/或研究。其它實施方案涉及治療靶標的鑒別。
[0096]本公開內容的方面針對在快速時間尺度上人工誘導病癥/疾病病況。基于關于加速的光循環的特征，使用視蛋白(如C1V1)可能特別有用。此外，某些實施方案允許用于可逆的疾病病況，這可以特別適用于建立用于測試和/或用于測試治療對展現出疾病病況時和沒有展現出疾病病況時的相同動物的作用的基線/控制點。使用視蛋白(如C1V1)允許使用光源對細胞進行控制。ClVl對光有反應，從而引起細胞的膜電位變化。去除光并且隨后停止活化ClVl允許細胞返回至它的基線狀態。存在各種其它的可能性，本文更詳細地討論了一些所述可能性。
[0097]本公開內容的不同方面針對ClVl視蛋白的E122T突變。在本公開內容的某些實施方案中，相對于未突變的視蛋白，E122T突變使ClVl或其變異體的最大吸收移向紅光光
-1'TfeP曰。
[0098]本公開內容的不同實施方案涉及經過修飾以供在哺乳動物細胞中表達并且相對于ChR2，綠光光譜中的最大吸收得到遷移的視蛋白。ClVl視蛋白來源于視蛋白的組合，并且以高于它所來源的任一視蛋白的速率表達。視蛋白ClVl來源于團藻視紫紅質通道蛋白(VChRl)和萊茵衣藻視紫紅質通道蛋白(ChRl)。所得到的視蛋白ClVl以及其變異體在530nm與546nm之間的波長下具有最大吸收。
[0099]本公開內容的某些方面針對ClVl的進一步修飾型式。例如，某些實施方案包括突變E122T，所述突變E122T使ClVl的最大吸收移向紅光光譜。其它修飾可以包括另一突變E162T，實驗表明除了由E122T突變提供紅移之外，所述另一突變E162T提供了加速的光循環。
[0100]在一些實施方案中，提供來源于VChRl并且轉運序列置換為來自ChRl的同源序列的跨膜蛋白。在一些實施方案中，分子進一步包括突變E122T。在其它實施方案中，分子進一步包括E162T和E122T上的突變。在某些實施方案中，分子響應于綠光而活化離子通道。在一個實施方案中，分子的最大光吸收為約546nm。在另一個實施方案中，分子的最大光吸收為約535nm。
[0101]在一些實施方案中，提供一種動物細胞,所述動物細胞包含:表達對紅光可響應的離子通道的整合外源分子；來源于VChRl并且包括其置換為來自ChRl的同源序列的跨膜轉運序列的外源分子。在一些實施方案中，外源分子進一步包括E122T。在其它實施方案中，響應于分別具有405nm和560nm波長的光，細胞的神經放電比率為約14%至94%。在其它實施方案中，分別響應于具有405nm和560nm波長的光，細胞的神經放電比率為約11%至72%。
[0102]本公開內容的其它示例實施方案涉及使用雜交ChRl/VChRl嵌合體，所述雜交ChRl/VChRl嵌合體完全不包含ChR2序列，來源于不能單獨良好表達的兩種視蛋白基因并且在本文中稱為C1V1。本公開內容的實施方案還涉及通過添加來源于KiJ.1通道的膜轉運信號而改進VChRl的膜靶向。與ChR2相比，由表達VChRl-EYFP的培養神經元得到的共焦圖像揭示細胞內蛋白的比例較大；因此，使用來源于U I通道的膜轉運信號(ts)來改進VChRl的膜靶向。與VChRl-EYFP相比，這種VChRl-ts_EYFP的膜靶向稍微有所增強；然而，從表達VChRl-ts-EYFP的培養海馬神經元中記錄到的平均光電流僅稍微大于VChRl-EYFP的平均光電流。因此，本公開內容的實施方案涉及通過將螺旋更換為來自其它ChR的相應螺旋而修飾的VChRl。例如，在螺旋I和螺旋2置換為來自ChRl的同源區段的兩個嵌合體中發現了穩定的改進。發現無論剪接位點是在螺旋2與螺旋3之間的細胞內環中(在ChRl殘基Alal45上)或是在螺旋3內(在ChRl殘基Trp 163上)，所得到的嵌合體均穩定地表達并且顯示出類似增強的光電流和光譜特性。這種結果是出人意料的，因為ChRl僅具有弱表達并且不容易整合至大多數哺乳動物宿主細胞的膜中。
[0103]本公開內容的特定方面涉及適合于神經科學的微生物視蛋白基因，從而允許在完整哺乳動物腦內的特定細胞類型中使光脈沖列轉變為毫秒時間尺度的膜電位變化(例如，視紫紅質通道蛋白(ChR2)、團藻視紫紅質通道蛋白(VChRl)以及鹽細菌視紫紅質(NpHR))。ChR2是來源于單細胞綠藻萊茵`衣藻的視紫紅質。本文所使用的術語“視紫紅質”是包含至少兩個構建嵌段(即視蛋白和共價結合的輔因子，通常是維生素A醛(視黃醛))的蛋白質。視紫紅質ChR2來源于衣藻基因組中的視蛋白通道視蛋白_2(Chop2)，最初命名為衣藻視蛋白-4(Cop4)。一種去極化視紫紅質通道蛋白(ChR2)的時間特性包括活化和去活的快速動力學，從而給予精確定時的動作電位列的產生。針對尋求長時間尺度活化的應用，發現可以使視紫紅質通道蛋白的通常快速的解離動力學變慢。例如，視紫紅質通道蛋白的某些實施例應用lmW/mm2的光持續希望去極化的幾乎全部時間，這可能不太合乎需要。
