一種微波驅動的杯狀病毒rna聚合酶的rna聚合反應的制作方法

專利名稱：一種微波驅動的杯狀病毒rna聚合酶的rna聚合反應的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以單鏈多核苷酸為模板合成互補RNA鏈的方法，該方法包括以下步驟:采用有效量的微波能量對含有所述模板以及一種杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反應條件下并在引物存在或缺席的條件下進行輻照，所述引物與模板雜交。本發明的另一主題涉及一種將一個或多個核苷酸轉移至單鏈多核苷酸模板的3’端上的方法，該方法包括以下步驟:采用有效量的微波能量對含有杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修飾的或標記的類似物存在的條件下進行輻照。
背景技術：
杯狀病毒科家族病毒的RNA依賴的RNA聚合酶(以下采用“RNA聚合酶”表示)已知被用于在引物存在或缺席的條件下合成一條與RNA模板互補的RNA鏈(參見W02007/12329A)。使用這種RNA聚合酶在通常的溫度條件下進行的RNA標準擴增大概需要2小時。US5, 350，686大致要求保護了一種大分子的酶催化修飾的微波加速方法，但是實際上僅示出了限制性內切酶的成功的微波輔助反應。US7, 537，917描述了一種微波輔助DNA的PCR擴增方法。但是，并沒有提供任何數據確實示出DNA聚合酶在微波輻照下進行了成功的DNA聚合反應。特別是關于使用PCR進行的DNA擴增，僅僅擴增循環中的加熱(S卩，變性)步驟(而非聚合反應步驟)被報道為適用于微波應用的步驟；參見Ferm6r et al.(2003) EuropeanJ.Pharm.Sc1.18，129-132。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種以多核苷酸為模板進行RNA聚合反應的改進方法。上述技術問題的解決方法通過描述于此和權利要求所限定的本發明的實施例提供。尤其是，令人驚訝地發現，在使用杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶而非實驗中所研究的其他RNA聚合酶時，通過微波輻照進行以單鏈多核苷酸為模板(RNA，DNA，混合RND/DNA或其混合物)合成互補RNA鏈的復雜反應是可行的并且得到了大大增強，從而形成了本發明。因此，本發明涉及一種以單鏈多核苷酸為模板合成互補RNA鏈的方法，該方法包括:采用有效量的微波 能量對含有所述模板以及一種杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反應條件下并在引物存在或缺席的條件下進行輻照，所述引物與模板雜交。杯狀病毒的RNA聚合酶具有(但是，其他病毒的RNA依賴的RNA聚合酶，例如來源于脊髓灰質炎病毒或丙型肝炎病毒HCV均無法應用于本發明的方法；比照以下描述的實施例)以下共同的結構特征:所述杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶具有“右手螺旋構象”，并且所述RNA聚合酶的氨基酸序列包括以下基序的保守區域:a.XXDYS (SEQ ID NO:1)b.GXPSG(SEQ ID NO:2)c.YGDD(SEQ ID NO:3)d.XXYGL(SEQ ID NO:4)e.XXXXFLXRXX(SEQ ID NO:5)含義如下:D:天冬氨酸Y:酪氨酸S:絲氨酸

G:甘氨酸P:脯氨酸L:亮氨酸F:苯丙氨酸R:精氨酸X:任意氨基酸在此所說的“右手螺旋構象”(“right hand conformation”)是指RNA聚合酶的三級結構(構象)如同在大多數模板依賴的聚合酶中觀察的一樣像具有手指，手掌和拇指的
右手一樣折疊。基序“XXDYS” (SEQ ID NO:1)就是所說的A基序。該A基序通常被用于區分核糖核苷和脫氧核糖核苷。基序“GXPSG” (SEQ ID NO:2)就是所說的B基序。該B基序在杯狀病毒科家族的所有代表中是保守的。基序“YGDD”(C基序，SEQ ID N0:3)代表酶的活性中心。該基序，特別是第一個天冬氨基酸殘基(黑體示出，YGDD)在Mg2+/Mn2+依賴的催化中對于金屬離子的配位發揮重要的作用。基序“XXYGL” (SEQ ID NO:4)就是所說的D基序。該D基序是模板依賴的聚合酶的特征序列。最后，基序“XXXXFLXRXX”(E基序，SEQ ID NO: 5)是RNA依賴的RNA聚合酶(唯一)區別于DNA依賴的RNA聚合酶的特征序列。優選地，該RNA聚合酶是一種人源的和/或非人源的致病杯狀病毒的RNA聚合酶。