作為可替代的抗微生物劑的噬菌體裂解酶的制作方法

作為可替代的抗微生物劑的噬菌體裂解酶的制作方法
【專利摘要】本發明涉及來自噬菌體CP26F和CP39O的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶、以及在控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中用途。
【專利說明】作為可替代的抗微生物劑的噬菌體裂解酶
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌{Clostridium perfringens)細菌的噬菌體裂解酶或其功能性片段以及所述裂解酶的用途，包括但不限于治療由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌所致的疾病的組合物和方法。
【背景技術】
[0002]產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的革蘭氏陽性、桿狀、厭氧的產孢細菌。產氣莢膜梭狀芽孢桿菌在自然界普遍存在，通常可作為腐爛植物、海洋沉積物、人和其他脊椎動物的腸道、昆蟲和土壤的成分而發現。盡管普遍存在，并且通常為良性，但產氣莢膜梭狀芽孢桿菌也是許多動物和人的嚴重感染的原因。的確，已知產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是食物中毒、氣性壞疽(梭菌性肌壞死)、壞死性腸炎、和非食物傳播的胃腸感染的原因。因此，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是人和動物的病原體(Songer，1997)。盡管所有家畜均可被感染，但產氣莢膜梭狀芽孢桿菌尤其是養禽業的憂慮。的確，在禽類中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌導致最具破壞性的損失。
[0003]在雞中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌導致壞死性腸炎，在現代肉用雞群中最常見和具經濟破壞力的細菌疾病。盡管臨床疾病通常非常短暫，但在未經保護的禽群中死亡率可具破壞力。的確，通常在群體中壞死性腸炎的唯一跡象是死亡率的突然增加。除了增加死亡率之外，壞死性腸炎可存在于抑郁、起皺的羽毛和深色腹瀉的禽類中。通常，在群體中疾病持續介于約5-10天之間，其具有介于約2-50%之間的死亡率。
[0004]通常，通過在水或飼料中預防給藥施用的抗微生物藥物來控制壞死性腸炎。然而，對在動物飼料中使用抗生素的公眾反對聲日益增加。例如，在歐洲，已經禁止在動物飼料中使用抗生素(參見例如，van Immerseel等人,2004，2008)。很快美國也會如此。如果沒有用于預防壞死性腸炎和由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌導致的其他疾病的傳統抗生素，則這些疾病可能成為養禽業的 極大問題。
[0005]因此，本領域需要對預防和治療由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(特別是影響家禽的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌)所導致疾病有效的傳統抗生素的替代選擇。
[0006]幸運地，如從以下公開明顯可見，本發明提供這些和其他需求。

【發明內容】

[0007]在一個實施方案中，本發明提供分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其中噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及其中，噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。在一示例性實施方案中，分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。在另一示例性實施方案中，分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶具有根據SEQ IDNO:1的序列。在另一示例性實施方案中，分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。在又一示例性實施方案中，分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶具有根據SEQ ID NO:3的序列。在又一示例性實施方案中，分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體分離，該產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體是選自具有ATCC保藏名稱PTA-11081的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP390以及具有ATCC保藏名稱PTA-11080的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP26F的成員。
[0008]在另一實施方案中，本發明提供編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的分離的核酸分子，其中噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及其中，噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。在一示例性實施方案中，分離的核酸分子是選自編碼具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽的分離的核酸以及編碼具有與SEQ ID NO: 3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽的分離的核酸的成員。在另一示例性實施方案中，分離的核酸分子編碼具有根據SEQ ID N0:1的氨基酸序列的肽。在另一示例性實施方案中，分離的核酸分子編碼具有根據SEQ ID N0:3的氨基酸序列的肽。
[0009]在另一實施方案中，本發明提供有效針對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的抗微生物組合物，該抗微生物組合物包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其中噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及其中，噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。在一示例性實施方案中，抗微生物組合物包含具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。在另一示例性實施方案中，抗微生物組合物包含具有根據SEQ ID NO:1的序列的肽。在另一示例性實施方案中，抗微生物組合物包含具有與SEQ ID N0:3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。在又一示例性實施方案中，抗微生物組合物包含具有根據SEQ ID N0:3的序列的肽。在另一示例性實施方案中，抗微生物組合物包含由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體分離的噬菌體裂解酶，該產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體是選自具有ATCC保藏名稱PTA-11081的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP390以及具有ATCC保藏名稱PTA-11080的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP26F的成員。
[0010]在另一實施方案中，本發明提供包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的動物飼料，其中噬菌體裂解酶是 選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及其中噬菌體裂解酶在家畜中以有效地控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的量存在。在一示例性實施方案中，動物飼料適合飼養雞類。
[0011]本發明的其他特征、目的和優勢由以下詳細描述顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1.SEQ ID NO:1:噬菌體CP26F溶素氨基酸序列。
[0013]圖2.SEQ ID NO: 2:編碼噬菌體CP26F溶素的示例性核酸序列。下劃線序列是各自基因的“起始”和“終止”位點。
[0014]圖3.SEQ ID NO: 3:噬菌體CP390溶素氨基酸序列。
[0015]圖4.SEQ ID NO:4:編碼噬菌體CP390溶素的示例性核酸序列。下劃線序列是各自基因的“起始”和“終止”位點。
[0016]圖5.CP26F溶素和CP390溶素的氨基酸序列的比較比對。【具體實施方式】
[0017]定義
如本文所使用的術語“家畜”是指在農業環境中飼養的一種或多種馴養家畜，通常但不必要地用于生產食品、纖維或者提供勞力。示例性家畜種類包括但不限于牛、豬、羊和家禽。
[0018]如本文所使用的術語“家禽”是指封閉培養或保存以用于繁殖、生產肉或蛋、或者補充獵物供應的家用禽類，例如，雞；火雞；珍珠雞；鴨；鵝；鵪鶉；鴿子；諸如野雞、鷓鴣、平胸鳥的獵鳥等。
[0019]如本文所使用的術語“抗微生物劑”、“殺微生物劑”或任意其他語法等同表達形式是指有效地控制諸如細菌(例如，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌)的微生物的任意組合物和/或物質。在示例性實施方案中，“抗微生物劑”是包含有效地控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的噬菌體裂解酶的抗微生物組合物。
[0020]如本文所使用，如在諸如短語產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的“控制”、“使控制”產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、“使控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌種群”、或者“使控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染”或者任意語法等同表達形式中的術語“控制”或者“使控制”是指用于預防感染或侵染；降低或消除已經感染的區域或生物體的種群；或者消除產氣莢膜梭狀芽孢桿菌或者需要“控制”的其他種屬的種群。的確，如本文所使用的“使控制”是指成功地預防、消除、降低或改善產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染、或者產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的種群的表征。
[0021]如本文所使用的表達“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染”是指獲取產氣莢膜梭狀芽孢桿菌微生物至“宿主”體內或體表。在一示例性實施方案中，“宿主”是動物，例如，雞。在另一示例性實施方案中，“宿主”是人。“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染”可或可不導致疾病。如本文所使用的表達“疾病”是指產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的特定案例，其中已經獲得產氣莢膜梭狀芽孢桿菌至其體內或體表的宿主與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌以使得導致具有外在表現的宿主損傷的方式來相互作用，該外在表現為例如疾病的臨床癥狀，例如，在種群中增加的死亡率、抑郁、起皺的 羽毛和深色腹瀉等。
[0022]如本文所使用的短語“有效量”或者“對……有效的量”或任意其他語法等同表達形式是指有效地控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的諸如本文所公開的抗微生物劑噬菌體裂解酶的物質的量。本領域普通技術人員鑒于其技術和該公開、在沒有過多試驗下能夠確定實施本文所公開的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌控制方法的抗微生物劑噬菌體裂解酶的有效量。例如，在較高或較低劑量下特定抗微生物劑噬菌體裂解酶可更加有效。通過使用本文所述的方法來評價家畜，例如家禽，例如雞，熟練操作人員能夠確定所述家畜是否能夠應答治療以及知道如何調節對應的劑量水平。
