液滴中的碎片化的基因組dna的分析的制作方法
【專利摘要】分析基因組DNA的方法。可以獲得包含靶的基因組DNA。基因組DNA可以有意地被碎片化以產生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產生器以產生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以對液滴進行測定以確定靶的水平。在一些實施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的流速產生，或其任何組合。
【專利說明】液滴中的碎片化的基因組DNA的分析
[0001]優先權申請的交叉引用
[0002]本申請要求享有下述在先申請的優先權:2010年11月I日提交的美國臨時專利申請系列號61/409，106 ;和2010年12月22日提交的美國臨時專利申請系列號12/976，827，在2011年9月8日以美國專利申請公布第2011/0217712A1號被公布。兩項專利申請基于所有目的在此通過引用全文并入本文。
[0003]額外資料的交叉引用
[0004]本申請基于所有目的在此通過引用全文并入下述資料:2006年5月9日授權的美國專利第7，041，481號；2010年7月8日公布的美國專利申請公布號2010/0173394A1 ；2011年9月29日公開的PCT專利申請號TO2011/120024 ；以及Jos印hR.Lakowicz,PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (第二版，1999)。
[0005]
[0006]許多生物醫學應用依賴于核酸靶樣品的高通量測定。例如，在研究和臨床應用中，使用靶特異性試劑的高通量遺傳測試可以為藥物發現、生物標志物發現和臨床診斷以及其他方面提供核酸靶的準確且精確的量化。
[0007]乳液為革新靶的高通量測定帶來了相當大的希望。乳化技術可以產生大量的用作生物化學反應的獨立的反應室的含水液滴。例如，含水樣品(如，20微升)可以被分配成液滴(如，20，000顆液滴，各一納升)以允許對每一顆液滴進行靶的單獨測試。
[0008]含水液滴可以被懸浮在油中以產生油包水乳液(W/0)。可以用表面活性劑穩定乳液以減少加熱、冷卻和輸送期 間液滴的聚結，由此使得能夠進行熱循環。因此，乳液已經被用于進行使用聚合酶鏈式反應(PCR)對液滴中的核酸靶分子的單拷貝擴增。由于檢測到液滴中存在單個分子的祀的能力，因而使得能夠進行數碼測定(digital assay)。
[0009]在示例性的基于液滴的數碼測定中，樣品被分配成有限稀釋的靶的一組液滴(即，一些液滴不包含靶分子)。如果靶分子被無規分布在液滴中，那么泊松分布描述了基于液滴中的給定平均靶濃度來準確發現液滴中的0、1、2、3或更多個靶分子的幾率。相反，可以從在液滴中發現給定數目的分子的幾率計算液滴中(且因而在樣品中)的靶分子的濃度。
[0010]未發現靶分子的幾率和發現一個或多個靶分子的幾率的估計值可以在數碼測定中進行測量。在二進制方法中，每一顆液滴可以被測試以確定液滴是否是陽性的并包含至少一個靶分子，或是陰性的且不包含靶分子。在液滴中未發現靶分子的幾率可以通過所測試的液滴是陰性的比例(“陰性比例”)被近似得出，而發現至少一個靶分子的幾率通過所測試的液滴是陽性的比例(“陽性比例”)被近似得出。然后可以在泊松算法中利用陽性比例或陰性比例的值來計算液滴中靶的濃度。在其他情形中，數碼測定可以產生大于二進制的數據。例如，測定可以測量每一顆液滴中存在多少個靶分子，且分辨率大于陰性(O)或陽性(> O)(如，O、I或> I個分子；0、1、2或> 2個分子；或類似的)。
[0011]為了在不同樣品的基于液滴的DNA測定中兼具高通量和準確性，液滴應該被快速產生且具有均勻的尺寸(即，單分散性的液滴)。然而，樣品組分可能干擾液滴與主體的樣品相分離的能力，尤其是當提高了液滴產生的頻率時。因此，所形成的液滴的尺寸，或甚至完全形成液滴的能力可能從樣品到樣品是變化的，從而削弱了測定的可靠性。需要新的方法來提供以較高的產生頻率可靠而一致地產生液滴。
[0012]
[0013]本公開內容提供了一種分析基因組DNA的方法。可以獲得包含靶的基因組DNA。基因組DNA可以有意地(volitionally)被碎片化以產生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產生器以產生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以對液滴進行數碼測定以確定靶的水平。在一些實施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的樣品流速產生，或其任何組合。
