熱穩定性木霉屬纖維素酶的制作方法

熱穩定性木霉屬纖維素酶的制作方法
【專利摘要】本發明描述涉及熱穩定性真菌纖維素酶EGV的組合物和方法，以及具有修飾的木霉屬宿主細胞，該修飾包含用于這個纖維素的表達的核苷酸的中斷或者缺失或者實質上由該中斷或者缺失組成，由此EGV表達得到防止。
【專利說明】熱穩定性木霉屬纖維素酶
[0001]以引用方式并入本文
[0002]本申請要求2010年10月20日提交的系列號為61/394，946的美國臨時申請和2010年10月20日提交的第10188285.0號歐洲專利申請的優先權。
[0003] 前述申請，以及其中引證的或者在它們審查過程中引證的所有文件(“申請引證文件”)以及申請引證文件中引證或者參考的所有文件，以及本文引證或者參考的所有文件(“本文引證文件”)以及本文引證文件中引證或者參考的所有文件，還有關于在本文中或者在以引用方式并入本文的任何文件中提到的任何產品的任何生產商說明書、描述、產品規格和產品單，都以引用方式并入本文，并且可應用于本發明的實施。
【技術領域】
[0004]本發明涉及具有這樣的修飾的木霉屬(Trichoderma)例如里氏木霉(T.reesei)宿主細胞，該修飾包含據以防止或者減少熱穩定性真菌纖維素酶(例如內切葡聚糖酶V(EGV))的表達的中斷或者缺失,或者該修飾實質上由該中斷或者缺失組成，比如,具有這樣的修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細胞，該修飾包含參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷，或者該修飾實質上由該缺失或者中斷組成，該修飾例如是這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區或者用于這個纖維素酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失。這種宿主細胞特別可用于表達不含不需要的纖維素酶活性的熱穩定性多肽。本發明有利地涉及包含和表達這樣的外源核酸分子的木霉屬例如里氏木霉，該核酸編碼目的蛋白，例如編碼疏水蛋白(例如疏水蛋白II)，并具有這樣的修飾，該修飾包含參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷，或者該修飾實質上由該缺失或者中斷組成，由此目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)得到表達，而EGV表達被防止或者減少。例如，該木霉屬修飾可實質上由egl5的缺失或者中斷組成。
【背景技術】
[0005]纖維素和半纖維素是通過光合作用產生的最豐富的植物材料。它們可被多種產生能夠將聚合物底物水解成單體糖類的胞外酶類的微生物(例如細菌、酵母和真菌)降解和用作能源(Aro 等人，(2001)，《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.)，276:24309-14)。
[0006]纖維素酶是水解纖維素(β-1，4-葡聚糖或者β-D-糖苷鍵)而導致葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的形成的酶類。傳統上將纖維素酶分為三大類:內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4) ( “EG”)、外切葡聚糖酶或者纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91; “CBH”)和β -葡糖苷酶(β -D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC 3.2.1.21 ;“BG”) (Knowles 等人，(1987)，TIBTECH5:255-61 ;以及 Schulein，(1988)，《酶學方法》(Methods Enzymol.)，160:234-43)。內切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的無定形部分，以水解低結晶度區域中的內部β -1, 4-糖苷鍵。纖維二糖水解酶從纖維素的還原端或者非還原端水解纖維二糖，并且能夠降解結晶纖維素(Nevalainen 和 Penttila, (1995),《真菌界》(Mycota), 303-319)。纖維二糖水解酶(CBH)在纖維素酶系統中的存在據認為是結晶纖維素的有效溶解所需(Suurnakki等人，(2000)，《纖維素》Cellulose，7:189-209)。β -葡糖苷酶起到從纖維二糖、纖維寡糖和其他葡萄糖苷釋放D-葡萄糖單元的作用(Freer, (1993),《生物化學雜志》(J.Biol.Chem.),268:9337-42)。β -葡糖苷酶還已被證實能催化水解烷基和/或芳基β -D-葡萄糖苷如甲基β -D-葡萄糖苷和對硝基苯基葡萄糖苷以及僅含碳水化合物殘基的糖苷如纖維二糖。[0007]已知纖維素酶由大量細菌、酵母和真菌產生。某些真菌能產生包括外切纖維二糖水解酶或者說CBH型纖維素酶、內切葡聚糖酶或者說EG型纖維素酶和β -葡糖苷酶或者說BG型纖維素酶的完全纖維素酶系統。其他真菌和細菌極少表達或者不表達CBH型纖維素酶。里氏木霉(也稱紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))能表達大量的纖維素酶，包括兩種 CBH,即 CBHI (Ce17a)和 CBHII (Cel6a)，至少八種 EG,即 EGI (Cel7b)、EGII(CeI5a)、EGIII(Cel12a)、EGIV(Cel61a)、EGV(Cel45a),EGVI(CeI74a)、EGVII(Cel61b)和 EGVIII (Cel5b)，和至少五種 BG,即 BGl (Ce13a)、BG2 (Celia)、BG3 (Cel3b)、BG4 (Cel3c)和BG5 (Cellb)。EGIV、EGVI和EGVIII還具有木葡聚糖酶活性。