特別優選的是諾瓦克病毒、沙波病毒、水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶，例如，諾瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。根據本發明的特別優選實施例，該RNA聚合酶是一種包括(或具有)根據SEQ IDNO: 6 (諾瓦克病毒RNA聚合酶)、SEQ ID NO: 7 (沙波病毒RNA聚合酶)，或SEQ ID NO: 8 (水泡病毒RNA聚合酶)或SEQ ID NO:9 (兔病毒RNA聚合酶)的氨基酸序列的蛋白質。本領域技術人員直接就可以制備這種RNA聚合酶，例如使用合適的表達載體和宿主菌(參照W02007/012329A)進行重組表達。為了便于RNA聚合酶在重組表達之后的純化，該RNA聚合酶優選表達為在相應序列的N-末端或C-末端具有一個合適的標簽(例如GST或(His)6_tag)。例如，組氨酸標記允許蛋白質通過鎳柱或鈷柱以一種已知的方式通過親和色譜法進行純化。帶有一個組氨酸標簽的RNA聚合酶的實施例的例子為包括(或具有)根據SEQID NO: 10，SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14 的氨基酸序列的蛋白質。SEQ ID NO: 10相當于具有組氨酸標簽的諾瓦克病毒的RNA聚合酶。SEQ ID NOill和SEQ ID NO: 12相當于具有組氨酸標簽的沙波病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ IDNO: 13相當于具有組氨酸標簽的水泡病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。SEQ ID NO: 14相當于具有組氨酸標簽的兔病毒的RNA聚合酶的氨基酸序列。如上所述的杯狀病毒的上述RNA聚合酶能夠合成與核糖核苷酸(B卩，由RNA組成或含有RNA的多核苷酸模板)或脫氧核糖核苷酸(即，由DNA組成或含有DNA的多核苷酸模板)的多核苷酸鏈互補的RNA鏈。因此，該多核苷酸模板可以是單鏈RNA，單鏈DNA，單鏈混合的DNA/RNA或上述片段的混合物。如果該多核苷酸模板含有DNA或由DNA組成，該微波輻照則應當在修飾的GTP，優選2’端修飾的GTP，例如2’ -氟代-GTP，或α -硫代-GTP存在的條件下進行。通過具有與模板DNA的部分序列互補的序列的引物的延伸，或者通過在引物缺席的條件下互補鏈的從頭合成，杯狀病毒的RNA聚合酶合成一條與單鏈多核苷酸互補的RNA鏈。但是，如果含有脫氧核糖核苷酸的多核苷酸模板在其3’端具有的脫氧核糖核苷酸(即單鏈模板的3’端的最后 一個核苷酸)不是脫氧-C核苷酸(S卩，在其3’端具有脫氧-Τ，脫氧-A或脫氧-G核苷酸),適用于本發明的杯狀病毒RNA聚合酶在合成與模板互補的RNA鏈時要求與模板雜交的引物存在。如果如本文所限定的多核苷酸模板在其3’端由一個或多個脫氧核糖核苷酸組成或含有一個或多個脫氧核糖核苷酸(即，模板的3’端是一個DNA片段或僅僅最后一個核苷酸是脫氧核糖核苷酸)，優選該模板的3’端的最后一個脫氧核糖核苷酸是dC，更優選該模板的3’端的至少最后2個，3個，4個或5個脫氧核糖核苷酸是dC，從而提高RNA合成在引物缺席的條件下從頭引發的效率。在模板由RNA組成，或其3’端由核糖核苷酸組成的情況下，如果該模板是聚腺苷酸，聚鳥苷酸或聚尿苷酸，本發明微波輻照方法中的聚合反應則要求相應引物的存在。如果該模板是聚胞苷酸，杯狀病毒RNA聚合酶的RNA合成在沒有引物的條件下也是可能進行的。在該實施例中，優選模板中具有提高的rGTP水平(B卩，GTP相對于其他必需的rNTPs過量，例如 2x, 3x, 4x 或 5x)。該引物如果是理想的或必需的，分別可以是特定的(雜聚的)DNA或RNA或混合DNA/RNA引物，也可能是隨機的引物(DNA或RNA或混合DNA/RNA)，或者可能是同聚物引物，例如寡-dT-引物或寡-U-引物的序列。該引物的長度對于實施本發明的方法是不重要的，但是通常具有，例如約5-25個堿基，更優選為約10-20個堿基，最優選為15-20個堿基的長度的寡核苷酸引物是特別有利的。杯狀病毒RNA聚合酶的性能特征的更多細節可參見W02007/012329A。與其他RNA依賴的RNA聚合酶，例如QP復制酶相比，該杯狀病毒的RNA聚合酶并不要求具有對聚合酶特定的識別序列的引物來啟動RNA合成。因此，本文所使用的“引物”通常是不具有該識別序列的引物，特別是，不具有RNA聚合酶的識別序列。此外，該杯狀病毒RNA聚合酶不同于普通的DNA依賴的RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶，因為他們不需要模板中具有特定的啟動子序列。該單鏈多核苷酸模板可能包括至少一個脫氧核糖核苷酸的序列片段，S卩，至少一個ssDNA片段，例如在模板的3’端的至少一個DNA片段。