[0014]附圖簡沭
[0015]圖1是闡釋了根據本公開內容的各方面的分析基因組DNA的示例性方法的流程圖。
[0016]圖2是由液滴產生器在四種不同驅動壓力的每一種下處理三種不同樣品的照片得到的圖的矩陣。
[0017]圖3是不包含基因組DNA或包含被消化(EcoRI)或未被消化的基因組DNA (Raji或Coriell)的樣品的液滴體積作為液滴產生頻率的函數而繪制的圖。
[0018]圖4是圖3的樣品的液滴體積作為樣品流速的函數而繪制的圖。
[0019]圖5是圖3的樣品的最大延伸作為液滴產生頻率的函數而繪制的圖。
[0020]圖6是圖3的樣品的最大延伸作為樣品流速的函數而繪制的圖。
[0021]迸述
[0022]本公開內容提供了一種分析基因組DNA的方法。可以獲得包含靶的基因組DNA。基因組DNA可以有意地被碎片化以產生碎片化的DNA。碎片化的DNA可以穿過液滴產生器以產生含有碎片化的DNA的含水液滴。可以對液滴進行測定以確定靶的水平。在一些實施方案中，液滴可以包含每微升至少約5納克濃度的基因組DNA，液滴可以以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生，液滴可以具有每滴小于約10納升的平均體積，液滴可以以每秒大于約50納升的流速產生，或其任何組合。
[0023]如本文公開的，分析液滴中的基因組DNA的方法具有比基于液滴的其他方法相當大的優勢。優勢可以包括以更高的頻率產生液滴、具有更高的單分散性、具有更大的DNA負載量和/或具有來自基因組DNA的顯著更弱的干擾。
[0024]在下面的部分中描述了本公開內容的這些和其他方面:(I)基因組DNA分析的示例性方法的概述，(II)液滴產生測試的示例性數據以及(III)優選的實施方案。
[0025]1.基因組DNA分析的示例性方法的概述
[0026]圖1顯示闡釋了分析基因組DNA的示例性方法20的流程圖。所呈現的步驟可以按照任何合適的順序且按照任何合適的組合進行。
[0027]可以獲得基因組DNA，以22標示。可以從任何合適的生物體獲得DNA，生物體諸如哺乳動物(如人類、小鼠、大鼠、猴等)、非哺乳動物的脊椎動物、無脊椎動物、酵母或真菌、植物、原生動物、細菌或類似物。可以通過任何合適的方法獲得DNA，方法諸如市購、以禮物接受、通過從細胞或流體提取獲得、以臨床樣品接受或類似方法。DNA可以以相對高分子量的形式獲得，諸如具有至少約IO4UO5或IO6千道爾頓以及其他(如，具有至少約25、50、100,200,500或1000千堿基的平均長度)的分子量。
[0028]在產生液滴之前，可以碎片化基因組DNA，以24標示。碎片化可以是意志行為，即有意地進行的。碎片化通常包括顯著減小基因組DNA的分子量的任何程序，諸如通過切割或斷裂DNA鏈。碎片化可以將平均分子量和/或長度減小任何合適的量，諸如至少約5、10、20,50或100倍以及其他的。碎片化基因組DNA的示例性方法包括用限制酶(如，具有4、
5、6或8個核苷酸識別位點的酶、以及其他)消化。靶可以不包含限制酶的識別位點以避免靶分子的任何裂解。限制酶消化可以被進行完全或可以是部分消化。可選擇地或另外，基因組DNA的含水樣品可以被加熱以碎片化DNA。碎片化DNA的示例性加熱可以在至少95°C的溫度下進行至少約10、15、20或30分鐘以及其他時間。在其他情形中，DNA可以通過剪切、超聲處理、霧化、輻射或類似方法被碎片化。
[0029]基因組DNA可以包含靶，通常是待測試的所感興趣的序列。可以進行基因組DNA的碎片化而基本上不會破壞靶，這意味著通過碎片化方法，基因組DNA中不到一半的靶序列被破壞(如斷裂或切割)。
[0030]可以產生包含碎片化的DNA的液滴，以26標示。液滴可以由一個或多個液滴產生器中的每一個按順序產生。碎片化的DNA可以穿過至少一個液滴產生器以產生液滴。通常，碎片化的DNA被布置在含水樣品中，且含水樣品與不混溶的連續相被穿過液滴產生器以形成包含碎片化的DNA且被布置在連續相中的含水液滴。液滴產生器和可能合適的乳液相的進一步的方面描述在交叉引用下所列出的文獻中，這些文獻通過引用在此并入，尤其是2010年7月8日公布的美國專利申請公布號2010/0173394A1 ;2011年9月29日公布的PCT 專利申請號 W02011/120024。