[0104]本文的大多數討論是針對ChR2。除非另外指明，否則本公開內容包括許多類似的變異體。實例包括但不限于:Chop2、ChR2-310、Chop2_310、以及團藻視紫紅質通道蛋白(VChRl)。為了對VChRl進一步詳細說明，可以參考〃Red-shifted optogeneticexcitation:a tool for fast neural control derived from Volvox carteri, 〃NatNeurosc1.2008年6月，11 (6):631-3.Epub2008年4月23日，所述參考文獻的公開內容以引用的方式全部完全地并入本文。在其它實施例中，可以對其它視蛋白分子進行類似的修飾。例如，可以對ChR2或VChRl變異體進行修飾/突變。此外，修飾的變異體可以與光活化離子泵組合使用。
[0105]本公開內容的實施方案包括天然存在的序列的相對次要氨基酸變異體。在一個例子中，變異體與天然存在的序列的蛋白質序列的同源性大于約75%。在其它變異體中，同源性大于約80%。其它的變異體具有大于約85%、大于90%、或甚至高達約93%至約95%或約98%的同源性。在此上下文中的同源性意指序列相似性或同一性，其中同一性是優選的。可以使用序列分析中已知的標準技術來確定這種同源性。本公開內容的實施方案的組合物包括本文所提供的蛋白質和核酸序列，包括與所提供的序列的同源性高于約50%、與所提供的序列的同源性高于約55%、與所提供的序列的同源性高于約60%、與所提供的序列的同源性高于約65%、與所提供的序列的同源性高于約70%、與所提供的序列的同源性高于約75%、與所提供的序列的同源性高于約80%、與所提供的序列的同源性高于約85%、與所提供的序列的同源性高于約90%、或與所提供的序列的同源性高于約95%的變異體。
[0106]如本文所使用，“刺激靶細胞”通常被用來描述對細胞的特性進行修飾。例如，靶細胞的刺激物可以造成細胞膜特性的變化，這可以引起靶細胞的去極化或極化。在一個具體的例子中，靶細胞是神經元，并且刺激物通過促進或抑制神經元的脈沖(動作電位)的產生來影響脈沖的傳遞。
[0107]關于對光活化視蛋白的進一步詳細描述，可以參考Deisseroth等，名稱為^Optically-Based Stimulation of Target Cells and Modifications Thereto, 〃的PCT公布號W02010/056970，所述專利文獻以引用的方式全部完全地并入本文。
實施例
[0108]實施例1:嵌合視紫紅質通道蛋白變異體ClVl的開發
[0109]在本實施例中，尋求將容許在皮質切片中以及在活動物實驗中活體內驅動皮質E/I升高和監測Y振蕩的工具，其中具有三個關鍵特性:1)實現劑量-響應研究的效力高得多；2)低脫敏作用，以允許E/Ι平衡的階梯狀變化；以及3)紅移激發，以允許類似地驅動相同制劑中的不同的群。
[0110]這些實驗最初嘗 試使用VChRl，所述VChRl顯示紅移和降低的脫敏作用14，但先前研究表明表達VChRl的細胞中的光電流較小(-100-150pA14)，并且不能在下游細胞(未示出)中引發穩定的突觸活性。實際上，當首先嘗試在細胞中表達VChRl時，僅觀察到小的光電流(圖1A)，這與先前的發現一致。與VChRl-EYFP相比，添加來源于Kir2.1通道的膜轉運信號以便產生VChRl-1s-EYFP僅實現了不高的光電流增強的趨向(圖1B)。然而，要注意在ChR2中，用來自ChRl的同源區域置換跨膜區段增強了膜靶向并且增強了光電流，假設在VChRl的螺旋與來自其它ChR的相應螺旋之間的類似系統性交換可以類似地引起HEK細胞中的膜表達增強。
[0111]材料和方法