本文中的“片段”是指至少兩個或更多連續的脫氧核糖核苷酸。例如，根據本發明該多核苷酸模板可以是單鏈分子，其5’端由核糖核苷酸起始，隨后的“中間”區域為脫氧核糖核苷酸(DNA)，末端(3’端)又是核糖核苷酸。也可以是，5 ’ -RNA-DNA-3 ’或5 ’ -DNA-RNA-3 ’，或任何其他具有RNA和DNA序列的多核苷酸。根據本發明的單鏈多核苷酸模板的其他例子還包括主要是ssDNA，但是在其5’端和/或3 ’端，優選在其3 ’端具有一個或多個(例如，I，2，3，4，5，6，7，8，9或10 )核糖核苷酸。可選地是，根據本發明所使用的模板可以主要是ssRNA，但是在其5’端和/或3’端，優選在其3’端具有一個或多個(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)脫氧核糖核苷酸。當然，根據本發明該單鏈多核苷酸模板也可能僅由ssDNA或ssRNA組成。正如上文所提到的，本發明的在其3’端具有dA，dT或dG殘基的多核苷酸模板通常要求引物來通過RNA聚合酶合成互補的RNA鏈。但是，即使3’端不具有C核苷酸的多核苷酸序列根據本發明的方法也能有效地轉錄進入RNA而無需引物；特別是在這種情況下，但是并非僅限于此，該方法進行的起始步驟為:采用有效量的微波能量對含有單鏈多核苷酸模板和如上所述的杯狀病毒RNA聚合酶的混合物，在rCTP作為唯一的核苷酸存在的條件下進行輻照，并在一定條件下使得所述RNA聚合酶添加至少一個rC (或更多例如2，3，4或5個rC)核苷酸到該模板的3’端。其后,所生成的在3’端具有一個或多個C核糖核苷酸的模板可在如上所述的RNA聚合酶的作用下進行微波驅動的RNA合成，使得所述RNA聚合酶合成一條互補的RNA鏈，該步驟可在引物缺席的條件下進行。但是，應當理解為在該實施例中可以使用引物，例如，如果為了將一條選定的序列引入由該RNA聚合酶生產出的RNA鏈中時或是其他目的時則需要引物。鑒于杯狀病毒RNA聚合酶的末端轉移酶活性，本發明還提供一種將一個或多個核糖核苷酸轉移至如上所述的單鏈多核苷酸模板的3’端的方法，該方法包括:采用有效量的微波能量對含有如上所述的杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP，rGTP,rUTP或rCTP或其修飾的或標記的類似物存在的條件下進行輻照。根據本發明方法的一個優選實施例，由RNA聚合酶在微波輻照下生成的雙鏈分子分離成單鏈，從而生成ssRNA和模板。該步驟可在熱變性或化學變性或酶催化下進行，例如，能夠將單鏈多核苷酸分離成單鏈的酶，例如解旋酶。但是，根據本發明特別優選的實施例，由該RNA聚合酶產生雙鏈多核苷酸的步驟和其他分離步驟在如上所述的微波輻照下采用相同的酶進行，即，該RNA聚合酶本身，該步驟同樣優選在微波輻照下進行。該步驟有效利用了杯狀病毒的RNA聚合酶的鏈置換活性。更優選為將如上所述獲得的單鏈再次(或進一步)與如上所述的杯狀病毒RNA聚合酶在微波輻照下溫浴，并在一定條件下使得該RNA聚合酶合成與所述各單鏈互補的RNA鏈。顯然該RNA合成步驟和鏈分離可重復一次或多次，例如，大約3-40次，優選為大約5-30次，更優選為大約10-20次。根據又一優選實施例，本發明的方法包括最后的RNA合成步驟。特別是在鏈分離和RNA合成的重復循環中，該方法導致產物幾乎是純的dsRNA，即使該原始模板含有DNA的(一個或多個)片段或由DNA組成。正如如上概述的那樣，任何進一步的鏈分離步驟可在熱變性或化學變性或酶催化下進行，例如能夠將單鏈多核苷酸分離成單鏈的酶，比如解旋酶。但是，更加優選的是，進一步的鏈分離可在杯狀病毒RNA聚合酶的作用下進行。因此，顯然根據本發明包括數個或大量鏈分離和RNA合成步驟的優選方法可在同一溫浴反應中進行(特別是當使用不需要引物就能在如上所述的RNA聚合酶的作用下進行RNA合成的模板時)，該溫育反應僅僅要求對含有模板，杯狀病毒的RNA聚合酶，適當的緩沖液(如下)和rNTPs (B卩，rATP，rUTP，rCTP和rGTP，或如下所述的修飾或標記的rNTPs)的反應混合物進行微波輻照。根據本發明，術語“RNA聚合反應條件”是指條件，特別涉及實現RNA聚合酶合成與模板鏈互補的RNA鏈的緩沖液，鹽和金屬離子(若適用)的條件。適當的緩沖液，鹽，金屬離子，還原劑(若適用)和其他RNA聚合酶的條件為本領域技術人員所知，例如參見W02007/012329A。因此，該多核苷酸模板通常以例如:1_4 μ g/50 μ L反應體積使用。該三磷酸核糖核苷酸(包括進一步如下所述的可選的修飾的或標記的三磷酸核糖核苷酸)的濃度優選在0.1μπιο1/1-1μπιο1/1的范圍內，例如0.4 μ mol/1。該RNA聚合酶的濃度可以是lymol/l-10ymol/L.