[0031]液滴可以具有任何合適的尺寸。例如，液滴可以具有小于約lyL、100nL、10nL、lnL、100pL、10pL或IpL以及其他的平均體積。可選擇地或另外，液滴可以具有大于約10fL、100fL、lpL、IOpL或IOOp L以及其他的平均體積。在一些情形中，液滴可以具有約IpL到IOOnLUpL到10nL、或0.1到IOnL以及其他的平均體積。液滴可以是單分散性的。
[0032]液滴可以包含任何合適濃度的碎片化的DNA。例如，碎片化的DNA可以以至少約
0.1、0.2、0.5、l、2、5、10、20、50ng/yL以及其他的濃度被布置在液滴中。在一些情形中，濃度可以是約0.1-50或0.2-20ng/ μ L。碎片化DNA允許更高的DNA負載量被結合到液滴中。碎片化的DNA可以以平均每顆液滴小于約2個基因組等價物存在。靶可以以平均每顆液滴小于約2個分子存在。
[0033]液滴可以以任何合適的液滴產生頻率形成，諸如至少約IO、20、50、100、200、500或1，OOOHz (液滴/秒)以及其他的。通常，液滴產生頻率與被產生的液滴的尺寸負相關，且較小的液滴允許較高的液滴產生頻率。
[0034]用于形成液滴(且包含碎片化的DNA)的含水樣品可以以任何合適的流速穿過液滴產生器和/或被轉化成液滴。可能合適的示例性流速包括至少約1、5、10、20、50、100、200,500,1, 000,5, 000或10，OOOnL/秒以及其他的。通常，樣品流速與被產生的液滴的尺寸正相關，且較大的液滴允許較高的流速。
[0035]上面所列出的液滴體積、DNA濃度、液滴產生頻率以及流速的示例性值(或范圍)可以以任何合適的組合被組合。[0036]可以對液滴進行測定，以28標示。測定可以是檢測液滴中的單獨靶分子的數碼測定。數碼測定可以包括擴增靶分子，諸如通過PCR或連接酶鏈式反應以及其他的。數碼測定還可以包括檢測來自液滴的熒光。測定還可以包括用泊松算法確定液滴中靶的水平(如濃度)。
[0037]11.液滴產生測試的示例性數據
[0038]此部分呈現了由采用或未采用碎片化的基因組DNA的液滴產生測試的示例性數據；參見圖2-6。
[0039]在微流體設備中的液滴產生可以取決于樣品行進至液滴產生器的流速和產生液滴的頻率。在高流速時，樣品流可以噴射入不混溶的連續相中，不再產生液滴。在產生速率接近噴射限值時，在產生液滴之前，樣品開始延伸得更深入出口通道中。此延伸長度可以用于了解一組產生條件與噴射限值的接近度。
[0040]圖2顯示了由在四種不同的驅動壓力的每一種下且因而不同流速下處理三種不同的含水樣品32-36的液滴產生器30的照片得到的圖片的矩陣。三種樣品是(a)不包含DNA的對照樣品32 (無模板的PCR緩沖液)、(b)未被消化的且具有高分子量(MW)的人類基因組DNA的含水樣品34(Raji，18.75ng/yL)以及(c)已經用限制酶消化且具有降低的分子量的人類基因組DNA的含水樣品36 (Raji, 18.75ng/ μ L)。四種驅動壓力(1、2、3和4)是施加在液滴產生器的下游的負(真空)壓力且以每平方英寸磅(psi)表示，且Ipsi等于約6.9千帕。真空水平可以控制樣品流速、總流速以及液滴產生頻率。
[0041]液滴產生器30可以通過包括樣品入口通道38、至少一個或至少一對油入口通道40、42以及出口通道44的通道網絡形成。入口通道38將含水樣品32、34或36的主體水相(bulk aqueous phase) 46輸送至液滴產生器。入口通道40、42將連續相48 (如，帶有表面活性劑的油)輸送至液滴產生器。出口通道44將連續相48中的液滴50輸送遠離通道交匯點52。
[0042]上排顯示了不包含 基因組DNA的對照樣品32的液滴產生。液滴50是約InL且在不同真空水平下尺寸變化不大。
[0043]中排顯示了包含未消化的基因組DNA的樣品34的液滴產生。僅在所測試的最低的真空水平(Ipsi)下發生基因組DNA極大地損害液滴產生。即使在此最低水平，存在主體水相46大量延伸通過通道交匯點52,由箭頭54標示,且液滴50較大。在較高的真空水平(如，Ipsi與2-4psi相比)和流速下，無液滴產生，原因是樣品流噴射進入出口通道44中，由箭頭56標示，不會破裂成液滴。因此，人類基因組DNA的存在可以強烈地干擾液滴產生，且可能要求使用較低的DNA濃度、流速和液滴產生頻率。因此，樣品處理可能相當緩慢。此夕卜，乳液中的靶陽性液滴的頻率可能被顯著減少(由于較低的DNA濃度)，這將需要分析更多的液滴以獲得所確定的靶水平的同樣的置信度。