[0112]通過重疊延伸PCR將野生型或人的密碼子優化的視紫紅質通道蛋白-1與人密碼子改適的VChRl (GenBankTM保藏編號A⑶70142.1)融合來產生嵌合視紫紅質通道蛋白變異體C1V1。通過重疊PCR產生ClVl剪接變異體。變異體一包含ChRl的前145個氨基酸和VChRl的氨基酸102至316。變異體二包含ChRl的前162個氨基酸和VChRl的氨基酸119 至 316。將所得到的嵌合 PCR 片段克隆至 pECFP-Nl(Clonetech, Mountain View, CA)和慢病毒表達載體中的CaMKIIa啟動子下。膜轉運信號來源于Kir2.1通道。通過對編碼序列和剪接位點進行測序來確認突變。對于AAV介導的基因遞送，將視蛋白-EYFP融合物連同CaMKIIa啟動子一起亞克隆到pAAV2_MCS載體的修飾型式中。通過以相反的方向在不相容1x位點對(1xP和lox2722)之間克隆視蛋白-EYFP序列盒以便產生在延長因子Ia(EF-1a)啟動子控制下的雙f 1xed倒置開放閱讀框(DlO)來實現Cre-依賴性視蛋白表達。所有構建體可從戴瑟羅斯實驗室(Deisseroth Lab) (www.0ptogenetics.0rg)獲得。
[0113]在補充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Biochrome,柏林,德國)、以及l%(w/w)青霉素(penicillin)/鏈霉素(str印tomycin)的杜爾貝科氏最低必需培養基中培養HEK293細胞。將細胞以0.175X106個細胞/毫升的濃度接種到蓋玻片上，并且補充I μ M全反式維生素A醛。用Fugene6(羅氏(Roche)公司，曼海姆，德國)來進行瞬時轉染，并且在20至28小時后做記錄。通過常規的全細胞膜片鉗來記錄瞬時轉染的HEK293細胞中的光電流。外部溶液包含[mM]:140NaCl、2CaCl2、2MgCl2、2KCl、10HEPES(pH7.2)。內部溶液包含[mM]:110NaCl、10EGTA、2MgCl2、lCaCl2、5KCl、10HEPES(使用 CsOH 或 HCl 將 pH 調至 7.2)。用 P-97 型拉針儀(micropipette puller)(薩特儀器公司(Sutter Instrument C0.),諾瓦托，加拿大)將膜片吸管從具有1.5ΜΩ至2ΜΩ電阻的分血器微管(Hecht-Assistant,桑德海姆，德國)中拉出。用EPC7(HEKA，Elektronik GmbH，蘭布雷希特，德國)放大器進行HEK細胞的全細胞膜片鉗。以20kHz對類似數據進行取樣，用Digidatal440 (分子儀器公司(Molecular Devices),福斯特市，CA)進行數字化并且使用pClampl0.1軟件(分子儀器公司，福斯特市，CA)來顯示。為了記錄波長相關性，將來自Polychrome V單元(TILLPhotonics公司，普拉內格，德國)的光導管安裝在奧林巴斯1X70顯微鏡的表皮發光端口上。為了將光反射進入物鏡中，使用分光鏡(70%R/30%T)從而在蓋玻片上在470nm下產生大約I X IO22個光子HT2iT1的最終光子密度。為了記錄作用光譜，使用僅50%的光強度。用Tillvision軟件(TILL Photonics,普拉內格,德國)與pClamp軟件同步來對polychromeV單元進行控制。
[0114]結果
[0115]有趣的是，發現了嵌合體的最穩定的改進，在所述嵌合體中螺旋I和螺旋2置換為來自ChRl的同源物(圖1C至圖1D)。在培養HEK293細胞中測試了用于膜靶向的兩種嵌合ChRl-VChRl通道和光電流大小。第一種嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Alal45之后的第二細胞內環中，并且第二種嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Trpl63之后的螺旋三內(圖1C)。然而，這兩種變異體在HEK293細胞中接近同等良好地表達(圖1D)，在培養的神經元中第二變異體更穩定地表達(圖1E)，并且與VChRl-EYFP相比顯示大為增強的峰值光電流(888±128pA，n=ll個細胞;ρ〈0.0005)(圖1B)。相對于ChR2，作用光譜峰保持穩定的紅移(表1 ;圖1F)，并且嵌合體的離子選擇性類似于先前針對ChR2和VChRl所報道的離子選擇性(圖1G)。將Kir2.1轉運序列添加至這種雜交體中傾向于進一步增加光電流(1104±123pA，n=12 個細胞；與 VChRl-EYFP 相比 ρ〈0.0005，與 C1V1-EYFP 相比 ρ=0.23 ；圖1B ;表1至表2)。所得到的雜交ChRl/VChRl嵌合體完全不包含ChR2序列，明顯來源于不能單獨地良好表達的兩種視蛋白基因，并且在本文被稱為ClVl (圖1A、圖1H)。
[0116]實施例2 =ClVl的光電流動力學的優化