典型的緩沖液為:10-80mM，更優選為20_50mM HEPES, pH7.0-8.0, l_5mM，例如 3mM醋酸鎂，氯化鎂，醋酸錳或氯化錳和l_5mM還原劑，例如DTT。典型的終止液含有:2-10mM，優選4-8mM醋酸銨，以及50_200mM，例如150mM EDTA。單鏈多核苷酸，例如ssRNA模板的長度和來源通常是不重要的。該模板可以具有天然序列或人工序列，并且該模板可以是化學合成的或多種來源，例如真核、原核或病毒的總的RNA，mRNA或基因組DNA，質粒DNA，cDNA,桿粒或任何其他來源的RNA和DNA。在作為模板在本發明的方法中使用之前，雙鏈DNA或RNA需要分別通過加熱或微波輻照或化學變性分離成ssDNA或ssRNA。本發明的方法在使用RNA模板提供雙鏈RNA產物和/或擴增ssRNA模板中是特別有用的。本發明的特別優 選實施例涉及短RNA分子用于基因沉默應用的方法，或者通過反義技術或RNA干擾，或者用于針對微小RNA或非編碼RNA的特定序列的反義從而實現抑制微小RNA驅動RNA干擾(antagomirs)的目的。對于這些應用，在本發明的方法中使用的模板(優選RNA)通常具有8-45個核苷酸，例如15-30個核苷酸,優選21-28個核苷酸,更優選21-23個核苷酸。后一長度的分子對于SiRNA應用通常是特別有益的。進一步可以預期該RNA聚合酶在RNA合成中(包括末端轉移酶活性)在微波輻照下可采用修飾的核糖核苷酸(除了如上所述的可選的修飾的GTP(例如2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP))。例如，該修飾可以是用于檢測RNA聚合酶的雙鏈RNA合成產物的標記。或者可選地，該標記還可用于檢測鏈分離之后獲得的ssRNA產物。本發明中所使用的標記包括熒光基團(例如熒光素)，放射基團(例如，32P標記的核糖核苷酸)以及特異性結合對，例如生物素化的rNTPs。在本發明的特定實施例中，在RNA聚合酶活性的作用下被合并進入互補鏈的至少一個修飾的核糖核苷酸可以在其核糖，磷酸和/或堿基上具有化學修飾基團(其中的一個或多個)。而對于具有增強穩定性的分子，特別是RNA降解酶，特別優選的是其骨架(即核糖和/或磷酸)上具有修飾基團。本發明的方法中化學修飾的RNA產物優選具有與未修飾的ssRNA或dsRNA類似物相比增強的穩定性。核糖修飾的核糖核苷酸的優選實施例為一組類似物，其中2’ -OH選自由H，OR, R，鹵素，SH, SR，NH2, NHR, NR2或CN (其中R是C1-C6烷基，烯基或炔基，鹵素是F，Cl，Br或I)組成的組中的基團取代。在本發明的文中，顯然術語“修飾的三磷酸核糖核苷酸”或“修飾的核糖核苷酸”還包括可能每隔幾個的2’脫氧衍生物，也稱作“脫氧核苷酸”。這些在其2’位具有修飾核糖的核糖核苷酸類似物的典型實施例包括:5_氨基-尿苷，2’ -氨基-2’ -脫氧尿苷，2’ -疊氮-2’ -脫氧尿苷，2’ -氟代-2’ -脫氧鳥苷和2’ -O-甲基-5-甲基-尿苷。在理想的雙鏈產物中形成磷酸骨架修飾的核糖核苷酸的例子為硫代磷酸酯類似物。根據本發明，至少一個修飾的核糖核苷酸可選自其堿基位上具有化學修飾的類似物。這種類似物的例子包括:6_氮雜-尿苷，8-氮雜-腺苷，5-溴代-尿苷，7-去氮雜-腺苷，7-去氮雜-鳥苷，N6-甲基-腺苷，5-甲基-胞苷，假-尿苷，以及4-硫代-尿苷。上述以及其他化學修飾的三磷酸核糖核苷均為市面上可買到的產品，例如可從Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich, Germany or Trilink technologies, USA 購買。應當理解，該多核苷酸模板可能含有如上所述的和/或進一步為本領域熟知的一個或多個修飾的或標記的核苷酸。短模板(例如，如上所述)通常由化學合成法制備。用于提供這種單鏈多核苷酸模板的其他方法還包括酶法操作，例如RNA的反轉錄以及RNA鏈的后續降解，采用限制性酶對較大dsDNA分子的切割，以及采用熱變性或化學變性進行的后續鏈分離成ssDNA，總的細胞RNA的制備，mRNA的制備等等。優選反應體積范圍為20-200 μ L，優選為50-100 μ L。典型地，如上所述的緩沖液條件和其他條件的制備包括:混合 適當的儲備液(通常為5χ或IOx濃縮液)，加入RNA聚合酶，模板，和雙蒸水或去離子水(優選在使用之前經過去RNAse和/或DNAse)補足至理想的終反應體積。術語“有效量的微波能量”是指使用杯狀病毒的RNA聚合酶，分別進行合成與單鏈多核苷酸模板互補的鏈或者將至少一個核糖核苷酸轉移到單鏈多核苷酸的3’端的RNA聚合反應所要求的微波能量的量。對于給定模板所需要的具體的微波能量的量可由本領域技術人員通過常規的實驗確定并且特別取決于模板的類型和長度。本文所使用的術語“微波能量”，“微波輻照”或“采用微波輻照”或簡單的“微波”均為同義使用，涉及的電磁波譜的部分包括波長大約為0.3-30cm，頻率相當于1-100千兆赫，被發現于電磁波譜的無線電和紅外線之間的電磁波。生物體所吸收的電磁能量的量由該組織，細胞和生物分子的介電性能決定。為了實現本發明的目的，該微波能量的形成方式并不重要，可采用為本領域熟知的任何手段。例如，用于將微波輻照施加給根據本發明所述的反應混合物的適當手段為微波爐，該微波爐可從許多供應商那里買到，并且通常是大多數生物學實驗室的標準設備的構成部分。這些微波爐通常具有大約500W-1000W的最大功率水平。即使是最小的微波爐也可以為本發明的應用提供所需要的足夠的微波輻照水平，并且因此，對于輸出功率可調節的微波爐，使用較小的功率設置將是十分方便的。因此，根據公開于此的本發明方法的優選實施例，該混合物的輻照所采用的微波具有大約1500-3500MHZ的頻率，并且具有大約50-1000W的功率。
根據本發明的優選實施例，在較長的時間間隔中使用更小的功率設置，能夠降低局部能量吸收并且最小化導致分子損害的可能性。在一個特別優選的實施例中，微波能量以一系列的間隔施加于樣品上，而在“停頓”間隔中微波能量不施加于樣品上。能量施加間隔和停頓間隔通常分別在1-60秒之間，能量施加間隔優選在15-60秒之間，而停頓間隔優選在0.5-5秒之間。最優選地是，能量施加間隔為大約45秒，由停頓間隔1-2秒隔開。但是，特別是取決于單鏈多核苷酸模板的長度，該輻照步驟可在唯一的微波能量施加(間隔)中進行，該時間周期為ls-5min，更加優選為3s-120s。當使用較短長度的模板(例如用于制備短dsRNAs，比如siRNAs的模板)時則特別優選后一較短的時間周期。特別是關于從ssRNA模板到dsRNA的制備，根據本發明已經表明本文所述的方法具有與本領域已知的溫育時間相比基本更短的反應時間。通過杯狀病毒的RNA聚合酶制備雙鏈多核苷酸產物時微波輻照的應用對于制備雙鏈RNA十分有利。正如前文所提及的，迄今為止這些反應均是在30-42° C下使用更長的溫育時間進行，以及通過加熱來分離雙鏈RNA產物。但是，在這種情況下獲得的dsRNA容易降解，從而使得很難獲得具有理想長度的純的dsRNA產物。與此相反，根據本發明微波能量的應用加快了 RNA聚合酶的聚合反應，從而克服了 RNA降解的缺陷。應當理解，在實施本發明的一個優選方案中，除了將裝置的“功率”設置調整到最大值以下，還將采取上述措施使得輸入功率隨著時間分布。事實上，許多市售的微波爐可維持不變的磁控管輸出功率在650-900W之間，并且可通過改變磁控管的占空比調節輸入功率。設置為“I”相當于10%的占空比，設置為“9”相當于90%的占空比。最優選地是，設置為1-8，即磁控管在輸出功率為700-800W的條件下的占空比為10%-80%。該總輸出能量將被施加于如上所述的多個間隔，或一個間隔，相當于70-35，000瓦-秒，優選為3000-3500瓦-秒/間隔。