[0023]如本文所使用的術語“使預防”或“預防”是指成功地預防、或改善疾病或感染的任意表征，包括任何客觀或主觀參數，例如減少、緩和和/或消除癥狀。例如，如本文所使用的術語“使預防”或“預防”是指預防與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關的疾病；降低與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關疾病的嚴重程度；降低罹患與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關疾病的諸如家禽(例如，雞)的家畜的預期死亡或死亡率。在示例性實施方案中，通過比較如與未經飼養、或另外經抗微生物噬菌體裂解酶處理的家禽中癥狀、發病率和/或死亡率相比較的經飼養、或另外經抗微生物劑噬菌體裂解酶處理的癥狀、發病率和/或死亡率；以及觀察與未經飼養、或另外經抗微生物劑噬菌體裂解酶處理的家禽相比較的家禽的癥狀的嚴重程度或出現、和/或發病率和/或死亡率減輕、消除以及因而降低來測定與產氣莢膜梭狀芽孢桿菌相關的疾病預防的成功率。癥狀的預防、治療、降低或改善可基于客觀或主觀參數；包括組織樣品的物理檢查、活檢或微觀檢查、或者本領域已知的任何其他合適的方式。
[0024]如本文所使用的術語“壞死性腸炎”是指通常影響諸如雞、火雞和鴨的家禽的急性或慢性腸原性毒血癥疾病。病癥世界性爆發，并且通過產氣莢膜梭狀芽孢桿菌導致。疾病的特征尤其在與纖維蛋白-壞死性腸炎，通常在中-小腸中。
[0025]如本文所使用的術語“生物樣品”或術語“診斷樣品”是指從活或死生物體中獲得的任意樣品。生物樣品的例子包括諸如分離的脾、氣管、胸腺的分離的器官或身體部位；粘膜；棉簽，例如陰溝棉 簽、口咽棉簽。
[0026]如本文所使用的術語“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”或“噬菌體裂解酶”、或“裂解酶”、或“噬菌體溶素”、或“溶素”、“噬菌體內溶素”或者“內溶素”是指切割或者能夠切割肽部分、以及從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌的裂解的裂解酶，該肽部分在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁。在示例性實施方案中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶包含與SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少約90%同一'丨生的氨基酸序列。在一不例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌曬菌體裂解酶”或“噬菌體裂解酶”是源于噬菌體CP26F的CP26F溶素C-_fCP26F)，其依照布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規定于2010年6月23日保存在美國模式培養物保藏所(AmericanType Culture Collection) (ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11080，其切割或能夠切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁的肽部分，從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌的裂解，其中CP26F溶素包含與SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少約91%同一'丨生的氨基酸序列。在其他不例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP26F溶素以及包含與SEQ ID NO:1的氨基酸1-158有至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的氨基酸序列。在一示例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP26F溶素以及具有與SEQ ID NO:1的氨基酸1-212 有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的氨基酸序列。在另一示例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP26F溶素，該CP26F溶素切割或能夠切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁的肽部分，從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌的裂解，其中CP26F溶素具有根據SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在另一示例性實施方案中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶包含與SEQ ID NO: 3的氨基酸1-158有至少約90%同一性的氨基酸序列。在一示例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”或“噬菌體裂解酶”是源于噬菌體CP390的CP390溶素C?77_fCP390)，其依照布達佩斯條約的規定于2010年6月23日保存在美國模式培養物保藏所(ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11081，其切割或能夠切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁的肽部分，從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌的裂解，其中CP390溶素包含與SEQ ID N0:3的氨基酸
1-158有至少約91%同一'丨生的氨基酸序列。在其他不例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP390溶素，該CP390溶素切割或能夠切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁的肽部分，從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌的裂解，其中CP390溶素包含與SEQ ID NO: 3的氨基酸1-158有至少約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的氨基酸序列。在一示例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP390溶素以及具有與SEQ ID NO:3的氨基酸1-212 有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的氨基酸序列。在另一示例性實施方案中，“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶”是CP390溶素以及具有根據SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
[0027]產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶可由任意來源分離和/或可通過本領域已知方法來合成(參見例如，R.B.Merrifield (1963) J.Am.Chem.Soc.85 (14): 2149 -2154 ;美國專利4，192，798 ;美國專利5，763，284 ;美國專利5，942，609等)，只要它們基本上與如本文所公開的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列相同以及能夠切割在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處產氣莢膜梭狀芽孢桿菌屬的細菌肽聚糖細胞壁，從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。測定核苷酸和/或氨基酸序列同一'I"生和“基本上同一'I"生”的方法描述如下。
[0028]如本文所使用的術語“分離的”、“純化的”或“生物純的”是指基本上或本質上沒有當在其天然狀態下發現的常規伴隨的組分。在示例性實施方案中，使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法的分析化學技術來測定純度和均一性。作為在制劑中存在的主要種類的核酸基本上被純化。在一示例性實施方案中，將諸如26F裂解酶的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸與在其天然狀態下旁側相接噬菌體裂解酶核酸的開放閱讀框和/或其他核酸序列分離。在示例性實施方案中，術語“純化的”表示在電泳凝膠中核酸或蛋白導致基本上一條帶。通常，分離的核酸或蛋白具有表達為范圍的純度水平。組分的純度范圍的下端為約60%、約70%或約80%以及 純度范圍的上端為約70%、約80%、約90%或者大于約90%。
[0029]如本文所使用的術語“核酸”是指核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的聚合物。通常，“核酸”聚合物以單鏈或雙鏈形式出現，但也已知形成包含三或多鏈的結構。術語“核酸”包括天然存在的核酸聚合物以及包含已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，其為合成、天然存在的以及非天然存在的，其具有如參照核酸的類似結合性質，以及以類似于參照核苷酸的方式將其代謝。示例性類似物包括但不限于:硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
[0030]除非另有說明，特定核酸序列也暗示性涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡并密碼子置換物)以及互補序列、以及明確表示的序列。具體而言，通過生成其中一個或多個選擇的(或者所有)密碼子的第三位置被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列可獲得簡并密碼子置換物(參見例如，Batzer 等人，Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ；0htsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985);以及 Rossolini 等人，Mol.Cell.Probes8:91-98 (1994))o
[0031]在本文中可交換使用的術語“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸殘基的聚合物。術語應用至天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是對應天然存在的氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物。
[0032]術語“氨基酸”是指天然存在的和合成氨基酸、以及以類似天然存在的氨基酸的方式發揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是通過遺傳密碼編碼的那些、以及隨后經修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸鹽和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有如天然存在的氨基酸的相同基本化學結構(即，結合氫的碳、羧基、氨基以及R基團)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或者修飾的肽主鏈，但保留如天然存在的氨基酸的相同基本化學結構。氨基酸模仿物是指具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構，但以天然存在的氨基酸的類似方式發揮功能。
[0033]本文中氨基酸通過它們通常已知的三字母符號或通過IUPAC-1UB生化命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)推薦的一字母符號來指代。類似地，核苷酸可通過它們通常可接受的單字母代碼來指代。