[0117]這種紅移的視蛋白的快速去活特性28將是最大時間以及與由位于向著可見光譜藍光端的波長活化的其它視蛋白光譜分離所需要的。然而，發現由CIVl-ts-EYFP顯示的光電流展現出比ChR2慢>10倍的衰變，并且甚至比原始VChRl慢的衰變(圖2A ;針對CIVl-ts-EYFP (n=4)和 VChRl-EYFP (n=5)，T去活分別為 156 ± 12ms 和 132 ± 12ms ;表 1)，潛在地排除了使用ClVl用于要求迅速放電速率的應用。為了校正ClVl的光電流動力學，使用已知的結構模型22’28(圖1H)搜尋發色團區域，用于具有光循環動力學更快、鈍化減小以及藍光吸收減少的突變。接下來，基于螺旋2中富含谷氨酸的基序的研究將谷氨酸-122突變為蘇氨酸，顯示這種突變減小了鈍化3。
[0118]材料和方法
[0119]通過定點誘變(安捷倫科技(Agilent Technologies),帕洛阿爾托,CA)在質粒中產生ClVl載體的所有點突變。膜轉運信號來源于U.1通道。通過對編碼序列和剪接位點進行測序來確認突變。
[0120]結果
[0121]ChETA同源性突變E162T28明顯使光循環加速了幾乎3倍(T_58±4.7ms，n=7個細胞；圖2A，表1)。出人意料地，鑒于ChR2或其它微生物視蛋白中的類似突變引起紅移28’29，在ClVl中這種突變使作用光譜在不希望的方向上移動，藍移至530nm(圖1F ;表1)。與ChR2去活46%相比，C1V1-E122T僅鈍化26% (圖2B，表1);另外，光譜進一步紅移至546nm(圖1F，表1)并且顯示ClVl作用光譜有問題的藍肩峰明顯消失。最后，在雙重突變體E122T/E162T中，電流的鈍化甚至低于在E122T突變體中的鈍化，并且與E162T相比光循環仍然更快(Ti活34±4.9ms,n=7個細胞；圖2A，圖2C，表1)，同時保留紅移并且不存在作用光譜的藍肩峰。此外，當E122突變體大幅減少光電流振幅(圖2D)時，雙重突變體恢復原始CIVl-ts所特有的極高電流。因此，在雙重突變體、轉運增強的ClVl嵌合體中保留個別突變體的多種出人意料和有用的特性。
[0122]表1:ChR2、VChRl以及ClVl變異體的光譜/動力學特性。
[0123]使用峰值活化波長下的2ms光脈沖，在HEK細胞中記錄峰值活化波長。使用最大活化波長下的2ms光脈沖，在培養海馬神經元中記錄去活動力學(τ 和峰值光電流。為了鑒別出用于與ChR2組合活化的最優變異體，在HEK細胞中記錄405nm和560nm下的響應百分比。使用300ms光脈沖來記錄光電流的脫敏作用，從而對峰值光電流(Iiic)向穩定狀態的衰變進行定量。
【權利要求】
1.一種動物細胞，其包含在細胞膜上表達的光活化蛋白，其中所述蛋白: 是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； 對光可響應；并且 當用光照射所述細胞時，能夠介導所述細胞中的去極化電流。
2.如權利要求1所述的動物細胞，其中所述蛋白進一步在位于所述嵌合光響應性蛋白的第二跨膜螺旋與第三跨膜螺旋之間的細胞內環結構域中包含置換，其中所述細胞內環結構域的至少一部分置換為來自所述ChRl的相應部分。
3.如權利要求2所述的動物細胞，其中所述細胞內環結構域的所述部分置換為來自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸殘基A145的相應部分。
4.如權利要求2所述的動物細胞，其中所述蛋白進一步在所述嵌合光響應性蛋白的第三跨膜螺旋中包含置換，其中所述第三跨膜螺旋的至少一部分置換為ChRl的相應序列。
5.如權利要求4所述的動物細胞，其中所述細胞內環結構域的所述部分置換為來自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸殘基W163的相應部分。
6.如權利要求1所述的動物細胞，其中所述嵌合蛋白包含與SEQID NO:1中所示的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
7.如權利要求6所述的動物細胞，其進一步包含SEQID N0:1的氨基酸殘基E122和/或E162上的突變。`
8.如權利要求7所述的動物細胞，其中氨基酸E122上的所述突變是突變為蘇氨酸。
9.如權利要求7所述的動物細胞，其中氨基酸E162上的所述突變是突變為蘇氨酸。
10.如權利要求1所述的動物細胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
11.如權利要求1所述的動物細胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