[0044]下排顯示了由含有與樣品34相同濃度(每單位體積的質量)的基因組DNA的樣品36的液滴產生，但在DNA已經用限制酶被消化成較短的碎片之后。在本文所顯示的壓力(和流速下)，呈碎片化形式的基因組DNA并未被檢測到損害液滴產生。樣品產生液滴50，這類似于缺乏DNA的對照樣品32。
[0045]進行了另外的研究來定量測量產生真空、樣品流速、液滴產生頻率、出口通道中的速度、液滴尺寸以及液滴產生期間的最大樣品延伸之間的關系。所使用的含水樣品是Spectral Dye Buffer (與圖2中相同的對照樣品，但沒有DNA聚合酶)、Raji人類基因組 DNA(Loftstrand Laboratories)( “Raji”)和 19205 人類 DNA(Coriell Institute)(“Corell”)。DNA樣品是未消化的或用限制酶EcoRI消化過的。用在NEB#4緩沖液中的20U/ μ L濃度的EcoRI (New England biolabs)進行DNA消化，且基因組DNA的最終濃度是200ng/y L。將混合物在37°C下溫育I小時，然后稀釋到不同的最終濃度。
[0046]圖 3-6 的圖顯示了由 Master Mix (無 DNA)、18.75ng/ μ L 的 EcoR1-消化的 RajiDNA、18.75ng/y L 的 EcoR1-消化的 Coriell 19205 DNA、18.75ng/μ L 的未消化的 Raji DNA以及18.75ng/ μ L的未消化的Coriell 19205DNA的樣品進行的液滴產生試驗的結果。圖3顯示了樣品的液滴體積作為液滴產生頻率的函數而繪制的圖。圖4顯示了樣品的液滴體積作為樣品流速的函數而繪制的圖。圖5顯示了樣品的最大延伸作為液滴產生頻率的函數而繪制的圖。圖6顯示了圖3的樣品的最大延伸作為樣品流速的函數而繪制的圖。
[0047]對于未消化的人類基因組DNA，在發生噴射之前，僅非常低的液滴產生頻率或樣品流速是可能的。例如，對于Coriell 19205 DNA，最大值是60Hz和83nL/秒。對于RajiDNA，最大值是120Hz和162nL/秒。然而，即使低于這些限值，所產生的液滴具有比不存在DNA時高的體積，且產生伴有長得多的樣品延伸進入輸出通道中。
[0048]圖還顯示了對于相同濃度的消化過的DNA，DNA對液滴產生的影響是不可檢測到的。在所測試的任何流速或產生頻率下均未觀察到噴射或長樣品延伸，且液滴體積與不存在DNA的樣品的體積相同。
[0049]這些結果顯示了液滴產生在存在未消化的人類DNA時受到強烈損壞，但在用限制酶消化后沒有受到損壞。
[0050]II1.優選的實施方案
[0051]此部分以一系列索引的段落描述了本公開內容的優選的實施方案。這些實施方案不應該限制本公開內 容的整個范圍。
[0052]A.一種分析基因組DNA的方法，包括:(i)獲得包含靶的基因組DNA ; (ii)有意地碎片化所述基因組DNA以產生碎片化的DNA ； (iii)使所述碎片化的DNA穿過至少一個液滴產生器以產生含有所述碎片化的DNA的含水液滴；以及(iv)對所述液滴進行數碼測定以確定所述靶的水平。
[0053]B.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
[0054]C.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
[0055]D.段落A的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
[0056]E.段落A至D中任一段的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
[0057]F.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積且包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
[0058]G.段落A的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
[0059]H.段落A的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
[0060]1.段落F的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
[0061]J.段落F的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