[0034]“保守修飾的變體”應用至氨基酸和核酸序列。對于特定核酸序列，保守修飾的變體是指其編碼相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或者其中核酸未編碼氨基酸序列至基本上相同的序列。因為遺傳密碼的簡并性，所以大量功能上相同的核酸編碼任意給定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在通過密碼子指定丙氨酸的所有位置處，在未改變編碼的多肽下可將密碼子改變至所述任意對應的密碼子。這些核酸變化是“沉默變化”，其·是保守修飾的變化的一種類型。本文的編碼多肽的每一核酸序列也描述核酸的每種可能的沉默變化。技術人員意識到，可將在核酸中各密碼子(除通常為蛋氨酸的僅有密碼子的AUG、以及通常為色氨酸的僅有密碼子的TGG之外)修飾以生成功能上相同的分子。相應地，編碼多肽的核酸的各沉默變化暗示在各所述序列中。
[0035]至于氨基酸序列，技術人員意識到，在編碼的序列中改變、添加或缺失單個氨基酸或小百分率的氨基酸的對核酸、肽、多肽或蛋白序列的個別置換、缺失或添加是“保守修飾的變體”，其中變化導致氨基酸被化學上類似的氨基酸置換。提供功能類似的氨基酸的保守置換表格是本領域眾所周知的(參見，例如Creighton, Proteins (1984))。這些保守修飾的變體此外為以及不排除多形變體、種間同源物和等位基因。
[0036]以下八種基團示出一些示例性氨基酸，其為彼此的保守置換物:
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天門冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、纈氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；以及
8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)。
[0037]諸如多肽結構的大分子結構依據組織的各種水平。對于該組織的一般討論，參見例如，Alberts 等人，Molecular Biology of the Cell (第 3 版，1994)以及 Cantor和 Schimmel, Biophysical Chemistry Part 1: The Conformation of BiologicalMacromolecules (1980)。“一級結構”是指特定肽的氨基酸序列。“二級結構”是指在多肽內局部有序的、三維結構。這些結構通常稱為結構域。結構域是形成多肽的緊密單元的多肽的一部分，其通常為50至350個氨基酸長。通常結構域由更小組織的部分組成，例如β_折疊和α-螺旋的延伸。“三級結構”是指多肽單體的完整三維結構。“四級結構”是指通過獨立的三維單元的非共價締合形成的三維結構。各向異性術語也稱為能量術語。
[0038]如本文所使用的術語“標記”是指通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式檢測的組合物。示例性標記包括32P、熒光染料、高電子密度試劑、酶(例如，如通常在ELISA中所使用)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原以及可獲得抗血清或單克隆抗體的蛋白。
[0039]如本文所使用的“核酸探針或寡核苷酸”是指通過一種或多種類型的化學鍵、通常通過互補堿基配對、通常通過氫鍵形成能夠結合互補序列的靶核酸的核酸。如本文所使用，探針可包括天然(即，A、G、C或T)或者修飾的堿基(例如，7-去氮鳥苷、肌苷等)。此外，在探針中堿基可通過除磷酸二酯鍵之外的連接來接合，只要它不干擾雜交。因此，例如，探針可以為肽核酸，其中構成堿基通過肽鍵而不是磷酸二酯連接來接合。通過本領域技術人員理解，取決于雜交條件的嚴格性，在缺乏與探針序列的完整互補下探針可結合靶序列。在一示例性實施方案中，可直接使用同位素、發色團、發光團、色原體等標記探針。在其他示例性實施方案中，使用例如生物素來間接標記探針，抗生蛋白鏈菌素復合物可隨后結合至該探針。通過評估探針存在與否，人們可檢測選擇序列或子序列存在與否。
[0040]因此，如本文所使用的術語“標記的核酸探針或寡核苷酸”是指通過接頭或化學鍵共價或者通過離子、范德華力、靜電或氫鍵非共價使探針結合至標記，使得通過檢測結合至探針的標記的存在可檢測探針的存在。
[0041]如本文所使用的術語“引物”是指短核酸，通常為至少約15個核苷酸長度的DNA寡核苷酸。在示例性實施方案中，通過核酸雜交將引物與互補靶DNA鏈退火以形成在引物和靶DNA鏈之間的雜交物。然后通過DNA聚合酶將退火的引物沿著靶DNA鏈延伸。通過例如聚合酶鏈反應(PCR)或本領域已知的其他核酸擴增方法可將引物對用于擴增核酸序列。
[0042]通過例如使用諸如Primer (版本 0.5 ?1991, Whitehead Institute forBiomedical Research, Cambridge, Mass.)的旨在用于該目的的計算機程序，PCR引物對通常源于已知序列。本領域技術人員理解，隨著其長度增加，特定探針或引物的特異性增力口。因此，例如，包 含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的20個連續核苷酸的引物與具有比僅15個核苷酸的相應引物更高特異性的相關靶序列退火。因此，在示例性實施方案中，使用選擇包含選擇的序列的20、25、30、35、40、50或更多個連續核苷酸的探針和引物來獲得核酸引物或探針的更大特異性。
[0043]基于本文所公開的核酸序列容易制備核酸探針和引物。制備和使用探針和引物的方法和標記的方法以及選擇合適各種目的的標記指導討論于例如Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual 第 2 版 1989, Cold Spring HarborLaboratory ?，以及 Current Pro toco Is in Molecular Biology, Ausubel 等人編輯，1994，John Wiley & Sons)。當涉及例如細胞、或核酸、蛋白、或載體使用時,術語“重組體”表示通過引入異源性核酸或蛋白、或者改變天然核酸或蛋白來修飾細胞、核酸、蛋白或載體；或者細胞源于經修飾的細胞。因此，例如，重組體細胞表達在細胞的天然(非重組體)形式內發現的基因或者表達異常表達、過表達、表達不足或者根本未表達的天然基因。
[0044]如本文所使用的術語“啟動子”或“啟動子復合物”或“啟動子序列”是指引導核酸轉錄的核酸表達控制序列的陣列。如本文所使用，“啟動子”或“啟動子復合物”或“啟動子序列”包含靠近轉錄的起始位點處的諸如聚合酶II型啟動子、TATA元件等的必要核酸序列以“控制”可操作連接的核酸的轉錄。在一些示例性實施方案中，“啟動子復合物”或“啟動子序列”也包括末端增強子或阻遏物元件，其可以但不必要地位于轉錄的起始位點的多達數千堿基對處。在其他示例性實施方案中，“啟動子”或“啟動子復合物”或“啟動子序列”包括便于可操作連接的異源性核酸的轉錄和/或異源性核酸的最終蛋白產物的表達的序列，例如如本文所公開的內含子序列和/或內含子以及遍在蛋白單體序列。
[0045]如本領域眾所周知，“連續”啟動子是在大部分環境和發育條件下為活性的啟動子。“可誘導”啟動子是在環境或發育調節下為活性的啟動子，例如，對溫度的應答上調。啟動子可全部源于天然基因；可包含天然基因的節段或片段；或者可由源于天然發現的不同啟動子的不同元件組成；或者甚至包含合成DNA節段。本領域技術人員理解，不同啟動子可引導在不同組織或細胞類型中、或者在不同發育階段、或者應答不同環境或生理條件的基因表達。進一步理解，相同啟動子可區別地表達在不同組織中和/或區分地表達在不同條件下。
[0046]如本文所使用的術語“在嚴格雜交條件下能夠雜化”是指在嚴格雜交條件下(以下所定義)使第一核酸與第二核酸退火。在示例性實施方案中，第一核酸是測試樣品，以及第二核酸是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的有義或反義鏈。在標準嚴格條件下進行第一和第二核酸的雜交，例如高溫和/或低鹽含量，其傾向于不利于不同核苷酸序列的雜交。
[0047]術語“可操作連接”是指在核酸表達控制序列(例如，轉錄因子結合位點的陣列)以及第二核酸序列(例如，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸序列)之間的功能性連接，其中表達控制序列引導應答第二序列的核酸的諸如轉錄的表達。在示例性實施方案中，“可操作連接”諸如產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的異源性核酸的啟動子位于異源性核酸的上游以及框架中。
[0048]當涉及一部分核酸使用時，術語“異源性”表示核酸包含天然發現彼此之間不是相同關系的兩個或更多個子序列。例如，核酸通常重組產生，其具有來自不相關基因的兩個或更多個序列以得到新的功能性核算，例如來自一種來源的啟動子以及來自另一來源的編碼區。類似地，異源性蛋白表示蛋白包含天然發現彼此之間不是相同關系的兩個或更多個子序列(例如，融合蛋白 )。
[0049]如本文所使用的“表達盒”是指通常通過重組或合成生成的核酸構建體，其包含使在宿主細胞中特定核酸可轉錄的一系列規定的核酸元件。在示例性實施方案中，表達盒包含可操作連接至啟動子的諸如產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶、諸如26F裂解酶序列、390裂解酶序列等的待轉錄的異源性核酸。
[0050]通常，“表達盒”是“表達載體”的一部分。如本文所使用的術語“載體”是指能夠復制選擇的宿主細胞或生物體的核酸。載體可復制為自發結構，或者可選擇地整合至宿主細胞染色體內，以及因而沿著宿主細胞基因組復制。因此，“表達載體”是在諸如質粒、病毒、人工染色體、核酸片段或者本領域已知的任意合適的構建體的選擇的宿主細胞或生物體中能夠復制的核酸，其包含“表達盒”。
[0051]如本文所使用的術語“轉化”涵蓋將核酸分子引入細胞內的任意和所有技術，包括但不限于使用病毒載體轉染；使用質粒載體轉化；以及通過電穿孔、脂質轉染、農桿菌屬感染和粒子槍加速引入裸DNA。
[0052]以下術語用于描述在兩種或更多種核酸或多核苷酸之間的序列關系:“參考序列”、“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性的百分比”以及“基本同一性”。“參考序列”是用作序列比較基礎所定義的序列；參考序列可以是較大序列的子集，例如，作為全長產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列或序列表中所給出的基因序列的節段，或者可包含完整產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列或基因序列。
[0053]在兩種或更多種核酸或多肽序列的文本中術語“同一性”或“同一性”百分比是指當如使用序列比較算法或通過手工比對和目視檢查測定的比較窗、或指定區域內比較和比對最大一致性時相同或具有相同的指定比例的氨基酸殘基或核苷酸(例如，85%同一性、90%同一性、99%或100%同一性)的兩種或更多種序列或子序列。
[0054]在兩種核酸或多肽的文本中短語“基本上相同”是指當如使用序列比較算法或通過目視檢查比較和比對最大一致性時，具有至少約85%同一性、至少約86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸或者氨基酸殘基同一性的兩種或更多種序列或子序列。在示例性實施方案中，基本同一性存在于至少約50個殘基長度的序列區域內。在另一示例性實施方案中，基本同一性存在于至少約100個殘基長度的序列區域內。在又一示例性實施方案中，基本同一性存在于至少約150或更多個殘基長度的序列區域內。在一示例性實施方案中，在核酸或蛋白序列的全部長度內序列基本上相同。
[0055]對于序列比較，通常一種序列用作比較測試序列的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，指定子序列坐標，如果必要，并且指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或者可指定可選擇的參數。然后基于程序參數，序列比較算法計算測試序列相對參考序列的序列同一性百分比。
[0056]如本文所使用，“比較窗”包括鄰接位置的選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150的任一數目的節段的參考，其中在任選比對兩序列之后可比較序列與鄰接位置的相同數目的參考序列。比較序列的比對方法是本領域眾所周知的。通過例如Smith & Waterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同一性算法；通過Needleman &ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源性比對算法；通過 Pearson & Lipman,Proc.Nat’1.Acad.Sc1.USA 85:2444 (1988)的類似性方法的研究；通過這些算法的計算機化實施(在Wisconsin遺傳軟件包,遺傳計算機組,575 Science Dr., Madison, ffis.中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA);或者通過手工比對和目視檢查(參見，例如，在CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯，1995增補))可進行比較序列的任選比對。