圖1示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，證明了通過沙波病毒RNA聚合酶實現了微波驅動的引物非依賴的從頭引發RNA合成以及雙鏈RNA的形成。泳道1:RNA模板。泳道2:微波輻照(800W，60s)之后模板與沙波病毒RNA聚合酶的反應混合物產生了一條與25bp dsRNA標記共遷移的帶。泳道3:泳道2的產物在經過SI核酸酶處理之后的產物。該25bp產物未被SI核酸酶消化，示出了產物的雙鏈特性。M:RNA標記，包括如圖所示的分別為17bp，21bp和25bp的dsRNA以及24nt的ssRNA。圖2A示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，該照片說明了通過沙波病毒RNA聚合酶實現微波驅動的引物非依賴的從頭引發RNA合成以及雙鏈RNA的形成所需要的能量條件。該沙波病毒RNA聚合酶與24nt ssRNA模板在微波輻照下溫育60s，功率分別為80W (泳道1)，160W (泳道2)，240W (泳道3)，320W (泳M 4), 400W (泳道 5)，480W (泳道 6)，560W (泳道 7)，640W (泳道 8)，720W (泳道 9)和 800W(泳道10)。泳道1-10分別示出了與25bp dsRNA標記共遷移的產物。M =RNA標記，包括如圖所示的分別為17bp，21bp和25bp的dsRNA,以及24nt的ssRNA。圖2B示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，該照片說明了通過沙波病毒RNA聚合酶實現微波驅動的引物非依賴的從頭引發RNA合成以及雙鏈RNA的形成所需要的輻照時間。該沙波病毒RNA聚合酶與24nt ssRNA模板在80W的微波輻照下分別溫育60s (泳道1)，30s (泳道2)，15s (泳道3)和5s (泳道4)或者在800W下分別溫育60s (泳道5)，30s (泳道6)，15s (泳道7)和5s (泳道8)。泳道1-8均示出了與25bp dsRNA標記共遷移的產物。M =RNA標記，包括如圖所示的分別為17bp和25bp 的 dsRNA，以及 24nt 的 ssRNA。圖3示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，該照片證明了當反應物暴露于微波輻照中時，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依賴性的方式以DNA為模板從頭引發RNA合成，并將2’-氟代-GMP合并引入雙鏈DNA/RNA產物。該沙波病毒RNA聚合酶與3’端具有5個dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5個rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP，rCTP, rUTP和2’ -氟代-GTP存在的條件下，800W微波輻照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和與DNA模板序列相同的ssRNA模板的反應物作為對照，微波條件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。雙鏈合成產物與單鏈模板均如圖所述。圖4示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，該照片證明了當反應物暴露于微波輻照中時，沙波病毒RNA聚合酶以引物非依賴性的方式以DNA為模板從頭引發RNA合成，并將α -硫代-GMP合并引入雙鏈DNA/RNA產物。該沙波病毒RNA聚合酶與3’端具有5個dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5個rC的ssDNA模板(泳道2)在rATP, rCTP, rUTP和α -硫代-GTP存在的條件下，800W微波輻照60s。含有沙波病毒RNA聚合酶和與DNA模板序列相同的ssRNA模板的反應物作為對照，微波條件相同，并且含有rATP，rCTP, rUTP和rGTP (泳道3)。雙鏈合成產物與單鏈模板均如圖所述。圖5示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，該照片證明了杯狀病毒RNA聚合酶能夠實現微波驅動的從頭引發RNA合成并且生成雙鏈RNA，而其他病毒的RN A聚合酶則不能。24nt的ssRNA模板分別與沙波病毒(泳道I )，諾瓦克病毒(泳道2)，水泡病毒(泳道3)，兔病毒(泳道4)，脊髓灰質炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶在800W的微波輻照下輻照60s。杯狀病毒的RNA聚合酶(泳道1-4)產生了與25bp dsRNA標記共遷移的雙鏈產物，而脊髓灰質炎病毒(泳道5)或丙型肝炎病毒(泳道6)的RNA聚合酶則沒有產生該產物。M:RNA標記，包括如圖所示的分別為17bp 和 25bp 的 dsRNA,以及 24nt 的 ssRNA。圖6示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，證明了沙波病毒的RNA聚合酶實現了微波驅動的從頭引發RNA合成并且以ssDNA為模板生成雙鏈DNA/RNA產物。該沙波病毒RNA聚合酶與3’端具有5個dC的24nt的ssDNA模板(泳道I)或序列相同但是在其3’端具有5個rC的ssDNA模板(泳道3)在800W的微波輻照下輻照60s。作為對照，含有該沙波病毒RNA聚合酶以及相同序列的ssRNA模板的反應物(泳道2)在與之前相同的條件下進行微波輻照。所有的反應均在rATP，rCTP, rUTP和rGTP存在的條件下進行。與25bp dsRNA標記共遷移的雙鏈產物在泳道2和3中可見，而在泳道I中不可見，該結果表明雙鏈產物僅僅在ssDNA模板的3’端具有rC核苷酸的條件下生成。M =RNA標記，包括如圖所示的20nt，40nt和80nt的ssDNA。