[0062]K.段落G的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
[0063]L.段落H的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
[0064]M.段落L的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
[0065]N.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括用限制酶消化所述基因組DNA的步驟。
[0066]0.段落N的方法，其中所述限制酶以平均每千堿基小于約一次地切割所述基因組DNA。
[0067]P.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括剪切所述基因組DNA的步驟。
[0068]Q.段落A至M中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟包括超聲處理所述基因組DNA的步驟。
[0069]R.段落A至Q中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個拷貝的所述靶。
[0070]S.段落A至R中任一段的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個所述基因組DNA的基因組等價物。
[0071]T.段落A至S中任一段的方法，其中所述碎片化的步驟基本上不破壞所述靶。
[0072]U.段落A至T中任一段的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括擴增所述液滴中的所述靶的步驟。
[0073]V.段落U的方法，其中所述靶通過PCR被擴增。
[0074]W.段落A至V中任一段的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括檢測來自所述液滴的熒光的步驟。
[0075]X.段落A至W中任一段的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括用泊松算法確定所述靶的水平的步驟。
[0076]Y.段落A至X中任一段的方法，其中所述液滴具有約0.1到10納升的平均體積。
[0077]Z.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)獲得包含每微升至少約5ng濃度的DNA的樣品；(ii)有意地碎片化所述DNA以產生碎片化的DNA ；以及(iii)使所述樣品穿過液滴產生器以產生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生且具有小于約10納升的平均體積。
[0078]Al.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括:(i)獲得包含基因組DNA的樣品；(ii)有意地碎片化所述DNA`以產生碎片化的DNA;以及(iii)使所述樣品穿過液滴產生器以產生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生且具有小于約10納升的平均體積，其中所述基因組DNA的濃度為，如果所述穿過的步驟在不碎片化所述DNA的相同條件下采用所述基因組DNA進行則干擾液滴產生。[0079]上面提出的公開內容可以包括多項具有獨立功用的不同的發明。雖然本發明中的每一項已經以其優選的形式被公開，但是本文中所公開的且闡釋的其具體的實施方案并不被認為是限制性的意義，原因是許多變化形式是可能的。本發明的主題包括本文公開的不同的要素、特征、功能和/或特性的所有新穎的且非顯而易見的組合和子組合。下面的權利要求特別指出被認為是新穎的且非顯而易見的某些組合和子組合。在特征、功能、要素和/或特性的其他組合和子組合中體現的發明可以在要求此申請或相關申請的優先權的申請中得到保護。這樣的權利要求，無論涉及不同的發明還是相同的發明，且無論比初始權利要求的范圍寬、窄、相等還是不同，也都被認為包括在本公開內容的發明主題內。此外，用于所確認的要素的序數標志，諸如第一、第二或第三用于區分要素，且不表明這樣的要素的特定位置或順序，除非另 外具 體陳述。
【權利要求】