[0057]序列比較的示例性算法是PILEUP。使用漸進、逐對比對，PILEUP產生來自一組相關序列的多個序列比對以顯示關系和序列同一性百分比。它也繪制樹形或樹枝形結構圖，其顯示用于產生比對的聚集關系。PILEUP使用Feng & Doolittle, J.Mol.Evol.35:351-360 (1987)的漸進比對方法的簡化。使用的方法類似于Higgins & Sharp, CABIOS5:151-153 (1989)所描述的方法。程序可比對至多300個序列，其各自最大長度為5，000個核苷酸或氨基酸。多種比對方法由兩最相類似的序列的逐對比對開始，這得到兩比對的序列的簇。然后將該簇比對至最相關序列或者比對序列的簇。通過兩單獨序列的逐對比對的簡單延伸來比對序列的兩簇。通過一系列漸進、逐對比對來得到最終比對。通過指定序列比較區域的特異性序列和它們氨基酸或核苷酸坐標以及通過指定程序參數來運行程序。使用PILEUP，經使用以下參數來比較參考序列以及其他測試序列，從而測定序列同一性百分比關系:默認缺口重量(3.00);默認缺口長度重量(0.10);以及加權末端缺口。由GCG序列分析軟件包，例如，版本 7.0 (Devereaux 等人,Nuc.Acids Res.12:387-395 (1984)可獲得 PILEUP。
[0058]適合測定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一例子是BLAST和BLAST2.0 算法，其分別描述在 Altschul 等人，Nuc.Acids Res.25:3389-3402 (1977)和Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)中。進行 BLAST 分析的軟件通過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)公開獲得。通過在查詢序列中識別長度W的短單字,該算法包括第一次識別高得分序列對(HSP)，當在數據庫序列中比對相同長度的單字時，其匹配或滿足一些正值閾值得分T。T稱為相鄰單字得分閾值(Altschul等人，同上)。這些初始臨近單字點擊數用作開始尋找包含它們的更長HSP的種子。沿著各序列兩方向延長單詞點擊數，直至可增加累積比對得分。使用參數M(—對匹配殘基的獎勵得分；總是>0)和N(不匹配殘基的懲罰得分；總是〈0)對核苷酸序列計算累積得分。對于氨基酸序列，計分矩陣用于計算累積得分。當定量X由其獲得的最大值下降至累積比對得分；由于一個或多個負值計分殘余比對累積得分歸零或者更低；或者到達各序列的末端時，在各方向中單字點擊數的延伸中止。BLAST算法參數W、T和X測定比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用11的字長(W)、期望值(E)或10、M=5、N4和兩鏈的比較值作為默認值。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字長、10的期望值(E)、以及50的BL0SUM62計分矩陣(參見Henikoff & Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915 (1989))比對(B)、10 的期望值(E)、M=5、N=4以及兩鏈的比較值。
[0059]BLAST算法也進行兩序列之間的相似性的統計學分析(參見，例如，Karlin &Altschul, Proc.Nat’1.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787 (1993))。通過 BLAST 算法提供的相似性的一個測量值是最小和概率(P(N))，其提供兩種核苷酸或氨基酸序列之間可偶然出現匹配的概率。例如，如果比較測試核酸與參照核酸的最小和概率小于約0.2，更優選小于約0.01，以及最優選小于約0.001，則認為核酸類似于參考序列。
[0060]兩種核酸序列或多肽基本上相同的指示是通過第一核酸編碼的多肽與相對如下所述通過第二核酸編碼的多肽增加的抗體免疫交叉反應。因此，多肽與第二多肽通常基本上相同，例如，其中兩種肽僅保守置換上不同。兩種核酸序列基本上相同的另一指示是在如下所述嚴格條件下兩種分子或它們的補體彼此雜交。兩種核酸序列基本上相同的又一指示是可使用相同引物擴增序列。
[0061]短語“選擇性(或特異性)雜交”是指當該序列存在于復合混合物中(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)時在嚴格雜交條件下僅結合、成雙或雜交分子至特定核苷酸序列。通常，當在嚴格條件下兩種分子或它們的補體選擇性或特異性彼此雜交時，兩種核酸序列稱為“基本上相同”。
[0062]短語“嚴格雜交條件”是指通常在核酸的復合混合物中探針與它的靶序列、而不是其他序列雜交的條件。嚴格條件為序列依賴性以及在不同環境下不同。在較高溫度下更長序列特異性雜交。對核酸的雜交更廣泛的指導出現在Tijssen, Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overviewof principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中。通常，在所定義的離子強度pH下選擇嚴格條件為比特異性序列的熱熔點(Tm)低約5-10°C。Tni是在平衡時50%的與靶互補的探針與靶序列雜交的溫度(在所定義的離子強度、PH和核酸濃度下)(當在TmT存在的靶序列過量時，在平衡下占用50%的探針)。嚴格條件是其中在pH 7.0至8.3以及對于短探針(例如，10至50個核苷酸)至少約30°C以及對于長探針(例如，大于50個核苷酸)至少約60°C下鹽濃度小于約1.0 M鈉離子、通常約0.01至1.0 M鈉離子濃度(或其他鹽)的那些條件。添加諸如甲酰胺的去穩定劑也可達到嚴格條件。對于高嚴格雜交，正信號是背景的至少兩倍，優選背景雜交的10倍。示例性高嚴格或嚴格雜交條件包括:在42°C下50%甲酰胺、5xSSC和1% SDS孵育或者在65°C下5xSSC和1% SDS孵育，以及在65°C下0.2xSSC和0.1% SDS中洗滌。然而，可使用本領域已知的其他高嚴格雜交條件。
[0063]如果核酸編碼的多肽基本上相同，則在嚴格條件下彼此不雜交的核酸也基本上相同。當例如使用通過遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性產生核酸拷貝時這種情況會出現。在這些情況下，核酸通常在中等嚴格條件下雜交。示例性“中等嚴格條件”包括在37°C下40%甲酰胺、I M NaCl,1% SDS的緩沖劑中雜交以及在45°C下在IxSSC中洗滌。正雜交是背景的至少兩倍。本領域普通技術人員容易意識到，可利用可選擇的雜交和洗滌條件以提供類似嚴格的條件。
[0064]I.引言:
產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是產生毒素的 革蘭氏陽性厭氧的產孢細菌，該毒素可導致在各種動物、人和家禽中的疾病癥狀和發病機理。
[0065]在美國，疾病控制和預防中心(Centersfor Disease Control and Prevention)(CDC)報道產氣莢膜梭狀芽孢桿菌為食物傳播的疾病的第三種最常見原因，其經濟消耗預估超過$1.2億/年。據認為，制備差的肉和家禽是在人中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中毒的主要來源(參見例如，疾病控制和預防中心(O)C).Surveillance for foodbornedisease outbreaks - United States, 2006 以及遍冊P Morb Mortal Vkly Rep.2009,58, 609-615)。
[0066]除了在人中導致食物傳播的疾病之外，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌也是家禽和家畜的重要病原。在雞中，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是壞死性腸炎的病原體。壞死性腸炎是通常特征在于在家禽的小腸中壞疽病斑的急性或慢性腸原性毒血癥。壞死性腸炎的臨床征象包括例如可導致死亡的腹瀉、脫水和飼料消耗降低。令人恐懼地，家禽生產商、嚴重急性案例可具有高達50%的死亡率。
[0067]亞臨床感染也在家禽中作為亞臨床感染損害家禽生產商，這可導致對諸如雞的禽類的腸粘膜的損傷，從而導致降低的營養吸收、受限的重量增加以及增加的飼料轉化比率。
[0068]壞死性腸炎通常受到添加至飼料的抗生素控制。然而，有在動物飼料中使用抗生素可導致在人細菌病原體之間抗菌素抗性的證據(參見例如,Chapin等人，(2005) Fundam.Applied Toxicol., 29: 1-17) ?而且,一些國家已經禁止在動物飼料中使用抗生素，即使這些國家因而經歷梭菌壞死性腸炎的增加以及其他動物健康問題(參見例如，Casewell等人，(2003) Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52, 159 — 16)。
[0069]因此，對于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的改善控制本領域有明確需求。而且，有開發可選擇的抗微生物劑作為替代品或者補充當前使用的抗生素以控制在人和動物中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌以及其他致病病原體的需求。
[0070]因此,在一不例性實施方案中，本發明提供分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌曬菌體裂解酶序列，包括但不限于氨基酸序列和核酸序列，其編碼能夠切割肽部分的酶以及從而導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的裂解，該肽部分在位于肽部分的N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵處包含細菌肽聚糖細胞壁。因此，在本發明的一些示例性實施方案中，所公開的噬菌體裂解酶有效地控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。
[0071]因此，在一示例性實施方案中，本發明提供使用本文所公開的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶來控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的方法。
[0072]I1.分離噬菌體裂解酶和構建表達載體 A.一般方法
本發明利用重組體遺傳學領域中常規技術。公開在該發明中使用的一般方法的基本文本包括 Sambrook 等人，Molecular Cloning—A Laboratory Manual (第二版)，1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);以及Current Protocolsin Molecular Biology (Ausubel等人編輯，1994))。除非另有說明，根據常規用途來使用技術術語。在分子生物學中常見術語的定義可在例如，Benjamin Lewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew 等人(編輯)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (編輯)，Molecular Biology andBiotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
[0073]對于核酸，以千堿基(kb)或堿基對(bp)來給定尺寸。通常由測序的核酸、或公開的DNA序列的瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳得出評估值。對于蛋白，以千道爾頓(kDa)或氨基酸殘基數來給定尺寸。由測序的蛋白、由衍生的氨基酸序列或者由公開的蛋白序列的凝膠電泳來評估蛋白尺寸 。