[0008]在一些情況中，希望使用從里氏木霉獲得的全纖維素酶培養液作為纖維素酶來源，例如用于生物質轉化、紡織品加工、紙張和紙漿處理等。在其他情況中，里氏木霉用作表達經工程改造的纖維素酶、來自其他生物體的纖維素酶或者另外的酶類或者純粹其他蛋白質(例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、結構蛋白等)的優良宿主生物。尤其是在后面這些情況中，可能希望在內源里氏木霉纖維素酶不存在下表達目的蛋白。雖然這可通過缺失內源里氏木霉纖維素酶基因來實現，但由于這些基因為數眾多，使得這種方案費時耗力。
[0009]在本申請中引證或者確認任何文件并不是承認這種文件可作為本發明的現有技術利用。

【發明內容】

[0010]本發明提供與木霉屬例如里氏木霉中存在的熱穩定性纖維素酶有關的組合物和方法，所述組合物例如經修飾的細胞，包括那種經工程改造以表達目的蛋白如疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的細胞。
[0011]在一個方面，本發明提供這樣的木霉屬例如里氏木霉宿主細胞，其包含據以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生的修飾，或者實質上由該修飾組成。
[0012]在又一個方面，本發明提供這樣的木霉屬例如里氏木霉宿主細胞，其包含據以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生的修飾，或者實質上由該修飾組成，其中該修飾實質上由參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷組成，例如這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區或者用于這個纖維素酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失。
[0013]在其中一個實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含據以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生的修飾，或者實質上由該修飾組成，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實質上由該缺失或者中斷組成。
[0014]在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含被中斷的egl5或者實質上由被中斷的egl5組成。
[0015]在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含被缺失的egl5或者實質上由被缺失的egl5組成。[0016]在具體的實施例中，egl5通過同源重組進行缺失。它還可通過同源重組進行中斷。
[0017]在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞通過對包含功能性egl5的親本宿主細胞進行修飾來產生。
[0018]在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含一個或者多個編碼熱不穩定性酶而使該熱不穩定性酶得以表達的內源功能性基因或者核酸分子，或者實質上由所述內源功能性基因或者核酸分子組成；例如該熱不穩定性酶可以是纖維素酶、半纖維素酶或者蛋白酶或者這些酶中的任何兩種或者所有三種。在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉可表達一種或者多種另外的蛋白質，其可以是外切纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶或者β-葡糖苷酶或者這些蛋白質中的任何兩種或者所有三種。
[0019]在一些實施例中，木霉屬例如里氏木霉宿主細胞還包含功能性目的基因或者編碼目的蛋白且讓目的蛋白表達的核苷酸。 [0020]在一些實施例中，目的基因編碼或者目的蛋白是熱穩定性多肽；例如疏水蛋白，如疏水蛋白II。
[0021]在另一個方面，本發明提供在木霉屬例如里氏木霉宿主細胞中產生熱穩定性目的蛋白的方法，該方法包括:將編碼熱穩定性目的蛋白的核酸分子在目的蛋白據以進行體內表達的條件下引入到木霉屬例如里氏木霉宿主細胞中，例如其中目的核酸分子有效連接到用于表達的啟動子或者調節元件；且其中木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含據以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生的修飾或者實質上由該修飾組成，其中該修飾實質上由參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷組成，例如這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區或者用于這個纖維素酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失；例如，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實質上由egl5的缺失或者中斷組成。熱穩定性目的蛋白可以是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。該木霉屬例如里氏木霉可另外包含一個或者多個編碼另外的功能性蛋白的基因或者一個或者多個編碼另外的功能性蛋白的核酸分子，其處于該一個或者多個另外的功能性蛋白據以進行體內表達的條件下，例如其中該一個或者多個核酸分子有效連接到用于表達的啟動子和/或調節元件。該方法還可包括使該細胞的表達產物一包括目的蛋白和任何表達在表達產物中的另外的功能性蛋白在內一經歷足以顯著地滅活所述另外的蛋白質的高溫；其中該高溫不足以滅活熱穩定性目的蛋白且會不足以滅活EGV纖維素酶；其中熱穩定性目的蛋白得以以活性或者功能形式產生，而基本上不存在來自所述另外的蛋白質的活性。
