霉菌類聚酮化合物合成基因在酵母中的異源表達的制作方法

專利名稱：霉菌類聚酮化合物合成基因在酵母中的異源表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及表達載體的制作方法，所述方法從真核生物具有的包含內含子的基因中除去該基因所包含的內含子，僅將外顯子序列連接，從而制作包含該連接成的序列的表達載體。詳細而言，涉及以下方法:利用PCR從包含內含子的霉菌的巨大基因中將外顯子序列作為多個片段擴增，利用缺口修復克隆法將該片段及限制性酶處理的載體連接，從而制作包含連接成的外顯子序列的表達載體的方法；合成巨大基因的cDNA片段并連接，制作包含全長cDNA序列的表達載體的方法；導入有利用該方法制作的表達載體的轉化體；由該轉化體產生的蛋白質；以及得到使用該表達載體由該蛋白質產生的化合物的方法。
背景技術：
由霉菌的基因組序列的分析結果明確了在霉菌基因組上存在推定為二次代謝產物的生物合成基因的多個基因，但沒有確認這些基因編碼的蛋白質(二次代謝產物的生物合成酶)的生產。通常，為了獲得基因組序列編碼的蛋白質，需要首先制備mRNA，通過逆轉錄酶合成cDNA后，將該cDNA導入至表·達載體。通常而言，基因的閱讀框巨大時，很可能不能合成完全長度的cDNA，因此，有時存在cDNA文庫中不能覆蓋的閱讀框，另外，難以將基因導入與取得的生物不同的宿主中使其表達(異源表達)。目前為止，二次代謝產物用作許多藥品先導化合物，作為如上所述使用的二次代謝產物，例如可以舉出聚酮化合物類天然產物及肽類天然產物。已知這些天然產物分別通過聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及非核糖體妝合成酶(nonribosomal peptidesynthetase, NRPS)被生物合成(非專利文獻1-3)。對于由霉菌基因組序列明確的、推定為二次代謝產物的生物合成基因的基因，也期待通過該基因編碼的蛋白質合成的二次代謝產物的有用性。但是，由于霉菌為真核生物，所以基因中包含內含子，并且基因巨大，因此，利用如上所述的現有的方法難以合成完全長度的cDNA，不能合成推定為二次代謝產物的生物合成基因的基因編碼的蛋白質。由于上述情況，迫切需要開發出從霉菌的巨大生物合成基因中除去內含子，使該基因編碼的蛋白質表達的方法。非專利文獻I:Leadlay, P.，et al.，Nature 1990非專利文獻2:Katz, L.，et al.，Science 1991非專利文獻3:SamsonS.，et al.，Nature 1985非專利文獻4:Hisao Moriya, et al., PLos ONE 2010

發明內容
本發明的目的在于:從不能利用逆轉錄酶合成全長cDNA的霉菌的巨大基因中僅取出外顯子序列并連接，制作包含該連接成的序列的表達載體；或者合成上述巨大基因的cDNA片段并連接，制作包含全長cDNA序列的表達載體；以及使用該表達載體使該基因編碼的蛋白質表達。為了達成上述目的，發明人等利用PCR將作為霉菌的一種的球毛殼霉(Chaetomium globosum)基因組中存在的預測為推定的生物合成基因中的外顯子序列的序列擴增，使這些外顯子序列和限制性酶處理過的載體通過芽殖酵母中的同源重組而連接，制作表達載體，使用以酵母作為宿主的體系使該表達載體表達。即，本發明人等為了除去基因中的內含子序列，首次利用缺口修復克隆法，從而完成了本發明。即，本發明提供一種制作表達載體的方法，所述方法將真核生物具有的包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列的外顯子序列連接，制作包含該連接成的序列的表達載體，所述方法包括以下工序:工序(a):利用PCR，從提取自真核生物的基因組，將外顯子序列作為多個片段擴
>曰，這里，PCR中使用的正向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，反向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，通過使用這些引物，在擴增的片段的末端添加與連接在該片段上的片段的末端部分同源的序列或與載體的限制性酶處理末端部分同源的序列，及工序(b):將通過工序(a)得到的片段和經限制性酶處理過的載體同時轉化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重組得到片段和片段、及片段和載體連接成的表達載體。