圖7示出了反應物電泳分離之后的溴化乙錠染色非變性20%聚丙烯酰胺凝膠的照片，證明T7DNA依賴的RNA聚合酶在微波輻照下不能進行RNA合成。該T7DNA依賴的RNA聚合酶與dsDNA模板(含有116bpl8SrRNA序列的線性化質粒)在37° C下溫育2h (泳道I)或在800W下微波福照60s(泳道2)。所有的反應均在T7_Megashortscript Kit (Ambion, Inc.)推薦的條件下進行。在37° C下等溫溫育2h (泳道I)之后可觀察到反應產物，而在微波輻照(泳道2)之后則無法觀察到。圖8A示出的圖表反映了沙波病毒RdRp在使用加熱管產生的熱量下進行引物非依賴的從頭引發RNA合成的酶反應的動力學。為了測定該反應動力學，該沙波病毒RdRp(SEQID N0:11)與RNA模板(5’-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 15)—起溫育。該反應以25 μ I總體積在加熱管中37° C下進行。該反應混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp,各為 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水補足至 25 μ I 總體積。圖8Β示出的圖表反映了沙波病毒RdRp在使用微波能量下進行引物非依賴的從頭引發RNA合成的酶反應的動力學。為了測定該反應動力學，該沙波病毒RdRp (SEQ IDΝ0:11)與 RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起溫育。該反應以25 μ I總體積在160W的微波下進行。該反應混合物含有I μ g模板，7.5 μ M RdRp，各為 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP, 5 μ I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT5mM, ρΗ7.6)，去 RNAse-DNAse 水補足至 25 μ I 總體積。
具體實施例方式本發明進一步通過以下非限制性例子進行闡述。

例1:通過沙波病毒RNA聚合酶實現的微波驅動的引物非依賴的從頭引發RNA合成以及雙鏈RNA的生成沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)與 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)在常規微波爐中800W下微波輻照60s。該沙波病毒RNA聚合酶以單鏈RNA為模板生成雙鏈RNA (如圖1，泳道2)。該生成的產物與SI核酸酶進行溫育。在與SI核酸酶進行溫育之后產物并沒有被消化(如圖1，泳道3)，說明了產物為雙鏈的性質。所有反應均在25 μ I總體積下進行。該RNA聚合酶反應物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各為 0.4mM 的 ATP, CTP, UTP，以及 2mMGTP，5y I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl225mM, DTT 5mM, pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水補足至25 μ I總體積。對于SI核酸酶的消化，SI核酸酶(250U)被加入反應液，并且反應液在30° C下混合溫育lh。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。例2:通過杯狀病毒RNA聚合酶實現的微波驅動RNA合成所需的微波功率和輻照時間沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)與 RNA 模板(5 ’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ;SEQ ID NO: 15)—起溫育。該反應以25 μ I總體積在常規微波爐中分別在80W，I60W, 240W, 320W, 400W, 480W, 560W, 640W, 720W 和 800W 下輻照 60s。在另一實驗中，該反應物在同一微波爐中80W下輻照60s，30s, 15s,或5s (如圖2B，泳道1_4)，或在800W下進行60s, 30s, 15s,或5s(如圖2B，泳道5_8)。所有反應中均產生了預期尺寸的產物(圖2A，2B)。
該反應物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各為0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及 2mM GTP，5y I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去RNAse-DNAse水補足至25 μ I總體積。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。例3:杯狀病毒RNA聚合酶在微波輻照下以DNA為模板以引物非依賴的方式從頭引發RNA合成，并將2’ -氟代-GMP合并引入雙鏈DNA/RNA產物沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)與 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ；SEQ ID NO: 16)—起溫育或具有相同序列但是在3’端具有(rC)5基序的DNA模板(5’_ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)。作為對照，將沙波病毒 RNA 聚合酶與單鏈 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15) —起溫育，該單鏈 RNA 具有與上述單鏈DNA相同的序列。所有的反應以25 μ I總體積在常規微波爐里800W下進行輻照60s。該反應物混合含有I μ g模板，7.5 μΜ RNA聚合酶，各為0.4mM的ATP，CTP，UTP，以及GTP (使用ssRNA模板作為對照反應；如圖3，泳道3)或2’ -氟代-GTP (使用ssDNA模板進行反應；如圖 3，泳道 I和2)，5μ I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH7.6),以及去RNAse-DNAse水補足至25 μ I總體積。