[0022]在另一個方面，本發明提供產生熱穩定性目的蛋白例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的方法，所述方法包括:使從木霉屬例如里氏木霉宿主細胞獲得的表達產物經歷高溫，其中:木霉屬例如里氏木霉宿主細胞包含據以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生的修飾或者實質上由該修飾組成，其中該修飾實質上由參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷組成，例如這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區或者用于這個纖維素酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失；例如，其中該修飾包含egl5的缺失或者中斷或者實質上由egl5的缺失或者中斷組成；并且木霉屬例如里氏木霉可另外包含一個或者多個編碼另外的功能性蛋白的基因或者一個或者多個編碼另外的功能性蛋白的核酸分子，其處于該一個或者多個另外的功能性蛋白據以進行體內表達的條件下，例如其中該一個或者多個核酸分子有效連接到用于表達的啟動子和/或調節元件；其中該高溫足以滅活該一種或者多種另外的功能性蛋白(如果存在的話)，但不足以滅活熱穩定性目的蛋白或者EGV ;由此產生出活性或者功能形式的熱穩定性目的蛋白，而不存在來自所述另外的功能性蛋白的活性。
[0023]前述方法可另外包括將經修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細胞在適合產生目的蛋白質和另外的功能性蛋白(如果存在的話)的培養基中進行溫育。
[0024]前述方法還可包括在使目的蛋白和另外的功能性蛋白(如果存在的話)經歷高溫之前，從經修飾的木霉屬例如里氏木霉宿主細胞分離表達產物(或者蛋白質混合物)。
[0025]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，在本來會天然包含egl5的宿主細胞中中斷掉egl5。
[0026]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，在本來天然包含egl5的宿主細胞中缺失掉egl5。
[0027]因此，在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，被中斷或者缺失的egl5是內源的。
[0028]因此，所述方法可另外包括缺失或者中斷egl5或者以別的方式修飾木霉屬例如里氏木霉，以顯著地減少或者防止熱穩定性EGV多肽的產生，其中該修飾實質上由參與EGV的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷組成，例如這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區或者用于這個纖維素酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失。
[0029]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，egl5通過同源重組進行缺失。它還可通過同源重組進行中斷。
[0030]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質是熱不穩定性蛋白。在一些實施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質可以是纖維素酶、半纖維素酶或者蛋白酶或者這些酶中的任何兩種或者所有三種。在一些實施例中，所述一種或者多種另外的蛋白質可以是外切纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶或者β -葡糖苷酶或者這些蛋白質中的任何兩種或者所有三種。
[0031 ] 在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，目的蛋白由于可逆地可熱變性從而是熱穩定的。
[0032]在任何所述方法的情況中，在具體的實施例中，目的蛋白是疏水蛋白，例如疏水蛋白II。
[0033]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，高溫是90 V或者更高的溫度。在一個有利的實施例中，高溫可以小于約100°c。
[0034]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，暴露于高溫達5分鐘或者更長的時間。
[0035]在任何所述方法的情況中，在一些實施例中，暴露于高溫達60分鐘或者更長的時間。
[0036]在又一個方面，提供通過任何這些方法產生的熱穩定性或者可逆地可熱變性蛋白。
[0037]在一個相關方面，本發明提供從絲狀真菌宿主細胞例如木霉屬(例如里氏木霉)獲得并包含疏水蛋白(例如疏水蛋白II)的發酵液組合物，其中該發酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。例如，從任何前述方法獲得或者可從任何前述方法獲得的基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性的發酵液。因此，在一些實施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在熱不穩定性纖維素酶和/或甘露聚糖酶的存在下產生，并經歷高溫以滅活纖維素酶和/或甘露聚糖酶多肽。
[0038]在一些實施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在這樣的宿主細胞如木霉屬(例如里氏木霉)中產生，該宿主細胞包含據以顯著地減少或者防止纖維素酶和/或甘露聚糖酶的產生的修飾或者實質上由該修飾組成，其中該修飾實質上由參與纖維素酶和/或甘露聚糖酶的表達的核苷酸中的一個或者多個缺失或者中斷組成，例如纖維素酶和/或甘露聚糖酶的編碼基因或者編碼區或者用于纖維素酶和/或甘露聚糖酶的表達的啟動子或者調節元件的中斷或者缺失，由此從產生該疏水蛋白得到(并含有該疏水蛋白)的發酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0039]在一些實施例中，疏水蛋白(例如疏水蛋白II)在這樣的宿主細胞如木霉屬(例如里氏木霉)中產生，該宿主細胞包含據以使宿主細胞缺乏編碼纖維素酶和/或甘露聚糖酶的基因或者核酸分子的修飾或者實質上由該修飾組成，由此從產生該疏水蛋白得到(并含有該疏水蛋白)的發酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性。