1.一種分析基因組DNA的方法，包括: 獲得包含靶的基因組DNA ； 有意地碎片化所述基因組DNA以產生碎片化的DNA ； 使所述碎片化的DNA穿過至少一個液滴產生器以產生含有所述碎片化的DNA的含水液滴；以及 對所述液滴進行數碼測定以確定所述靶的水平。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組 DNA。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積且包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴包含每微升至少約5納克濃度的所述基因組DNA，且其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
9.如權利要求6所述的方法，其中所述基因組DNA被布置在含水樣品中，且其中所述液滴通過所述液滴產生器以每秒大于約50納升的所述含水樣品的流速被產生。
10.如權利要求6所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
11.如權利要求7所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
12.如權利要求8所述的方法，其中所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述液滴具有小于約10納升的平均體積。
14.如權利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括用限制酶消化所述基因組DNA的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述限制酶以平均每千堿基小于約一次地切割所述基因組DNA。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括剪切所述基因組DNA的步驟。
17.如權利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟包括超聲處理所述基因組DNA的步驟。
18.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個拷貝的所述靶。
19.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴包含平均每顆液滴小于約2個所述基因組DNA的基因組等價物。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述碎片化的步驟基本上不破壞所述靶。
21.如權利要求1所述的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括擴增所述液滴中的所述靶的步驟。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述靶通過PCR被擴增。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括檢測來自所述液滴的熒光的步驟。
24.如權利要求21到23中任一項所述的方法，其中所述進行數碼測定的步驟包括用泊松算法確定所述靶的水平的步驟。
25.如權利要求1所述的方法，其中所述液滴具有約0.1到10納升的平均體積。
26.—種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括: 獲得包含每微升至少約5ng濃度的DNA的樣品； 有意地碎片化所述DNA以產生碎片化的DNA ；以及 使所述樣品穿過液滴產生器以產生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生且具有小于約10納升的平均體積。
27.一種將包含DNA的含水樣品分配成液滴的方法，所述方法包括: 犾得包含基因組DNA的樣品； 有意地碎片化所述DNA以產生碎片化的DNA ；以及 使所述樣品穿過液滴產生器以產生包含所述碎片化的DNA的含水液滴，所述液滴以每秒至少約50顆液滴的液滴產生頻率被產生且具有小于約10納升的平均體積， 其中所述基因組DNA是以如果所述穿過的步驟在不碎片化所述DNA的相同條件下進行則干擾液滴產生的濃度。
【文檔編號】C12Q1/68GK103443289SQ201180052831
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年11月1日 優先權日:2010年11月1日
【發明者】凱文·D·奈斯, 艾米·L·海德森, 保羅·W·懷亞特 申請人:伯樂生命醫學產品有限公司