另外，本發明提供一種 制作表達載體的方法，所述表達載體包含真核生物具有的、包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列的全長cDNA序列，所述方法包括以下工序:工序(a):從提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段，利用PCR擴增該cDNA片段，這里，PCR中使用的正向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，反向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，通過使用這些引物，在擴增的片段的末端添加與連接在該片段上的片段的末端部分同源的序列或與載體的限制性酶處理末端部分同源的序列，及工序(b):將通過工序(a)得到的cDNA片段和經限制性酶處理過的載體同時轉化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重組得到片段和片段、及片段和載體連接成的表達載體。上述方法可以應用于作為真核生物的霉菌的基因，霉菌可以為青霉屬(Penicilium 屬)、毛殼屬(Chaetomium 屬)、或曲霉屬(Aspergillus 屬)。另外，在上述方法中，基因或推定為基因的基因組序列可以為4 20kb。進而，在上述方法中，基因或推定為基因的基因組序列可以為編碼聚酮合酶或非核糖體肽合成酶的序列。在上述方法中，可以使連接成的序列為包含序列號15 21、29及47中的任一個所表示的堿基序列的多核苷酸。另外，本發明還提供一種導入有通過上述方法制作的表達載體的轉化體。進而，本發明還提供一種由上述轉化體產生的蛋白質。另外，本發明還提供一種得到化合物的方法，所述方法使用通過上述方法制作的表達載體，得到由包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列編碼的蛋白質產生的化合物。上述方法可以包括下述工序:培養導入了表達載體的轉化體，從培養液或轉化體中提取化合物。使用本發明時，能夠從基因序列中除去內含子，僅使外顯子連接，因此，根據本發明，可以說能夠人為地進行剪接。另外，使用本發明時，能夠使由于使用現有方法不能合成cDNA因而不能使其表達的、巨大基因編碼的蛋白質表達。進而，通過培養導入該表達載體的宿主，也能得到由表達的蛋白質產生的化合物。對由基因組序列的信息推定為基因、但沒有分離及確認其產物的序列應用本發明的方法時，能夠合成該推定基因編碼的未知蛋白質，確定該蛋白質的功能。另外，對霉菌類的基因應用本發明制作表達載體，使用以酵母作為宿主的體系使其表達時，即使為異源表達，也能在不使霉菌的蛋白質變性的情況下進行合成。


圖1為表示推定PKS基因(CHGG_10128)的外顯子序列的模式圖、及表示用于擴增各外顯子的引物。圖2表示利用PCR擴增推定PKS基因(CHGG_10128)的外顯子序列的結果。圖3為表示推定PKS基因(CHGG_10128)的外顯子序列在芽殖酵母中發生的同源重組的模式圖。圖4為確認了推定PKS基因(CHGG_10128)的表達載體的基因表達的蛋白質免疫印跡法(western blot)。圖5為確認了 6-MSA合成酶(MSAS)的表達的SDS-PAGE及蛋白質免疫印跡法。圖6A為檢測標準品6-MSA的254nm的吸收波長的色譜圖(a)及紫外吸收光譜(b)。圖6B為標準品6-MSA的質量分析的譜圖(a)及質譜圖(b)。圖7為標準品6-MSA的HPLC數據。圖8A為檢測酵母提取液樣品的254nm的吸收波長的色譜圖(a)及紫外吸收光譜(b)。圖SB為酵母提取液樣品的質量分析的譜圖(a)及質譜圖(b)。圖9為酵母提取液樣品的HPLC數據。圖1OA為用HPLC從酵母提取液樣品中分離得到的餾分的H-NMR譜。圖1OB為將圖1OA所示的H-NMR譜的一部分放大所得的譜圖。圖11為表示推定的PKS基因(CHGG_00542)的外顯子序列的模式圖、 及用于擴增各外顯子的引物。
圖12表示利用PCR擴增推定的PKS基因(CHGG_00542)的外顯子序列的結果。圖13為表示推定的PKS基因(CHGG_00542)的外顯子序列在芽殖酵母中發生的同源重組的模式圖。圖14為確認了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表達載體的基因表達的蛋白質免疫印跡法。圖15為從導入了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表達載體的酵母中提取的固體的LC/MS譜圖。圖16為從導入了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表達載體的酵母的培養液中分離的、化合物 I (CHGG_00542-1)及化合物 2 (CHGG_00542_2)的 H-NMR 譜。