[0074]例如根據首先由Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)描述的固相亞磷酰胺三酯方法；使用如在Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168 (1984)中所述的自動合成器可化學合成無市售的寡核苷酸。寡核苷酸的純化通過如Pearson & Reanier, J.Chrom.255:137-149 (1983)所述的天然丙烯酰胺凝膠電泳或者通過陰離子交換HPLC。
[0075]在使用例如Wallace等人，Gene 16:21-26 (1981)的測序雙鏈模板的鏈終止方法克隆之后可證實克隆基因和合成寡核苷酸的序列。
[0076]本文所公開的方法也可利用微生物學領域中常規技術。公開在該發明中使用的一般方法的基本文本包括例如ifeiAoofe for General and Molecular Microbiology,第3 版，C.A.Reddy 等人編輯，ASM Press (2008) Encyclopedia of Microbiology,第 2 版，Joshua Lederburg 編輯，Academic Press (2000)。
[0077]除非另有說明，根據常規用途使用技術術語。在微生物學中常見術語的定義可在例如，Cliffs Notes1.Edward Alcamo, Wiley (1996) !Encyclopediaof Microbiology, (2000)見上；Singleton 等人，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology (第2版，1994)中找到。在分子生物學中常見術語的定義可在例如，Benjamin Lewin, Genes V,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人(編輯)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);以及 Robert A.Meyers (編輯)，Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)中找到。
[0078]分離包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的核酸的方法
使用本領域技術人員已知各種方法中任一項可分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸，其可用于分離細菌核酸序列。例如，可由編碼諸如26F裂解酶基因、390裂解酶基因等的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸基因的基因組DNA片段來分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸。在圖2中顯示示例性“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因”。在圖4中顯示另一示例性“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因”。術語“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因片段”或“產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因片段”是指一部分產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因，其小于基因的全部啟動子和編碼區。如下公開可制備編碼諸如26F裂解酶和產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因片段的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的基因組片段。
[0079]在示例性實施方案中，使用標記的寡核苷酸探針由基因組DNA文庫克隆包括產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸序列和相關核酸序列的核酸序列。在另一示例性實施方案中，使用擴增技術和標記的寡核苷酸引物由基因組DNA文庫克隆包括產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸序列和相關核酸序列的核酸序列。
[0080]產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶核酸通常包含與在SEQ ID N0:2中所示核酸序列的核苷酸1-642或者在SEQ ID N0:4中所示核酸序列的核苷酸1-642相同、或顯示基本序列同一性(如上定義)的序列。
[0081]因此，在嚴格雜交條件下產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶通常與SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的核 酸序列的堿基對1-642雜交。
[0082]為了制備基因組文庫，通常將DNA由目標組織提取以及機械剪切或酶消化以生成約15-20 kb的片段。然后通過梯度離心從將片段與非所需尺寸分離，并且構建在噬菌體λ載體中。如Sambrook等人，同上所述體外包裝這些載體和卩遼菌體。如Benton和Davis,Science, 196:180-182 (1977)中所述通過噬斑雜交來分析重組體噬菌體。通常如在M.Grunstein 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA., 72:3961-3965 (1975)中所述來進行菌落雜交。例如在DNA印跡上通過與包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的標記的核酸探針雜交的能力來識別在基因組文庫中編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因和/或產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因片段的DNA。通過本領域技術人員熟悉的標準方法來分離雜交DNA區域。參見例如，Sambrook等人，同上。
[0083]在示例性實施方案中，通過篩選具有標記的寡核苷酸探針的DNA文庫來分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列，該標記的寡核苷酸探針具有源于由在圖2，SEQ IDNO: 2中所示產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CP26F噬菌體裂解酶的DNA序列的核苷酸1_642的序列。在另一示例性實施方案中，通過篩選具有標記的寡核苷酸探針的DNA文庫來分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列，該標記的寡核苷酸探針具有源于在圖4，SEQ IDNO:4中所示產氣莢膜梭狀芽孢桿菌CP390噬菌體裂解酶的DNA序列的核苷酸1_642的序列。
[0084]在又一示例性實施方案中，通過篩選和分析噬菌體基因組解析來分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列。
[0085]也可將本領域已知的其他方法用于分離包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的DNA片段。參見例如，SambiOok等人對DNA分離的其他技術的描述涉及已知序列的DNA分子。
[0086]產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的序列特征
全長噬菌體裂解酶通常包含約642個核苷酸。全長CP26F噬菌體裂解酶的序列作為SEQ ID N0:2顯示在圖2中。全長CP26F噬菌體裂解酶的序列作為SEQ ID N0:4顯示在圖4中。
[0087]本文所公開的CP26F和CP390噬菌體裂解酶具有高的整體序列相似性。然而，相似性不均衡地分布在序列長度內。例如，在C末端細胞壁結合結構域處所預期的蛋白氨基酸序列相同，而在N末端催化結構域處僅彼此共享56%同一性。具體而言，PlyCP390的殘基164至213與編碼細胞壁結合結構域的PlyCP26F的殘基163至212相同。蛋白的可變N末端區域至位置162均為N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。
[0088]包含噬菌體裂解酶序列的載體的構建
一旦已經分離產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列，可使用各種方法構建表達盒、載體和其他DNA構建體。可以各種方式構建包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的表達盒。本領域技術人員充分意識到，遺傳成分必須呈現在表達構建體/載體上以成功轉化、選擇和傳播在宿主細胞中的表達構建體。操作編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的核酸的技術，例如亞克隆核酸序列至表達載體內、標記探針、DNA雜交等通常描述在Sambrook等人，同上中。
[0089]可將可操作連接異源性DNA序列的包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的DNA構建體插入各種載體內。通常，選擇的載體是用于轉化諸如大腸桿菌的細菌的表達載體。表達載體可以是質粒、病毒、粘粒、人工染色體、核酸片段等。通過使用本領域技術人員眾所周知的重組體DNA技術可構建這些載體。然后可將包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的表達載體轉染/轉化至靶宿主細胞內。然后基于如下所公開的合適的標志物基因的存在來選擇成功轉化的細胞。
[0090]本領域技術人員可獲得大量重組體載體以用于細菌和其他微生物的穩定轉染(參見例如,Sambrook等人，同上)。通過本領域技術人員容易地選擇恰當的載體。在示例性實施方案中，已知載體用于產生包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的表達構建體。
[0091]通常，轉化載體包括可操作連接啟動子序列的一種或多種克隆的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶基因(或cDNA)以及可選擇標志物。這些轉化載體通常也包括轉錄啟動起始位點；對其表達控制為所期望的異源性核酸；核糖體結合位點；RNA加工信號；轉錄終止位點；和/或聚腺苷酸化信號。
[0092](1)調控元件
除產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列或其衍生物之外，如所公開制備的表達構建體可包含另外的元件。在示例性實施方案中，包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的表達構建體也包含增強子序列，使得可增強異源性蛋白的表達。如本領域所已知，通常在5’至轉錄的起始處發現增強子，通常可向前或向后定向將它們由5’或3’插入編碼序列。
[0093](ii)標志物基因
如上所示，轉化/表達載體通常包括可選擇和/或可篩選的標志物基因以使得容易識別轉化體。示例性可選擇的標志物基因包括但不限于編碼抗菌素抗性(例如，對卡那霉素、氨芐青霉素等抗性)的那些。示例性可篩選標志物包括例如在重組蛋白的C末端處引入的六個氨基酸組氨酸標簽。
[0094]在示例性實施方案中，將可選擇或可篩選的標志物基因采用作為、或者另外為目標特定基因以提供或增強識別轉化體的能力。如本領域所知，“標志物基因”是賦予不同表現型至表達標志物基因的細胞的基因，使得轉化的細胞可區別于不具有標志物的細胞。在一示例性實施方案中，標志物基因編碼可選擇標志物，其可通過例如經使用選擇劑(例如，抗生素等)的化學方式來“選擇”。另一示例性實施方案中，標志物基因編碼可篩選標志物，其通過觀察或測試來識別，例如通過“篩選”(例如，在重組蛋白的C末端處使用弓I入的六個氨基酸組氨酸標簽)。
[0095]多種可選擇的標志物基因是本領域中已知的(參見例如，Sambrook等人，同上)。
[0096](iv)其他載體組分
在一些不例性實施方案中，表達載體進一步包含接合表達的異源性核酸的編碼序列的序列，將其由初始翻譯產物中翻譯后移除。在一示例性實施方案中，翻譯后移除的序列便于蛋白轉運至或通過細胞內或細胞外膜，從而便于蛋白轉運至區室內和/或細胞外。在示例性實施方案中，翻譯后移除的序列保護初生蛋白免于細胞內蛋白質降解。在一不例性實施方案中，將編碼前導肽序列上游 以及在具有選擇的編碼序列的閱讀框架中核酸片段用在宿主細胞中編碼序列的重組體表達。
[0097]在另一示例性實施方案中，表達構建體包含細菌復制起點，例如ColEl起點。在又一示例性實施方案中，表達構建體/載體包含細菌可選擇的標志物，例如，氨芐青霉素、四環素、潮霉素、新霉素或氯霉素抗性基因。