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。圖3 (參見泳道I和2)證明了通過沙波病毒RNA聚合酶實現了以ssDNA為模板進行的微波驅動的RNA合成以及對2’ -氟代-GMP的引入。例4:杯狀病毒RNA聚合酶在微波輻照下以DNA為模板以引物非依賴的方式從頭引發RNA合成，并將α -硫代-GMP合并引入雙鏈DNA/RNA產物將沙波病毒RNA 聚合酶(SEQ ID NO: 11)與 ssDNA 模板(5 ’ -ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’；SEQ ID NO: 16)或具有相同序列但是在3’端具有(rC) 5基序的DNA模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3’；SEQ ID NO: 17)—起溫育。作為對照，將沙波病毒 RNA 聚合酶與單鏈 RNA(5’-AUACCUAGAAUCU`GACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起溫育，該單鏈 RNA 具有與上述單鏈DNA相同的序列。所有的反應以25 μ I總體積在常規微波爐里800W下進行輻照60s。該反應物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各為0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及GTP (使用ssRNA模板作為對照反應；如圖4，泳道3)或α -硫代-GTP (使用ssDNA模板進行反應；如圖4，泳道 I和2)，5μ I 反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM，pH7.6)，以及去RNAse-DNAse水補足至25 μ I總體積。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。圖4 (參見泳道I和2)證明了通過沙波病毒RNA聚合酶實現了以ssDNA為模板進行的微波驅動的RNA合成以及對α -硫代-GMP的引入。例5:采用杯狀病毒科的不同RNA聚合酶進行的微波驅動的引物非依賴的從頭引發RNA合成以及雙鏈RNA的形成將沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)，諾瓦克病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO:9)，水泡病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 13)，兔病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 14)在微波輻照下與RNA 模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 15)—起溫育。所有的杯狀病毒RNA聚合酶以單鏈RNA為模板生成雙鏈RNA (如圖5，泳道1-4)。此外，本實施例還研究了是否其他病毒(脊髓灰質炎病毒，丙型肝炎病毒)來源的RNA聚合酶同樣能夠在微波輻照下進行相同的反應。因此，將該脊髓灰質炎病毒RNA聚合酶和丙型肝炎病毒RNA聚合酶與相同的ssRNA模板在微波輻照下進行溫育。但是，該脊髓灰質炎病毒和丙型肝炎病毒的RNA聚合酶在與用于杯狀病毒RNA聚合酶的相同的條件下并不產生雙鏈RNA (如圖5，泳道5和6)。所有的反應以25 μ I總體積在常規微波爐里800W下進行輻照60s。該反應物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各為0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水補足至 25 μ I 總體積。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。例6:通過沙波病毒RNA聚合酶實現以微波驅動的引物非依賴的方式從頭引發RNA合成以及DNA-RNA-雙鏈的形成將沙波病毒RNA聚合酶(SEQ ID NO: 11)與3 ’末端具有(dC) 5基序的DNA模板(5 ’-ATACCTAGAATCTGACCAACCCCC-3’ ; SEQ ID NO: 16)，或具有相同序列但是 3’端具有(1*05基序的 DNA 模板(5，-ATACCTAGAATCTGACCAArCrCrCrCrC-3，; SEQ ID NO: 17) 一起溫育。作為對照，將該沙波病毒 RNA 聚合酶與單鏈 RNA (5’ -AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’ ; SEQ IDNO: 15) 一起溫育，該單鏈RNA具有與單鏈DNA模板相同的序列。該沙波病毒RNA聚合酶以單鏈DNA為模板形成了 DNA/RNA雙鏈(如圖6，泳道2和3)，該DNA模板的3’端具有C核糖核苷酸。所有的反應以25 μ I總 體積在常規微波爐里800W下進行輻照60s。該反應物混合含有I μ g模板，7.5 μ M RNA聚合酶，各為0.4mM的ATP, CTP, UTP,以及2mM GTP, 5 μ I反應緩沖液(HEPES 250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, ρΗ7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水補足至 25 μ I總體積。該產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。對照例:采用T7DNA依賴的RNA聚合酶(DdRp)分別在等溫條件下與微波輻照下進行RNA合成的效率對比該T7DdRp以雙鏈DNA為模板(含有116bp的18S rRNA序列的線性化質粒，I μ g/次)，在推薦的等溫溫育條件37° C下溫育2h或使用微波輻照(800W，60s)來進行RNA合成。所使用的試劑為T7-Megaschortscritp Kit (Ambion, Inc)。所有的反應根據操作指南進行。在等溫條件下溫育的產物如圖7中泳道I所示。相比之下，當反應混合物采用微波輻照時則沒有產物生成(800W，60s ;如圖7，泳道2)。反應產物通過電泳在非變性20%聚丙烯酰胺凝膠中分離并通過溴化乙錠染色觀察。上述例子和對照例證明了杯狀病毒科病毒家族(杯狀病毒)的RNA聚合酶在微波輻照下能夠以RNA，DNA或混合RNA/DNA為模板合成互補的RNA鏈，而結構相關的其他病毒(脊髓灰質炎病毒，HCV)的RNA依賴的RNA聚合酶或DNA-依賴的RNA聚合酶(T7DdRp)則無法實現。