12.如權利要求1所述的動物細胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
13.如權利要求1至12中任一項所述的動物細胞，其中所述蛋白進一步包含C末端膜轉運信號。
14.如權利要求13所述的動物細胞，其中所述C末端膜轉運信號包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
15.如權利要求13或14所述的動物細胞，其中所述膜轉運信號是通過連接子連接至所述蛋白的C末端上。
16.如權利要求1至15中任一項所述的動物細胞,其中所述蛋白進一步包含選自由以下組成的組的C末端熒光蛋白:EYFP、GFP、CFP、以及RFP。
17.如權利要求1至16中任一項所述的動物細胞,其中所述動物細胞選自由以下組成的組:神經元細胞、肌肉細胞、以及干細胞。
18.如權利要求1至17中任一項所述的動物細胞，其進一步包含在所述細胞膜上表達的第二光活化蛋白。
19.如權利要求18所述的動物細胞，其中所述第二光活化蛋白是當用光照射所述細胞時能夠介導所述細胞中的超極化電流的蛋白。
20.如權利要求19所述的動物細胞，其中所述第二光活化蛋白選自由以下組成的組:NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 以及 GtR3。
21.—種細胞群，其包含如權利要求1至20中任一項所述的細胞。
22.—種非人動物，其包含如權利要求1至20中任一項所述的細胞。
23.—種腦組織切片，其包含如權利要求1至20中任一項所述的細胞。
24.一種分離的多核苷酸，其包含編碼在細胞膜上表達的光活化蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；對光可響應；并且當用光照射所述細胞時，能夠介導所述細胞中的去極化電流。
25.如權利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含與編碼SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列至少95%相同的序列。
26.如權利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。
27.如權利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列。
28.如權利要求24所述的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼SEQID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。
29.—種表達載體,其包含如權利要求25至28所述的任何多核苷酸。
30.如權利要求29所述的表達載體，其中所述表達載體是病毒載體。
31.如權利要求30所述的表達載體，其中所述病毒載體選自由以下組成的組:AAV載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、HSV載體、以及慢病毒載體。
32.—種使用如權利要求1至20中任一項所述的細胞的方法，所述方法包括用光來活化光活化蛋白。
33.如權利要求32所述的使用細胞的方法，所述方法包括用紅光來活化所述光活化蛋白。
34.如權利要求32所述的使用細胞的方法，所述方法包括用綠光來活化所述光活化蛋白。
35.一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，其中所述第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時被去極化；或選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化，其中所述第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時被去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