[0098]如本領域眾所周知，表達構建體通常包含限制性核酸內切酶位點以便于載體構建。示例性限制性核酸內切酶識別位點包括但不限于限制性核酸內切酶No11、AatI1、SacII, PmeI HindII1、Pst1、EcoRI 和 BamHI 的識別位點。
[0099]宿主細胞、轉化和選擇技術
可將含有可操作連接諸如啟動子序列的異源性DNA序列的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的DNA構建體用于轉化細胞和產生分離的溶素肽。
[0100]使用包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶序列的表達構建體轉化的示例性宿主細胞包括但不限于例如大腸桿菌。
[0101]通過本領域技術人員容易地選擇合適的轉化技術。本領域技術人員可獲得的示例性轉化/轉染方法包括但不限于:電穿孔、氯化鈣轉化等，這些方法均是本領域技術人員眾所周知的(參見例如，Sambrook,同上)。
[0102]工業規模生產:批和連續發酵在不例性實施方案中，用于產氣莢膜梭狀芽孢桿菌曬菌體裂解酶的生產方法以工業規模進行。
[0103]通常，為了按比例增加培養能夠產生用于工業規模生產的可分離量的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶微生物方法，首先將微生物的培養物按比例增加至中試規模(例如，0.07、0.8、19 m3)，以及然后至生產規模(例如，57 m3)。在一示例性實施方案中，能夠產生在工業生產中按比例增加的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的微生物是大腸桿菌。
[0104]如技術人員理解，在不同環境和營養條件下需要大量發酵以找到特定生物過程按比例增加的最佳條件。
[0105]最佳化通常由搖瓶實驗開始，然后按比例配在I至100升實驗室規格生物反應器中(參見例如，Hebbar, K.P.等人(1997) Appl.Microbiol.Biotechnol.48\ 714-719;Tholudur, A.等人，Biotechnol.Bioeng.66:1 16 (1999))。為了減少最佳化所需實驗次數，可使用數學模型(參見例如，Alvarez-Ramirez, J.等人，J.Chem.Technol.Biotechnol.74: 78 84 (1999) ；Βοοη, Μ.Α.等人，Biotechnol Bioeng.64: 558 567(1999) ；Cooney, M.J.等人，Biotechnol.Prog.15: 898 910 (1999) ；Tholudur A.等人，Biotechnol.Bioeng.66:1 16 (1999))。
[0106]通常基于維持在液體(肉湯)中恒定溶解的氧氣濃度、而不取決于反應器尺寸來按比例增加微生物生長。此外，必須將溫度、壓力、PH和流速保持在非常特異的水平以確保最佳培養生長，因而最佳化諸如苯乙烯的產物的產生(參見例如，T.J.Bailey和 D.0llis, Biochemical Engineering,第 2 版，McGraw-Hill, New York, 1987 ；D.ff.Hubbard, L.R.Harris,和 M.K.ffierenga, Chem.Eng.Prog., 84 (8)，p.55(1988) ；D.C.WangFermentation and Enzyme Technology, Wiley, New York,(1979) ；H.Scott Fogler, Elements of Chemical Kinetics and Reactor Calculations,Prentice-HalI, New Jersey, (1974) !Encyclopedia of Bioprocess Technology,Flickinger, M.C.,和 Drew, S.ff.編輯 John Wiley & Sons (2008))。
[0107]如本領域眾所周知，可將在發酵中混合工序的按比例增加分解為單獨的、相關的步驟(參見例如，Oldshue, J.Y.(1966) Biotechnol.Bioeng.8: 3-24)。從而使得可單獨考慮待評估的在氣液吸收中混合、流體切變速率、共混和熱轉移的作用。因為生物反應器是三維的，所以本領域技術人員理解記住當線性尺寸增加時作為線性尺寸立方的體系容量增加的重要性。隨著該按比例增加，其他變量以不同指數在線性比例上增加，該指數可由負數至零、至三和更高變化。
[0108]待考慮的其他 因素包括但不限于:對剪切應力的控制,如果它太大,可導致在培養物中細胞裂解。因此，需要仔細平衡細胞、營養素和氧氣的按比例增加和徹底混合。此外，細胞可聚集，其造成維持營養物供應和廢物移除的問題。
[0109]可獲知該公開以及本領域中知識的熟練技術人員能夠測定和最佳化本文所公開方法使用的大規模發酵工序。在示例性實施方案中，本工序采用發酵的批方法(參見例如，Cinar, A.等人(2003) Batch Fermentation: Modeling, Monitoring, and ControlCRC Press) 0在另一示例性實施方案中，本工序采用連續發酵方法(參見例如，美國專利
4,748, 123 ；Karkare, S.B 等人(1985)沿o/7fecA/?o7oF3，247 - 251)。
[0110]控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的方法在一些示例性實施方案中，本文所公開的噬菌體裂解酶用于治療被產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的包括人的動物。可使用任何合適的施用途徑來施用噬菌體裂解酶，包括但不限于:口服、氣溶膠或遞送至肺的其他裝置、鼻腔噴霧劑、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、陰道、直腸、局部、腰椎穿刺、鞘內以及直接施用至腦和/或腦脊膜。以下本文公開一些示例性用途。
[0111]O表面消毒劑:
在一些示例性實施方案中，使本文所公開的噬菌體裂解酶與以下已知表面消毒劑聯合，例如:(i)各類防腐劑，例如但不限于苯甲酸和BHT;以及(ii)與噬菌體相容的各種消毒劑，例如但不限于季銨化合物。
[0112]抗生素
在示例性實施方案中，與已知抗微生物劑(包括抗生素和化療劑)聯合使用本文所公開的噬菌體裂解酶，包括但不限于例如萬古霉素、乳鏈菌肽、達氟沙星和新霉素。
[0113]表面活性劑
在示例性實施方案中，本文所公開的噬菌體裂解酶與已知表面活性劑聯合使用以及將其用于處理食物加工設備。表面活性劑有助于潤濕表面，使得將噬菌體裂解酶分布在各表面上；以及有助于增溶和去除臟污。示例性表面活性劑包括例如吐溫80、20和81以及Dobanol ο
[0114](iv)包含噬菌體裂解酶的家畜飼料的配制
在示例性實施方案中，制備包含作為添加劑的噬菌體裂解酶的動物飼料配制物。 [0115]在一些示例性實施方案中，通過例如將本文所公開的噬菌體裂解酶包含在飼料產品中將它們用于治療動物。用作遞送噬菌體裂解酶的媒介物的特定飼料產品對于本領域技術人員顯而易見。
[0116]在一些示例性實施方案中，噬菌體裂解酶是凍干的形式，隨后將其添加至飼料配制物。據估計曬菌體裂解酶的施用劑量為約40mg/kg/天至約100 mg/每kg/每天的范圍。在其他示例性實施方案中，據估計噬菌體裂解酶的施用劑量為約50 mg/每kg/每天。在其他示例性實施方案中，據估計噬菌體裂解酶的施用劑量為約60 mg/每kg/每天。在其他示例性實施方案中，據估計噬菌體裂解酶的施用劑量為約70 mg/每kg/每天。在其他示例性實施方案中，據估計噬菌體裂解酶的施用劑量為約80 mg/每kg/每天。在其他示例性實施方案中，據估計噬菌體裂解酶的施用劑量為約90 mg/每kg/每天。施用噬菌體裂解酶直至達到成功控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌，例如直至產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的量基本上降低。
[0117]盡管對于不同家畜品種配制不同配制物，但在示例性實施方案中，將飼料配制物配制為適合向家禽喂食。
[0118]術語飼料或飼料組合物意思是適合于、或旨在由諸如家禽的動物攝取的任何化合物、制劑、混合物或組合物。在示例性實施方案中，將本文所公開的噬菌體裂解酶直接添加至飼料中。在其他示例性實施方案中，將本文所公開的噬菌體裂解酶用于生產基本上添加至飼料(或在處理工序中使用)的諸如飼料添加劑或預混物的一種或多種中間體組合物。
[0119]提供以下例子以說明、但不限制本發明。
實施例
[0120]實施例1:以下例子示出產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的噬菌體裂解分離。
[0121]細菌宿主、噬菌體分離和增殖
將產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離菌39和26用作由在雅典當地，GA雞加工設施處0.45 Mm經過濾的內臟洗滌物(offal wash) (O)或雞糞便(F)中獲得的噬菌體增殖的宿主。宿主菌株的特征在于標準方法和16S序列分析(Collins等人，1994 ;Wise和Siragusa, 2005)。在由家禽(腸物質)、土壤、污水和家禽加工排放水中獲得的過濾樣品上進行產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的噬菌體裂解的初始篩選。通過易受分離的噬菌體影響的菌株的抽樣試驗和滴定來識別能夠裂解產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌株的細菌病毒。使用經厭氧箱培養的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離菌39和26宿主細菌(Wise和Siragusa, 2005)，通過標準工序(Ackermann和Nguyen，1983)來增殖產氣莢膜梭狀芽孢桿菌特異性噬菌體CP390和CP26F。使噬菌體經過三次噬斑純化的循環以及使其一直懸浮在TMGS (IOmM Tris，pH 8，IOmM Mg++, 0.55%NaCl, 0.1%明膠)中。隨后，在用于病毒純化和DNA提取的厭氧條件下利用平板裂解方法(Helms等人，1985)來增殖噬菌體CP390和CP26F。
[0122]噬菌體的純化，基因組DNA純化和電子顯微鏡術。通過兩種方法來純化依照布達佩斯條約的規定于2010年6月23日保存在美國模式培養物保藏所(ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11081的噬菌體CP390以及依照布達佩斯條約的規定于2010年6月23日保存在美國模式培養物保藏所(ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11080的噬菌體CP26F的基因組DNA。在進行厭氧箱中平板裂解之后(參見例如，Helms等人，(1985) DNA.4:39-49)，使用Qiagen? λ噬菌體DNA分離材料來純化噬菌體基因組DNA。此外，通過以4190 x g離心20分鐘來從平板裂解物純化噬菌體以去除細菌碎片以及低熔點瓊脂糖。通過以103，800 X g離心90分鐘、隨后在 I ml TBS(在pH 7.5下20 mM Tris, 500 mM NaCl)中懸浮，將澄清的上清液用于沉淀病毒。在15至55%蔗糖-TBS梯度內分層噬菌體混懸物以及在Beckman?JS 24.38轉子中以103,800 x g離心90分鐘。收集噬菌體帶；通過離心濃縮；以及將混懸的沉淀置于20%至50%連續酒石酸鉀梯度(Misra等人，1981)以及在Beckman? JS 24.15轉子中以105，000 X g離心90分鐘。將噬菌體帶由梯度中提取；稀釋在TBS中，并且在Beckman? JS 24.15轉子中以105，000 x g離心90分鐘，隨后在TBS中混懸。通過本領域已知方法的電子顯微鏡術來檢查噬菌體的純度。在0.1%十二烷基肌氨酸鈉和0.2 M EDTA的存在下使曬菌體沉淀經過蛋白酶K (20mg/ml)消化，隨后經苯酹-氯仿提取(Sambrook等人，同上)以獲得通過乙醇沉淀的基因組DNA。
[0123]實施例2:
以下例子示出分子克隆、測序、基因組DNA的注解和系統發生分析。
[0124]在進行噬菌體基因組DNA的純化之后，在260/280 nm下對核酸進行分光光度計讀數以及限制性內切酶消化，隨后為瓊脂糖凝膠電泳以評估純度(Sambix)Ok等人，同上)。通過MWG Biotech, Inc High Point, NC USA來完成噬菌體基因組的全長基因組測序。簡而言之，使用噴霧器將噬菌體基因組DNA剪切，使其鈍端修補和脫去磷酸(Sambrook等人，1989)。在轉化之后將所需尺寸(I至4 kb)的DNA片段鈍端連接至pSmart (Lucigen?)以用于大腸桿菌的增殖。測序克隆物，使得為基因組獲得約14倍冗余，該基因組包括引物步移以填充缺口(Fouts等人，2006)。也使用限制酶歷fldllIjcoRljcoRVdJwI和Clal完成分子克隆以切割噬菌體基因組DNA，隨后使用Taq聚合酶處理(Lewis等人，1992)，并且克隆(Mead等人，1991)至TOPO TA載體(Invitrogen?)內。此外，為了克隆限制酶片段至pSmart載體(Lucigen?)內以用于核苷酸測序而完成端修復和G-加尾。完成使用熒光標記的雙脫氧法核苷酸終止劑的雙鏈核苷酸測序反應，以及使用自動化的序列分析儀來測定序列(Smith 等人，1986; Applied Biosystems Inc.)。