例7:沙波病毒RdRp在使用微波能量時具有與通過加熱管所產生的熱量相比增強的RNA合成催化效率為了測量反應動力學，將該沙波病毒RdRp (SEQ ID NO: 11)與RNA模板(5，-AUACCUAGAAUCUGACCAACCCCC-3’;SEQ ID NO: 15)—起溫育。所有反應均以 25 μ I 總體積進行，或在加熱管中37° C下，或在微波爐中160瓦特下進行。該反應物混合含有1μ g模板，7.5μΜ RdRp，各為 0.4mM 的 ATP，CTP，UTP，以及 2mM GTP，5 μ I 反應緩沖液(HEPES250mM, MnCl2 25mM, DTT 5mM, pH 7.6)，以及去 RNAse-DNAse 水補足至 25 μ I 總體積。圖 8Α示出了采用由加熱管產生的熱量進行的反應的動力學。圖8Β示出了使用微波能量進行的反應的動力學。還示出了四次獨立測量的平均值+/-SEM (誤差線)。 該沙波病毒RdRp在以微波為能量來源時具有與采用加熱管所產生的熱量相比增強的催化效率(Keat高達5倍 ，Kcat/KM高達1.6倍)。
權利要求
1.一種以單鏈多核苷酸為模板合成互補RNA鏈的方法，所述方法包括以下步驟: 米用有效量的微波能量對含有所述模板以及一種杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反應條件下并在引物存在或缺席的條件下進行輻照，所述引物與所述模板雜交，其附加條件為，如果所述模板含有脫氧核糖核苷酸，該輻照在修飾的GTP，優選2’_氟代-GTP或α -硫代-GTP存在的條件下進行，以及，如果所述模板含有的脫氧核糖核苷酸在其3’端具有非脫氧-C核苷酸時，該輻照步驟在引物存在的條件下進行，所述引物與所述模板雜交，另一附加條件為，如果所述模板分別是聚腺苷酸，聚鳥苷酸或聚尿苷酸RNA或分別是polyA, polyG或polyU RNA,該福照步驟在引物存在的條件下進行,所述引物與所述模板雜交，以及如果所述模板是聚胞苷酸，所述輻照步驟在引物缺席的條件下進行，所述混合物含有的GTP分別相對ATP，CTP和UTP過量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一種諾瓦克病毒，沙波病毒，水泡病毒或兔病毒的RNA聚合酶。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶是一種諾瓦克病毒HuCV/NL/Dresdenl74/1997/GE 株(GenBank Acc.No AY741811)的 RNA 聚合酶，或沙波病毒pJG-SapOl 株(GenBank Acc.No AY694184)的 RNA 聚合酶，或水泡病毒 FCV/Dresden/2006/GE 株(GenBank Acc.No DQ424892)的 RNA 聚合酶，或兔病毒 pJG-RHDV_DD06 株(GenBankAcc.N0.EF363035.1)的 RNA 聚合酶。
4.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶具有選自由 SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 11，SEQ ID NO: 12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成的組中的氨基酸序列。
5.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述混合物采用頻率為1500MHz-3500MHz以及功率為50-1000W的微波進行輻照。
6.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述混合物采用微波輻照 3s-120s。
7.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述混合物含有至少一種修飾的或標記的核糖核苷酸，可選地除了修飾GTP，優選2’-氟代-GTP或α -硫代-GTP。
8.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述模板是單鏈RNA，單鏈DNA，混合單鏈DNA/RNA或其混合劑。
9.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述模板具有15-30個核苷酸的長度，優選為21-28個核苷酸，更優選為21-23個核苷酸，并且所述輻照步驟在引物缺席的條件下進行。
10.根據前述權利要求中的任意一項所述的方法，其特征在于，所述模板的3’端具有至少一個C核苷酸,優選1-5個C核苷酸。
11.根據權利要求1-9中的任意一項所述的方法，其特征在于，在RNA聚合反應條件下進行輻照步驟之前，所述含有模板和杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物首先采用有效量的微波能量在rCTP作為唯一核苷酸存在的條件下進行輻照。
12.根據前述權利要求中的任意 一項所述的方法，其特征在于，所述RNA聚合酶在微波輻照下將所述雙鏈產物分離成單鏈，合成與各單鏈互補的RNA鏈，可選地在引物存在的條件下，并重復分離互補鏈和RNA合成步驟一次或多次，可選地在引物存在的條件下。
13.—種將 一個或多個核糖核苷酸轉移至單鏈多核苷酸模板的3’端的方法，所述方法包括:采用有效量的微波能量對含有杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修飾的或標記的類似物存在的條件下進行輻照。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述模板是單鏈RNA，單鏈DNA，混合單鏈DNA/RNA或其混合劑。
全文摘要
本發明涉及一種以單鏈多核苷酸為模板合成互補RNA鏈的方法，該方法包括以下步驟采用有效量的微波能量對含有所述模板以及一種杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在RNA聚合反應條件下并在引物存在或缺席的條件下進行輻照，所述引物與模板雜交。本發明的另一主題涉及一種將一個或多個核苷酸轉移至單鏈多核苷酸模板的3’端上的方法，該方法包括以下步驟采用有效量的微波能量對含有杯狀病毒科家族病毒的RNA聚合酶的混合物在rATP或rGTP或rUTP或rCTP或其修飾的或標記的類似物存在的條件下進行輻照。
文檔編號C12Q1/68GK103119177SQ201180045060
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月20日 優先權日2010年9月21日
發明者賈克斯·洛哈耶姆 申請人:里博克斯艾克斯有限公司