[0040]在發酵液實施例中，發酵液可進行濃縮，且還可包含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性以外的多種宿主細胞蛋白質。
[0041]在任何本發明實施例中，目的多肽可以是熱穩定的、熱敏感的或者熱不穩定的。
[0042]本發明方法還涉及控制由本發明的經修飾的木霉屬宿主細胞表達的目的多肽的活性，其中該目的多肽是熱敏感的或者熱不穩定的，其中所述方法可包括使熱敏感性或者熱不穩定性目的多肽以及內源多肽經歷高溫，其中該高溫可足以滅活該內源多肽或者該熱敏感性或者熱不穩定性多肽。在一個有利的實施例中，內源多肽可以是纖維素酶。所述方法還可包括在使熱敏感性或者熱 不穩定性目的多肽經歷高溫之前，使該目的多肽與該目的多肽能夠對其起作用的化合物接觸。所述方法還可包括在使熱敏感性或者熱不穩定性目的多肽經歷高溫之前，使該目的多肽與纖維素酶和該目的多肽能夠對其起作用的一種或者多種化合物接觸。
[0043]本發明方法還涉及控制本發明的發酵液中的目的多肽的活性的方法，其中該目的多肽可以是熱敏感的或者熱不穩定的，其中所述方法可包括使發酵液經歷足以滅活內源多肽和熱敏感性或者熱不穩定性多肽的高溫。在一個有利的實施例中，內源多肽可以是纖維素酶。所述方法還可包括在使發酵液經歷高溫之前，使發酵液與目的多肽能夠對其起作用的化合物接觸。所述方法還可包括在使發酵液經歷高溫之前，使發酵液與纖維素酶和目的多肽能夠對其起作用的一種或者多種化合物接觸。
[0044]本發明還涉及控制從經修飾的木霉屬宿主細胞獲得的組合物中存在的纖維素酶的活性的方法，其中該組合物可包含至少一種EGV之外的纖維素酶，且所述方法可包括使該組合物經歷足以滅活目的多肽的高溫，并且其中在使該組合物經歷高溫后該組合物基本上不含纖維素酶活性。目的多肽可以是熱敏感的或者熱不穩定的。在另一個實施例中，該多肽可以是耐熱的或者熱穩定的。使該組合物經歷高溫可在食品或者飲料中進行。在另一個實施例中，高溫可為小于約100°C。在另一個實施例中，從經修飾的木霉屬宿主細胞獲得的組合物可以是包含疏水蛋白的發酵液。
[0045]因此，本發明的一個目標是不將任何之前知道的產品、制造該產品的工藝或者使用該產品的方法涵蓋在本發明內，從而本 申請人:保留權利并據此公開對任何之前知道的產品、工藝或者方法的棄權。還要指出，本發明不旨在將任何不符合美國專利商標局(USPTO)(美國法典第35卷第112條(35USC § 112)，第一段)或者歐洲專利局(EPO)(歐洲專利公約(EPC)第83條)的書面說明要求和可實施性要求的產品、制造該產品的工藝或者使用該產品的方法涵蓋在本發明的范圍內，從而本 申請人:保留權利并據此公開對任何之前描述的產品、制造該產品的工藝或者使用該產品的方法的棄權。
[0046]應指出，在本公開說明書中特別是在權利要求書和/或段落中，術語“包含”(各種語法形式)可具有美國專利法中賦予它的含義；例如，它可以意指“包括”(各種語法形式)；而術語“實質上由…組成”(各種語法形式)具有美國專利法中賦予它的含義，例如它允許沒有明確敘及的要素，但排除在現有技術中存在的要素或者影響本發明的基本特征或者新特征的要素。
[0047]術語“實質上由…組成”(各種語法形式)旨在具體避免權利要求指示(read on)現有技術所公開或者提示的各單獨實施例或者其任何組合，因為已出乎意料地發現，參與EGV的表達的核苷酸中的缺失或者中斷，例如這個纖維素酶的編碼基因或者編碼區的中斷或者缺失，如egl5的缺失或者中斷，有助于熱穩定性外源多肽例如疏水蛋白(如疏水蛋白II)的表達和/或獲得。
[0048]這些和其他的實施例由以下“【具體實施方式】”(包括附圖在內)公開，或者從以下“【具體實施方式】”(包括附圖在內)顯而易見并被其所涵蓋。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]下文以舉例方式給出、但不旨在使本發明僅局限于所描述的具體實施例的“【具體實施方式】”可以結合附圖得到最好的理解，附圖中:
[0050]圖1 是 pFl (EG5RPyr)的質粒圖。
`[0051]圖2是在中斷egl5后里氏木霉染色體的一部分的圖譜。
[0052]圖3的圖象顯示經過和不經過熱處理的對照里氏木霉培養物和缺失了 egl5的里氏木霉培養物的上清液中存在的纖維素酶活性的量。
[0053]圖4的圖象顯示葡萄糖標準曲線。
[0054]圖5的圖象顯示相比于對照菌株，來自AEG5菌株的上清液中熱穩定性纖維素酶活性失去。
[0055]圖6是在中斷egl5和切除pyr2標志后里氏木霉染色體的一部分的圖譜。
[0056]圖7是攜帶與己糖激酶啟動子融合的sucA基因的片段的3.5kb DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
[0057]圖8是pFIX，的核苷酸序列，pFIX,是包含來自pUC19的復制起點和氨芐青霉素抗性基因以及噬菌體fl復制起點的小質粒(SEQ ID N0:2)。
[0058]圖9由圖9A和9B構成，是基于egl5基因和pyr2基因的已知染色體DNA序列推導出的經中斷的基因(即“中斷盒”)的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。
[0059]圖10 是 egl5 的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)。
[0060]圖11是EGV的氨基酸序列(SEQ ID NO: 33)。
[0061]圖12是載體PTrex3gM(Hfb2)和pTrex8R(Hfb2)的功能性和部分限制圖譜。[0062]圖13A是pTrex3gM(Hfb2)的核苷酸序列。