[0125]使用IntelliGenetics Genefforks 2.5.1? (IntelliGenetics, Mountain View,CA)、MacVector 7.2? (Accelrys, San Diego, CA)和 DNASTAR? (Madison, WI)軟件來進行核苷酸序列編輯、分析、氨基酸序列的預測以及比對。使用原核生物(http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark; Lukashin 和 Borodovsky.1998)的 GeneMark.hmm 以及ORF Finder (http://ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)軟件來預測在最終基因組序列的開放閱讀框(ORF)。通過使用BLAST (Altschul等人，1990)和PS1-BLAST或BLASTP(Altschul 等人，1997; Schaffer, 2001)以及保留的結構域數據庫(Marchler-Bauer,2007)算法針對蛋白數據庫來檢索預測的蛋白氨基酸序列。經使用Parsimony (PAUP*4.0b;Swofford, 2001)軟件的系統發生分析來構建在蛋白序列之間的系統發生關系。通過2000引導程序復制(Hedges，1992)來評估所有系統發生關系。利用大末端酶蛋白以預測DNA包裝機制和病毒粒子端的結構(Casjens等人,2005)。
[0126]實施例3:
以下例子示出分離的CP390 (PTA-11081)和CP26F (PTA-11080)噬菌體的病毒粒子純化、二維電泳和蛋白質組分析。
[0127]二維(2D)凝膠電泳的純化的病毒粒子樣品制備。通過添加四體積的冷(_20°C )丙酮至少一小時至離心的噬菌體沉淀來完成噬菌體蛋白純化。在4°C下以16，000 X g離心在丙酮中的可溶性蛋白餾分10分鐘。在冷丙酮/水(4:1)中將沉淀洗滌三次，隨后離心，并且真空下干燥(Champion等人,2001; Lee和Lee, 2003)。為了確保可再生凝膠電泳,在37°C下根據生廠商說明書(New England BioLab?)使用N-糖苷酶F (PNGase F)將純化的病毒粒子蛋白餾分消化Ihr以在使用丙酮萃取之前從N連接的糖蛋白(Maley等人，1989)中切割低聚糖。此外，按照“2-D凝膠提純”進一步純化在初始提取之后獲得的水丙酮沉淀以去除干擾物質，例如鹽、 清潔劑、脂質或酚醛樹脂(Amersham?)。
[0128]將蛋白樣品混懸在電泳緩沖劑(5M脲，2M硫脲，2% CHAPS, 2% SB3-10,具有40 mMTris的0.2% 3/10兩性電解質，pH 7.4)。使樣品渦旋，隨后在22°C下以16，000 x g離心10 mirio通過如施用至細菌的二維(2-D)凝膠電泳(O’ Farrell, 1975)來完成蛋白質組學分析(Champion等人，2001; Lee和Lee, 2003)。將蛋白混懸在裂解物緩沖劑中，隨后等電聚焦(pH 3-10)在第一維度中，隨后為 SDS-PAGE (O’Farrell, 1975; Bjellqvist 等人，1993)。使用PDQuest版本7.3.0 (Bio-Rad, Hercules, CA)以一式三份由各分離菌在Bio-Rad VersaDoc 4000成像器分析凝膠上定性完成斑點測定和圖案匹配。由肽質譜分析指紋識別提取的2-D凝膠和蛋白取芯目標蛋白斑點。使用BioRad EXQuest斑點切割器來切割斑點以及使用 Genomic Solutions Proprep 來消化(Finhout 和 Lee, 2003)。
[0129]通過質譜分析對純化的噬菌體蛋白的識別。利用通過MALD1-T0F-T0F MS(Aebersold等人，1987; Lahm和Langen, 2000)獲得的胰蛋白酶肽分子質量以通過檢索在國家生物技術信息中心，具有ProFound的PIR和Swiss-Prot (Proteomics, NY, NY)處蛋白序列Mascot數據庫以及來自噬菌體基因組的預測氨基酸序列來識別蛋白。具體而言，準備樣品以及使用來自Millipore的ZipTipu_C18點樣在MALDI (激光解析電離(MatrixAssisted Laser Desorption 1nization))革巴上。抽吸樣品并且分散于 ZipTipu_C18,并且使用含有5mg/ml MALDI基質(α -氰基-4-羥基肉桂酸)的調節溶液(70% ACN, 0.2%甲酸)來洗脫，將0.5μ1點樣至MALDI靶上。
[0130]使用具有T0F/T0F光學器件的Applied Biosystems 4700蛋白質組學分析器來分析樣品。使用842.51和2211.10的m/z的胰蛋白酶自溶產物作為內標物在700至4000的m/z范圍中收集MALD1-MS數據。使用Applied Biosystems GPS探測器軟件來分析數據。使用ABI 4700 MALDI T0F/T0F (Applied Biosystems)來收集所有質譜數據。收集在反射器模式中700 - 4000道爾頓的質量范圍的數據以及平均各質譜的1250激光發射。如果存在胰蛋白酶自溶的842.51和2211.10離子，則將各樣品進行內部校準。如果均未發現兩離子，則儀器使用默認校準。將不在排除列表上來自MS分析的八種最強離子進行MS/MS。對于MS/MS分析，使用各光譜平均5000激光發射，質量范圍為70至具有-1至3道爾頓的先驅窗的先驅離子。將數據保存在Oracle數據庫。
[0131]由Oracle數據庫選出肽數據以及通過GPS探測器軟件(Applied Biosystems)從由ABI 4700生成的原始數據來產生峰列表。該峰列表基于信噪比過濾以及排除列表，并且包括去同位素。然后通過Mascot (Matrix Science)檢索結果文件。如果將樣品內部校準則使用20 ppm的公差以及如果應用默認校準則為200 ppm公差。通過以下標準來驗證蛋白識別:在所有MS離子上以及在至少兩種MS/MS光譜中所有離子上大于20 ppm質量準確度，其未被修改，必須進行說明。數據庫檢索參數包括I缺失的切割、蛋氨酸的氧化和半胱氨酸的脲基甲基化。
[0132]實施例4
以下例子示出噬菌體溶素基因的PCR克隆。通過本領域已知方法設計擴增引物以擴增噬菌體CP26F溶素和噬菌體CP390溶素基因，同時引入用于亞克隆的限制酶位點至測序和表達載體內(參見例如，Pritchard, D.G等人(2004) Microbiology150:2079-2087.;Donovan, D.Μ.等人，(2006) Appl.Environ.Microbiol.72:2988-96)。對于克隆基因至pet2Id內，將純化的phiCP26F DNA用作模板以及使用引物plyCP26F卿Y (5，TAC CAT GGT GAT AAT TGG AAG TAG ATA T 3，[SEQ ID NO:5])和plyCP26F-plyCP390en (5，GTG GTG CTC GAG TAT CTT TTC GGC AAA GCA AT 3，[SEQID N0:6])擴增。在正向和反向引物中分別對AfcoI和通ol限制位點劃下劃線。對于克隆plyCP390基因至pet2Ia內，將純化的phiCP390 DNA用作模板以及使用引物plyCP390expF (5，GCA CTA CAT ATG AAA ATA GCT TTA AGA GGT GGA 3’ [SEQ ID NO:7])取plyCP26F-plyCP390ejR (5，GTG GTG CTC GAG TAT CTT TTC GGC AAA GCA AT 3’[SEQID N0:8])來擴增。在正向和反向引物中分別對#而1和通ol限制位點劃下劃線。使用旋轉柱(Qiagen ? )來純化PCR產物以及使用AfcoI和ZAoI iplyCP26F)或者和ZAoI(plyCP390)來消化。將消化的PCR產物經旋轉柱純化以及分別使用類似消化的載體pet21d和pet21a分別來連接。然后使用大腸桿菌Top 10細胞(Invitrogen ? )來轉化所得構建體。通過直接核苷酸測序使用各限制酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的分離的質粒消化來篩選轉化體。然后將在表達的正確定向中含有基因的質粒轉化至大腸桿菌Rosetta 2 (DE3)菌株內。[0133]因此，使用具有寡核苷酸引物的純化噬菌體基因組DNA作為模板來PCR擴增編碼噬菌體內溶素PlyCP390和PlyCP26F的基因，該寡核苷酸引物包括Met起始和終止位點以包括C末端His-標簽。
[0134]將擴增產物克隆至測序和表達質粒內以及轉化至大腸桿菌內。因為產氣莢膜梭狀芽孢桿菌是革蘭氏陽性生物體，利用Rosetta菌株來基因表達，如本領域所知，這些細菌也含有提供合適tRNA基因的質粒以減輕當在大腸桿菌中表達異源性蛋白時密碼子偏倚(參見，例如，Kane, (1995) Curr.0pin.Biotechnol.6:494-500)。對于Met 起始點完整，而將ATG并入起始位點引物，由于在初始基因中N末端氨基酸編碼預測蛋白中Val。
[0135]克隆的噬菌體DNA的初始核苷酸測序證實編碼具有各噬菌體內溶素的預定氨基酸序列的蛋白的內溶素基因的存在。然后將基因表達為C末端、His-標簽的蛋白，然后通過N1-柱層析來純化。通過凝膠電泳來分析純化的蛋白，其導致兩種蛋白可檢測，該兩種蛋白各自具有對應接近25，000的分子尺寸的相對流動性。在進行斑點試驗之后含有表達的溶素和純化的蛋白的大腸桿菌裂解物能夠在匯合的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的板上產生清楚的“斑塊”。
[0136]實施例5
以下例子示出噬菌體溶素的表達、提取制備和蛋白純化。
[0137]將以上實施例4所述具有質粒構建體的大腸桿菌Rosetta 2 (DE3)細胞在37C下振蕩條件下補充以100Pg/ml氨節青霉素和34 Pg/ml氯霉素的200ml Lurea Bertani (LB)肉湯中增殖。將對數中期(0.4至0.6的0D_J培養物置于冰上30分鐘，隨后使用ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)孵育，然后在20C下振蕩條件下孵育18小時。在4C下以5000 X g將培養物離心20分鐘。將細胞沉淀在_80°C下冷凍。使沉淀在冰上解凍以及懸浮在4ml的裂解緩沖劑中(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，IOmM咪唑，10%甘油，pH 8)。然后將混懸物聲波處理(15 X 5秒脈沖以及在脈沖之間置于冰上15秒)以及在4C下以5000 X g離心30分鐘。將所得上清液 用作澄清的裂解物。根據生產商說明書(Qiagen, Valencia,CA)將I ml的N1-NTA (鎳基質)漿料加入澄清的裂解物，伴隨在4C下輕微振蕩I小時。然后將漿料填充至柱中，以及使得經重力流動通過。使用4ml的洗滌緩沖劑(在pH 8.0下50mM NaH2P04,300mM NaCl，20mM咪唑，10%甘油)將柱子洗滌兩次以及使用2ml樣品緩沖劑(在 pH 8.0 下 50mM NaH2P04, 300mM NaCl,250mM 咪唑，10% 甘油)洗脫。
[0138]實施例6
以下例子示出噬菌體溶素蛋白的生物化學特征。
[0139]使用Qubit突光儀(Invitrogen, Carlsbad, CA)來測定如以上實施例5中所述制備的樣品中蛋白濃度。根據生廠商的說明書，使用在120V下在Tris-1fepes-SDS緩沖劑中在BioRad Min1-PROTEAN三種凝膠裝置中4-20%精確蛋白凝膠(Pierce, Rockford,IL)試驗I小時來分析洗脫的蛋白和Kaleidoscope?蛋白標準品(Invitrogen, Carlsbad,CA)(參見例如，Hames, B.D.(1981) An introduction to polyacrylamide gelelectrophoresis.在:B.D.Hames 和 D.Rickwood (編輯)，Gel Electrophoresis ofproteins: A Practical Approach, IRL Press, Oxford.第 1-91 頁)。使用 CoomassieBrilliant Blue R-250 (BioRad, Hercules, CA)染色凝膠I h,在蒸懼水中洗漆過夜,并且拍照。