36.一種選擇性地使存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元去極化的方法，所述方法包括:在興奮性神經元中表達第一光活化蛋白；并且在抑制性神經元中表達第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白當被曝露于具有第一波長的光時被獨立地去極化，并且其中所述第二光活化蛋白當被曝露于具有第二波長的光時被獨立地去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
37.如權利要求35或36所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ IDNO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由綠光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
39.如權利要求35至38中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是在活的非人動物中。
40.如權利要求35至39中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是在來自非人動物的活腦切片中。
41.如權利要求35至40中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是來自前額葉皮質。
42.如權利要求35至41中任一項所述的方法，其中所述興奮性神經元包含錐體神經元，并且所述抑制性神經元包含小白蛋白神經元。
43.一種用于鑒別選擇性地抑制存在于相同微回路中的興奮性或抑制性神經元的去極化的化合物的方法，所述方法包括: (a)用具有第一波長的光選擇性地使包含第一光活化蛋白的興奮性神經元去極化，或用具有第二波長的光選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是來源于來自強壯團藻的VChRl和來自萊茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置換為ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； (b)測量響應于選擇性地使包含第一光活化蛋白的所述興奮性神經元去極化的興奮性突觸后電位(EPSP)，或測量響應于選擇性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神經元去極化的抑制性突觸后電流(IPSC)； (c)使所述興 奮性神經元或所述抑制性神經元與化合物接觸；以及 (d)測量所述興奮性突觸后電位(EPSP)或測量所述抑制性突觸后電流(IPSC)以確定使所述興奮性神經元或所述抑制性神經元與所述化合物接觸是否選擇性地抑制任一神經元的去極化。
44.如權利要求43所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含與SEQID NO: 1、SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含與 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由綠光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
46.如權利要求43至45中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是在活的非人動物中。
47.如權利要求43至46中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是在來自非人動物的活腦切片中。
48.如權利要求43至47中任一項所述的方法，其中所述抑制性和興奮性神經元是來自前額葉皮質。
49.如權利要求43至48中任一項所述的方法，其中所述興奮性神經元包含錐體神經元，并且所述抑制性神經元包含小白蛋白神經元。
50.如權利要求43至49中任一項所述的方法，其中所述化合物是組合化學文庫中的成員。
51.如權利要求43至50中任一項所述的方法，其進一步包括在心臟組織上測定所述化合物以確定所述化合物是`否不利地影響心臟動作電位。
【文檔編號】C12N15/00GK103492564SQ201180061697
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年11月4日 優先權日:2010年11月5日
【發明者】K·戴瑟羅斯, O·伊扎爾, L·芬諾, P·黑格曼, M·普里格 申請人:斯坦福大學托管董事會