[0063]圖13B是pTrex8R(Hfb2)的核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0064]在詳細描述本發明組合物和方法之前，為清楚起見定義了以下術語。未定義的術語應當被賦予其在相關領域中使用的普通含義。
[0065]本文所用的“纖維素酶”是從纖維素水解β-1，4_葡聚糖或者β-D-糖苷鍵而導致例如葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖的形成的酶。纖維素酶包含例如內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡糖苷酶等。
[0066]本文所用的“內切葡聚糖酶(EG) ”是主要作用于纖維素纖維的無定形部分以水解低結晶度區域中的內部β -1, 4-糖苷鍵的纖維素酶。
[0067]本文所用的術語“半纖維素酶”和“木聚糖酶”可互換使用，通指能夠水解包含5碳糖的多糖中的糖苷鍵的酶。這種酶包含例如甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶等。
[0068]本文所用的里氏木霉(Trichoderma reesei或者T.reesei)指子囊菌門的一種絲狀真菌。這種生物之前稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。
[0069]本文所用的詞語“里氏木霉EGV纖維素酶”指具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的多肽或者相關多肽。 相關多肽與SEQ ID NO: 33具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或者甚至至少約99%或者更高的氨基酸序列同一性，對纖維素底物具有內切葡聚糖酶活性，并且使用本文描述的測定法測出是熱穩定的。“EGV”在本文中可稱為“EG5”。
[0070]本文使用的詞語“里氏木霉egl5基因”或者“egl5”指編碼本文描述的EGV纖維素酶或者相關多肽的核酸。示例性的egl5的核苷酸序列以SEQ ID NO:32顯示。EGV的氨基酸序列在SEQ ID N0:33中顯示。
[0071]本文使用的關于多肽的術語“熱穩定的(熱穩定性)”，指多肽在經歷預選的高溫達預選的一段時間后能夠保持生物活性。生物活性可以是該多肽的酶活性、結合活性、表面活性性質或者任何其他活性或者性質特征。如果多肽在暴露于預選的高溫達預選的一段時間后保持其原始活性的至少一半，則認為它是熱穩定的。廣義上講，預選的溫度和時間是為顯著地滅活EGV之外的里氏木霉纖維素酶所需的溫度和時間。這些條件可容易地通過測定包含egl5缺失或者實質上由egl5缺失組成的里氏木霉宿主細胞中的纖維素酶活性來確立。
[0072]在一些情況中，如果蛋白質在暴露于至少約70°C、至少約75°C、至少約80°C、至少約85°C、至少約90°C或者甚至至少約95°C的溫度達至少約3分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約15分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘或者甚至至少約60分鐘的時間后保持其生物活性的至少一半(即至少50%)，則認為它是熱穩定的。在一個例子中，預選溫度為約90°C或者更高，預選時間為約5分鐘或者更長。在另一個例子中，預選溫度為約90°C或者更高，預選時間為約60分鐘或者更長。熱穩定性多肽包含在高溫下可逆地變性，使得在所描述的暴露之后恢復其生物活性的至少一半(即至少50%)的多肽。
[0073]本文使用的關于多肽的術語“熱不穩定的(熱不穩定性)”和“非熱穩定的(非熱穩定性)”可互換使用，指多肽在經歷預選的高溫達預選的一段時間后不能夠保持生物活性。生物活性可以是該多肽的酶活性、結合活性、表面活性性質或者任何其他活性或者性質特征。多肽如果在暴露于預選的高溫達預選的一段時間之后失去其原始活性的至少90%、至少95%、至少97%、至少99%或者甚至幾乎100%，則認為它是熱不穩定的。這種溫度和時間剛剛在上文描述，以及在本說明書中別處描述。對熱不穩定性多肽的數目或者類型沒有限制。例子包括但不限于纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、酯酶、過水解酶、植酸酶、漆酶以及其他商業上相關的酶、結合蛋白和結構蛋白。
[0074]本文所用的詞語“目的蛋白”指需要在里氏木霉中表達的EGV之外的多肽。這種蛋白可以是酶、結合蛋白、表面活性蛋白、結構蛋白等。目的蛋白可以是熱穩定的或者熱不穩定的。在指明的情況下，它是熱穩定的。
[0075]本文所用的詞語“基本上無活性”(或者類似詞語)意思是，指定的活性要么在多肽混合物中不可檢測到，要么以不會干擾該混合物的預定用途的量存在。
[0076]本文所用的術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用，指包含通過肽鍵連接的氨基酸殘基的任何長度的聚合物。本文使用氨基酸殘基的常規單字母密碼或三字母密碼。聚合物可為直鏈或支鏈的，其可包含經修飾的氨基酸，并且其可間夾有非氨基酸。所述術語還涵蓋天然修飾或通過干預修飾的氨基酸聚合物；所述干預例如是二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修飾，如與標記組分綴合。在所述定義中還包括(例如)包含一個或多個氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)類似物的多肽，以及本領域中已知的其他修改形式。
[0077]如本文所用，功能上和/或結構上相似的蛋白質認為是“相關蛋白”。這種蛋白質可衍自另外屬和/或種的生物，或者甚至另外類別的生物(例如細菌和真菌)。相關蛋白質還涵蓋通過一級序列分析確定的、通過二級或三級結構分析確定的或通過免疫交叉反應性確定的同源物。
[0078]本文所用的術語“衍生的多肽/蛋白質”是指這樣的蛋白質，其通過將一個或多個氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸`序列中的一個或多個不同位點處置換一個或多個氨基酸、在該蛋白質的一端或兩端或者氨基酸序列中的一個或多個位點處缺失一個或多個氨基酸、和/或在該氨基酸序列中的一個或多個位點處插入一個或多個氨基酸而衍生自另一蛋白質。制備蛋白質衍生物可通過修飾編碼天然蛋白的DNA序列、將DNA序列轉到合適的宿主中以及表達經修飾的DNA序列以形成衍生的蛋白質而實現。