[0140]通過Edman降解直接氨基酸測序純化的重組體噬菌體溶素。通過過濾通過ProSorb裝置(ABI)來將樣品施加至PVDF。通過本領域已知方法在ABI Procise 492 HT序列分析儀上使用標準脈沖液體循環來進行測序(參見例如，Niall, H.D.(1973) Meth.Enzymol.27: 942 - 1010)。此外，使用如本領域已知一些修訂形式通過質譜分析來測定蛋白序列(參見例如，Hunt 等人，(1986) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.83:6233-7;Rosenfeld, J.等人，(1992) Anal.Biochem.203: 173-179)。使用 ABI 4700 蛋白質組學分析器 MALDI T0F/T0F 質譜儀(Applied Biosystems, CA)、使用 4000 Series 探測器軟件V.3.6來收集所有質譜數據。將數據由Oracle數據庫提取以及通過GPS探測器軟件V3.6 (Applied Biosystems)由ABI 4700生成的原始數據來產生峰列表。如組合MS + MS/MS來進行分析。
[0141]抽取SDS-PAGE的單頻帶以及使其接觸N末端氨基酸序列，并且通過如上所討論的質譜分析來分析。兩種技術均證實蛋白的初始氨基酸序列如所預測為各克隆基因的核苷酸序列。噬菌體溶素的BLAST分析產生預測為N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶或MurNAc-LAA (也稱為肽聚糖氨基水解酶，NAMLA酰胺酶，NAMLAA，酰胺酶3，以及肽聚糖酰胺酶；EC 3.5.1.28)的各蛋白，其為水解在細菌細胞壁糖肽中介于N-乙酰胞壁酰基和L-氨基酸之間的酰胺鍵的自溶素(參見例如，Vollmer等人(2008) FEMS Microbiol Rev.32:259-86)。
[0142]溶素基因由兩種噬菌體克隆，該兩種噬菌體具有限制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的單種分離菌的宿主范圍。總之，該兩種噬菌體的基因組共享大于95%序列相似性。如之前所示，盡管在C末端細胞壁結合結構域處在兩基因組、溶素的預測蛋白氨基酸序列之間高整體序列相似性相同，但在N末端催化結構域處僅55%彼此類似(圖5)。尤其，PlyCP390的殘基164至213與PlyCP26F的殘基163至212相同。蛋白的可變N末端殘基至位置162預測為N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶。而且，PlyCP390和PlyCP26F與報道的艱難梭狀芽胞桿菌(C.difficile) 而不是產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的公開的噬菌體酰胺酶類型溶素更加緊密相關。然而，因為說明種屬特異性的蛋白的細胞壁結合結構域不同于艱難梭狀芽胞桿菌和產氣莢膜梭狀芽孢桿菌，所以預期艱難梭狀芽胞桿菌的酰胺酶類型溶素不會裂解產氣莢膜梭狀芽孢桿菌。
[0143]但是，BLAST分析揭示在各種其他革蘭氏陽性細菌的基因組中編碼的緊密相關預測蛋白的存在。
[0144]實施例7
以下例子示出使用斑點和混濁度試驗來測試分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體溶素活性能力。
[0145]使用本領域已知方法將表達噬菌體溶素的純化的重組蛋白或大腸桿菌裂解物用于測定分離的溶素在細菌平板上裂解產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的能力(參見，例如，Zimmer等人，2002 ;DonoVan等人，(2006)同上)。通過在時間內監控光密度(OD6ciciJ的變化來測定由于源于噬菌體的溶素活性所致靶細胞裂解的混濁度降低(Zimmer等人，2002 ；Donovan等人，2006)。使祀細胞在腦心浸液(BHI)肉湯(Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)中生長至對數中期(OD6tltlnm 0.4-0.6)以及在賴氨酸緩沖劑A(LBA 50mM乙酸銨，IOmM CaCl2,ImM DTT, pH 6.2)中濃縮至OD6tltlnm-1.0。在各孔中使用344 μ I的靶細胞混懸物和處理樣品中10 μ I的純化肽2.5 μ g)以及對照樣品的10 μ I緩沖劑，在96孔微量滴定板中完成測試。在37C下孵育I小時之后記錄OD6tltlnm的改變。在計算活性之前，僅將在細胞樣品中變化值從具有溶素的樣品中減去(在OD6tltol mg蛋白―1 HiirT1中變化值)。
[0146]對源于噬菌體的溶素活性的作用。如在混濁度測試中所述，但使用冰醋酸或氫氧化銨來調節LBA的pH來測定源于噬菌體的溶素對pH應答的活性(Yoong等人，2004)。將具有最高活性的PH任意設置為100%，并且在其他pH值下活性相對該最佳活性來表示。
[0147]混濁度測試和重組體溶素的pH范圍。將重組體裂解酶用于測定在混濁度測試中產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的裂解(圖2)。在混濁度降低測試中重組體噬菌體裂解酶能夠裂解產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的胃腸外噬菌體宿主菌株以及十三種細菌的其他分離菌。即，PlyCP390能夠裂解依照布達佩斯條約的規定于2010年8月13日保存于美國模式培養物保藏所(ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11265的宿主Cp39以及依照布達佩斯條約的規定于2010年8月13日保存于美國模式培養物保藏所(ATCC)以及指定保藏名稱PTA-11264的宿主Cp26，同時如果利用分離菌Cp26或Cp39則PlyCP26F可降低混濁度。盡管在它們的氨基酸序列中預測N末端酶區域55%不同是事實。在一小時孵育時間段之后通過在BHI (腦心浸液)瓊脂平板上在可變產氣莢膜梭狀芽孢桿菌中至多3 log cfu/ml降低來完成混濁度的降低。盡管經過裂解測定所有產氣莢膜梭狀芽孢桿菌分離菌，但沒有酶能夠裂解梭狀芽胞桿菌的其他成員。PlyCP26F的最佳pH范圍為5.5至9.9，而PlyCP390的pH最大值為8.2。
[0148]應理解，本文所述例子和實施方案僅為說明目的，以及鑒于其的各種修訂形式和變化均由本領域技術人員建議，并且這些修訂形式和變化均涵蓋在該申請的精神和范圍內以及在所附權利要求的范圍內。
【權利要求】
1.一種分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶， 其特征在于， 所述噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及 其中， 所述噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。
2.權利要求1所述的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其特征在于，所述噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。
3.權利要求2所述的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其特征在于，所述噬菌體裂解酶具有根據SEQ ID NO:1的序列。
4.權利要求1所述的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其特征在于，所述噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。
5.權利要求4所述的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其特征在于，所述噬菌體裂解酶具有根據SEQ ID NO:3的序列。
6.權利要求1所述的分離的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶，其特征在于，所述噬菌體裂解酶由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體分離，所述產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體是選自具有ATCC保藏名稱PTA-11081的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP390以及具有ATCC保藏名稱PTA-11080的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP26F的成員。
7.—種編碼產氣莢膜梭狀芽孢桿菌曬菌體裂解酶的分離的核酸分子， 其特征在于，所述噬 菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及 其中， 所述噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。
8.權利要求7所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述分離的核酸分子是選自編碼具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽的分離的核酸以及編碼具有與SEQ ID NO:3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽的分離的核酸的成員。
9.權利要求8所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述分離的核酸分子編碼具有根據SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。
10.權利要求8所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述分離的核酸分子編碼具有根據SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽。
11.一種有效針對產氣莢膜梭狀芽孢桿菌的抗微生物組合物，其包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶， 其特征在于， 所述噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及 其中， 所述噬菌體裂解酶活性導致產氣莢膜梭狀芽孢桿菌細菌細胞的裂解。
12.權利要求11所述的抗微生物組合物，其特征在于，所述噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:1有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。
13.權利要求12所述的抗微生物組合物，其特征在于，所述噬菌體裂解酶是SEQIDNO:1。
14.權利要求11所述的抗微生物組合物，其特征在于，所述噬菌體裂解酶包含具有與SEQ ID NO:3有至少約90%同一性的氨基酸序列的肽。
15.權利要求14所述的抗微生物組合物，其特征在于，所述噬菌體裂解酶是SEQIDNO:3。
16.權利要求11所述的抗微生物組合物，其特征在于，所述噬菌體裂解酶由產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體分離，所述產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體是選自具有ATCC保藏名稱PTA-11081的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP390以及具有ATCC保藏名稱PTA-11080的產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體CP26F的成員。
17.—種包含產氣莢膜梭狀芽孢桿菌噬菌體裂解酶的動物飼料， 其特征在于， 所述噬菌體裂解酶是選自CP26F溶素和CP390溶素的成員，以及 其中 所述噬菌體裂解酶在家畜中以有效地控制產氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的量存在。
18.權利要求 17所述的動物飼料，其特征在于，所述家畜是雞。
【文檔編號】C12N15/56GK103443269SQ201180041872
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年8月17日 優先權日:2010年9月1日
【發明者】布魯斯·S·希爾, 格雷戈里·R·希拉古薩, 伊本·穆斯塔法·A·西蒙斯, 喬娜·K·加利什, 大衛·M·多諾萬 申請人:美利堅合眾國，由農業部長代表