[0079]相關(以及衍生的)蛋白質包括“變體蛋白質”。變體蛋白質由于置換、缺失和/或插入少量的氨基酸殘基而不同于參考蛋白質/親本蛋白質，例如野生型蛋白質。不同的氨基酸殘基的數量可以為一個或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多個氨基酸殘基。變體蛋白質與參考蛋白質享有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或甚至至少約99%或更高的氨基酸序列同一性。變體蛋白質還可在所選的基序、結構域、表位、保守性區域等方面不同于參考蛋白質。
[0080]本文所用的術語“類似序列”指蛋白質內的提供與目的蛋白(即，通常是原始目的蛋白)相似的功能、三級結構和/或保守殘基的序列。例如，在包含α -螺旋或β -片層結構的表位區域中，類似序列中的置換氨基酸優選地保持相同的特定結構。所述術語還指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些實施例中，開發了類似序列，使得置換氨基酸導致變體酶顯示相似或改進的功能。在一些實施例中，所關注蛋白質中氨基酸的三級結構和/或保守性殘基位于目的區段或片段處或其附近。因此，在目的區段或片段包含(例如)α-螺旋或β -片層結構的情況下，置換氨基酸優選地保持該特定結構。
[0081]本文所用的術語“同源蛋白”是指與參考蛋白具有相似的活性和/或結構的蛋白質。這并不意味著各同源物一定在進化上相關因此，該術語的意圖是涵蓋得自不同生物體的相同、相似或相應的酶(即，在結構和功能方面)。在一些實施例中，很希望識別與參考蛋白質具有相似的四級結構、三級結構和/或一級結構的同源物。在一些實施例中，同源蛋白質引起與參考蛋白質相似的免疫應答。在一些實施例中，工程構造出同源蛋白質以制備具有所需活性的酶。
[0082]序列之間同源性的程度可使用本領域中已知的任何合適的方法確定(參見例如Smith 和 Waterman, (1981)，《應用數學進展》(Adv.Appl.Math.) ,2:482 ；Needleman 和ffunsch, (1970),《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol.), 48:443 ;Pearson 和 Lipman, (1988),《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444 ;程序，如在威斯康星遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麥迪遜市遺傳學計算機小組(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；以及Devereux 等人,(1984),《核酸研究》(Nucleic Acids Res.), 12:387-395)。
[0083]例如，PILEUP是可用于測定序列同源程度的程序。PILEUP使用漸進式逐對比對從一組相關序列產生多個序列對比。其還能夠繪制顯示聚類關系(用于產生比對)的樹形圖。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進式比對方法(參見Feng和Doolittle, (1987),《分子進化學雜志》(J.Mol.Evol.)，35: 351-360)。所述方法與Higgins和Sharp描述的方法類似(Higgins和Sharp， 1989年，《計算機在生物科學中的應用》(CABIOS)，5:151-153)。可用的PILEUP參數包括:默認間隙權重3.00、默認間隙長度權重0.10，以及加權末端間隙。可用的算法的另一例子是Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，(1990),《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol.)，215:403-410 ;以及Karlin等人，(1993)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，90:5873-5787)。一種尤其可用的 BLAST 程序是WU-BLAST-2 程序(參見 Altschul 等人，(1996)，《酶學方法》(Meth.Enzymol.)，266:460-480)。參數 “W”、“T”和“X”確定比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用默認值:字長(W)為11，BL0SUM62記分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，(1989)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，89:10915)比對(B)為50，期望值(E) % 10,Mi 5，N' _4，以及對兩條鏈的比較。
[0084]本文所用的詞語“基本上相似”和“基本上相同”，在至少兩個核酸或者多肽的情形中，通常意指多核苷酸或者多肽包含與參考(即野生型)序列相比具有至少約70%同一性、至少約75%同一性、至少約80%同一性、至少約85%同一性、至少約90%同一性、至少約91%同一^丨生、至少約92%同一‘丨生、至少約93%同一‘丨生、至少約94%同一‘丨生、至少約95%同一‘丨生、至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性、或者甚至至少約99%或者更高的同一性的序列。序列同一性可使用諸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之類的已知程序，使用標準參數測定。(參見例如Altschul等人，(1990)，《分子生物學雜志》(J.Mol.Biol.) ,215:403-410 ；Henikoff 等人，(1989)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA), 89:10915 ；Karin等人，(1993)，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)，90:5873 ;以及Higgins等人，(1988)，《基因》(Gene) ,73:237-244)。進行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。另外，可使用FASTA對數據庫進行搜索(Pearson等人，(1988),《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)，85:2444-2448)。兩條多肽實質上相同的一個指示是第一多肽與第二多肽是免疫交叉反應性的。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽是免疫交叉反應性的。因此，一種多肽與第二多肽實質上一致，例如，在此情況下兩個多肽僅因保守置換而不同。兩種核酸序列實質上一致的另一個指示是兩種分子在嚴格的條件(例如，在中至高嚴格度的范圍內)下彼此雜交。
[0085]本文所用的“野生 型”和“天然”基因或者蛋白質是那些在自然界中存在的基因或者蛋白質。術語“野生型序列”和“野生型基因/蛋白質”在本文中互換使用，指天然的或天然存在于宿主細胞中的序列。
[0086]本文所用的“基因缺失”指基因從宿主細胞的基因組中移除。
[0087]本文所用的“基因中斷”廣義上指任何能極大地防止功能性基因產物(例如蛋白質)在宿主細胞中的表達的遺傳操作或化學操作。示例性的中斷方法包括完全或部分缺失掉基因的任何部分(包括多肽編碼序列、啟動子、增強子或者別的調節元件在內，或者誘變它們(包括置換、插入、缺失及其組合在內)，以極大地防止功能性基因產物的表達。
[0088]本文所用的“功能性基因”是能夠被細胞組分使用以產生活性基因產物(通常是蛋白質)的基因。“功能性基因”與“被中斷基因”相反，后者被修飾，使得它們不能被細胞組分使用以產生活性基因產物。示例性的功能性基因包括但不限于EGV之外的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、過水解酶、酯酶、果膠酸裂解酶、果膠酶、漆酶、氧化酶、還原酶、酰胺酶以及其他酶類、結構蛋白、表面活性蛋白、結合蛋白等。
[0089]如本文所用，里氏木霉宿主細胞如果已被遺傳變更或者化學變更以防止表現出熱穩定性纖維素酶活性(例如使用本文描述的測定法測定)的EGV多肽的產生，則它們“已被修飾以防止熱穩定性EGV纖維素酶的產生”。這種修飾包括但不限于對egl5進行的缺失、對egl5進行的中斷、對egl5進行的使得所編碼的EGV多肽不再熱穩定的修飾、對egl5進行的使得所編碼的EGV多肽不再表現出纖維素酶活性的修飾、對egl5進行的使得所編碼的EGV多肽不再被分泌的修飾、對啟動子或者調節元件進行的使得EGV不被表達的修飾，以及它們的組合。
[0090]本文所用的“功能多肽/蛋白”是這樣的蛋白質，其具有活性如酶活性、結合活性、表面活性性質等，且未被誘變、截短或以其他方式修飾以去除(或者實質上消除)該活性。如所指明，功能多肽可以是熱穩定的或者熱不穩定的。
[0091]本文所用的“不想要的活性”是在從里氏木霉宿主細胞產生的蛋白質制品中不需要的活性(例如酶活性、結合活性、表面活性性質等)。不想要的活性通常在還包含具有所需的或者合乎需要的活性的目的蛋白的蛋白質制品中出現。
[0092]本文所用的“發酵液組合物”指含有目的蛋白如疏水蛋白的細胞生長培養基。細胞生長培養基可包括細胞和/或細胞碎片，且可以進行濃縮。示例性的發酵液組合物是含疏水蛋白的經超濾濃縮的發酵液。
[0093]本文所用的“甘露聚糖酶甘露糖單位(MMU) ”，是在0.24%刺槐豆膠(LBG)存在下在pH 7.0和50°C下每分鐘產生I微摩爾的還原端對等物(包括但不限于D-甘露糖)所需的甘露聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0094]本文所用的“內切葡聚糖酶單位(EGU) ”是每分鐘產生I微摩爾的還原糖所需的內切葡聚糖酶量每毫克疏水蛋白。
[0095]本文所用的“蛋白酶單位(PU) ”對應于在pH 6.2和25 °C下每分鐘水解I微摩爾的N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)所需的半胱氨酸蛋白酶量每毫克疏水蛋白。
[0096]本文所用的“處理”食品或者其他材料以在該材料中實現變化，意思是使該食品或者其他材料與從里氏木霉宿主細胞產生的蛋白質制品接觸，其中該蛋白質制品中存在的一種或者多種蛋白質作用于該食品或者其他材料的組分，以由于例如酶活性、結合活性、表面活性性質等而引起化學變化。處理的例子包括使焙烤食品制品接觸淀粉酶以水解支鏈淀粉、使食品制品接觸脂肪酶以產生乳化劑和使食品制品接觸疏水蛋白以改變質構。
[0097]本文所用的單數名詞涵蓋多個指代物，除非上下文明確地表明并非如此。本文引用的全部參考文獻均以引用方式全文并入本文。 [0098]除非另外指明，否則以下縮寫/首字母縮略詞具有下列含義:
[0099]
【權利要求】
1.一種木霉屬宿主細胞，其包含: 修飾，其中所述修飾顯著地減少或者防止所述木霉屬宿主細胞產生熱穩定性內切葡聚糖酶 V (EGV)， 與啟動子有效連接的編碼目的多肽的外源目的核酸分子，所述啟動子使得至少一種內源多肽和所述目的多肽各自被所述木霉屬宿主細胞體內表達。
2.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞，其中所述修飾在參與EGV的表達的核苷酸中包含一個或者多個缺失或者中斷。
3.根據權利要求2所述的木霉屬宿主細胞，其中所述中斷或者缺失包含EGV編碼基因或者編碼區或者用于EGV的表達的啟動子或者調節元件的缺失或者中斷。
4.根據權利要求3所述的木霉屬宿主細胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5的缺失或者中斷。
5.根據權利要求4所述的木霉屬宿主細胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5中斷。
6.根據權利要求4所述的木霉屬宿主細胞，其中所述缺失或者中斷包含egl5缺失。
7.根據權利要求6所述的木霉屬宿主細胞，其中egl5通過同源重組進行缺失。
8.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞，其中所述內源多肽包含纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶或者它們的組合。
9.根據權利要求8所述的木霉屬宿主細胞，其中所述熱不穩定性酶包含纖維素酶或者半纖維素酶。`
10.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞,其中所述木霉屬是里氏木霉。
11.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
12.根據權利要求10所述的木霉屬宿主細胞，其中所述目的多肽是疏水蛋白II。
13.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞，其中所述目的多肽是熱穩定的。
14.根據權利要求1所述的木霉屬宿主細胞，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩定的。
15.一種在根據權利要求1-12中任一項所述的經修飾的木霉屬宿主細胞中制備所述目的多肽的方法，其中所述目的多肽是熱穩定的，所述方法包括: 將所述經修飾的宿主細胞在適合于所述經修飾的宿主細胞的培養基中進行溫育以產生所述熱穩定性目的多肽和所述內源多肽，由此所述內源多肽和所述熱穩定性目的多肽各自被所述經修飾的宿主細胞表達；以及 使所述熱穩定性目的多肽和所述內源多肽經歷高溫， 其中所述高溫足以顯著地滅活所述內源多肽，但不足以滅活所述熱穩定性目的多肽和EGV，如果它存在的話； 由此所述熱穩定性目的多肽得以以活性或者功能形式產生，而基本上不存在來自所述內源多肽的活性。
16.根據權利要求15所述的方法，還包括在將所述目的多肽和所述內源多肽經歷所述高溫的步驟之前從所述經修飾的木霉屬宿主細胞分離蛋白質混合物。
17.根據權利要求15所述的方法，其中所述經修飾的宿主細胞表達外切纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、葡糖苷酶或者它們的組合。
18.根據權利要求15所述的方法，其中所述熱穩定性目的多肽是可逆地可熱變性的。
19.根據權利要求15所述的方法，其中所述高溫是約90°C或者更高的溫度。
20.根據權利要求15所述的方法，其中暴露于所述高溫達約5分鐘或者更長時間。
21.根據權利要求15所述的方法，其中暴露于所述高溫達約60分鐘或者更長時間。
22.—種控制由根據權利要求1-10中任一項所述的經修飾的木霉屬宿主細胞表達的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩定的，所述方法包括使所述熱敏感性或者熱不穩定性目的多肽和所述內源多肽經歷高溫， 其中所述高溫足以滅活所述內源多肽和所述熱敏感性或者熱不穩定性多肽。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述內源多肽是纖維素酶。
24.根據權利要求22所述的方法，還包括在使所述熱敏感性或者熱不穩定性目的多肽經歷所述高溫之前，使所述目的多肽與所述目的多肽能夠對其起作用的化合物接觸。
25.根據權利要求23所述的方法，還包括在使所述熱敏感性或者熱不穩定性目的多肽經歷所述高溫之前，使所述目的多肽與所述纖維素酶和所述目的多肽能夠對其起作用的一種或者多種化合物接觸。
26.一種從絲狀真菌宿主細胞獲得或者可從絲狀真菌宿主細胞獲得并包含疏水蛋白II的發酵液組合物，所述發酵液基本上不含纖維素酶和/或甘露聚糖酶活性，且其中所述疏水蛋白II在根據權利要求11或者12中任一項所述的經修飾的木霉屬宿主細胞中產生。
27.一種從根據權利要求1-10中任一項所述的經修飾的木霉屬獲得或者可從所述經修飾的木霉屬獲得的發酵液。
28.一種控制權利要求27所述的發酵液中的所述目的多肽的活性的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩定的，所述方法包括使所述發酵液經歷足以滅活所述內源多肽和所述熱敏感性或者熱不穩定性多肽的高溫。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述內源多肽是纖維素酶。
30.根據權利要求28所述的方法，還包括在使所述發酵液經歷所述高溫之前，使所述發酵液與所述目的多肽能夠對其起作用的目的化合物接觸。
31.根據權利要求29所述的方法，還包括在使所述發酵液經歷所述高溫之前，使所述發酵液與所述纖維素酶和所述目的多肽能夠對其起作用的一種或者多種化合物接觸。
32.—種控制從權利要求1-10中任一項所述的經修飾的木霉屬宿主細胞獲得的組合物中存在的纖維素酶的活性的方法，其中所述組合物包含至少一種EGV之外的纖維素酶，所述方法包括使所述組合物經歷足以滅活所述目的多肽的高溫，并且其中在使所述組合物經歷高溫之后所述組合物基本上不含纖維素酶活性。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是熱敏感的或者熱不穩定的。
34.根據權利要求32所述的方法，其中所述目的多肽是耐熱的或者熱穩定的。
35.根據權利要求32所述的方法，其中使所述組合物經歷高溫是在食品或者飲料中進行。
36.根據權利要求32所述的方法，其中所述高溫是小于約100°C。
37.根據權利要求32所述的方法，其中從所述經修飾的木霉屬宿主細胞獲得的組合物是包含疏水蛋白的發酵液。
【文檔編號】C12N1/15GK103562402SQ201180050749
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2011年10月19日 優先權日:2010年10月20日
【發明者】A·米亞斯尼科夫, M·舍爾, M·華德 申請人:丹尼斯科美國公司