具體實施例方式本發明涉及一種制作表達載體的方法，所述方法利用缺口修復克隆法，從真核生物具有的包含內含子的基因中除去該基因所含的內含子，僅使外顯子序列連接，從而制作包含該連接成的序列的表達載體。本發明中，制作表達載體時，將想要表達的推定的基因序列、以及合成該基因序列編碼的蛋白質的推定底物的酶的基因序列等多個基因導入一個載體，另外將在轉化時得到的多個表達載體導入一個細胞，進而將多個基因也導入染色體上。通過上述手法，與現有的缺口修復克隆法(參見Hisao Moriya, et al.，PLos ONE 2010)相比，能有效地表達基因，成功地增加目標蛋白質及由該蛋白質合成的化合物的產量。一直以來，本技術領域中利用周知的方法，⑴難以使巨大的基因組基因剪接并異源表達，及(ii)即使使基因表達得到蛋白質，利用目前為止的技術也很難鑒定該蛋白質的功能，因此，使功能未知、為巨大的基因、且包含許多內含子序列的基因表達，明確被翻譯的蛋白質的功能極為困難。對于這一問題，本發明人等使用利用缺口修復克隆法的本發明的方法，即使為功能未知且巨大的基因組基因，也成功地獲得推定為該基因的cDNA的序列，使該序列編碼的蛋白質表達。進而，通過使合成該蛋白質的推定底物的酶的基因也表達，成功地獲得由該蛋白質合成的化合物。另外，本發明的一個方案中，對于不能利用逆轉錄酶合成全長cDNA的巨大基因，合成cDNA的片段，使用缺口修復克隆法將這些片段連接，由此能夠得到巨大基因的內含子被除去的閱讀框。由目前為止的知識，雖然推定基因中的某序列是外顯子序列還是內含子序列，但這只不過是推定，在包含多個內含子序列的巨大基因的情況，該推定錯誤的可能性變高。因此，與將外顯子的推定序列連接相比，將cDNA的片段連接能夠更確實地得到巨大基因的閱讀框。1.定義所謂“基因”是指編碼蛋白質的信息的DNA區域。所謂“推定為基因的基因組序列”，是指基于目前為止的知 識，預測為編碼蛋白質的信息的DNA區域。所述預測可以使用市售的軟件容易地進行，例如公開了利用NCBI的程序進行的預測結果(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。所謂“外顯子”或“外顯子序列”，是指基因中所包含的被轉錄為mRNA的DNA區域、及由該DNA區域轉錄的mRNA區域。所謂“內含子”或“內含子序列”，是指基因中所包含的不編碼蛋白質的信息、即使作為一次轉錄產物被轉錄也通過RNA剪接被除去、在mRNA中不包含的DNA區域。真核生物中，基因作為一次轉錄產物被轉錄后，通過RNA剪接除去內含子，將外顯子彼此連接，從而形成mRNA。真核生物的基因中，通常外顯子被內含子截斷。另夕卜，由目前為止的知識，能夠推定基因中的某序列是外顯子序列還是內含子序列，例如公開了利用NCBI的程序進行的結果(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。本說明書中,用于“外顯子”及“內含子”分別以包括推定為外顯子的序列及推定為內含子的序列的意思使用。本發明中，所謂“片段”是指包含基因的一部分序列的DNA片段。本發明中，所謂“5’末端部分”及“3’末端部分”分別是指包含從片段的5’末端或3’末端開始連續的多個堿基序列的多核苷酸，所謂“多個”，只要是本發明中引物能有效地發揮功能、并且可發生同源重組的長度即可。本發明中，所謂“限制性酶處理末端部分”是指包含通過限制性酶處理產生的載體的末端開始連續的多個堿基序列的多核苷酸，所謂“多個”只要是本發明中可發生同源重組的長度即可。本說明書中，所謂“正向引物”，是指具有與想要利用PCR擴增的DNA序列的有義鏈的5’末端互補的序列的引物，所謂“反向引物”，是指具有與想要利用PCR擴增的DNA序列的反義鏈的5’末端互補的序列的引物。本發明中，所謂“互補的序列”，是指在嚴格的條件下，能夠與模板序列雜交的序列，不需要為完全互補。具體而言，優選引物序列的80%以上互補，較優選90%以上，特別優選100%。本發明中，所謂“同源的序列”是指具有能在連接的片段之間發生同源重組程度的同源性的序列。同源性優選為足夠高，優選99%以上、較優選99.9%以上同源，進一步優選兩序列相同。

本發明中，所謂 “霉菌”是指分類為真菌的微生物，指絲狀菌。沒有限定，作為本發明中的“霉菌”，例如可以舉出青霉菌屬(Penicilium屬)、毛殼屬(Chaetomium屬)、及曲霉屬(Aspergillus 屬)。所謂“聚酮合酶(polyketide synthase、PKS) ”,是參與聚酮化合物化合物的生物合成的酶，所謂“聚酮化合物”為由放線菌、絲狀菌、植物等產生的二次代謝產物的總稱。這里，所謂“二次代謝產物”，不是所有的生物中都含有，是指通過生物合成不直接參與生物的共同的生命現象的物質的代謝(即二次代謝)產生的天然產物。沒有限定，作為聚酮化合物，例如可以舉出四環素或紅霉素等抗生素、道諾霉素等抗癌劑。所謂“非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS) ”,不參與通常的以mRNA作為模板合成肽的肽翻譯，而是參與在有規則地排列的酶之間傳遞底物、來將肽聚合從而合成蛋白質的反應的酶。2.表達載體的制作方法本發明提供一種制作表達載體的方法，所述方法利用PCR將包含內含子的巨大基因中所含的外顯子序列作為多個片段擴增，利用缺口修復克隆法連接該片段及限制性酶處理過的載體，得到表達載體。使用本發明時，能夠從基因序列中除去內含子，僅使外顯子連接，因此，通過本發明，可以說能夠人為地進行剪接。所謂缺口修復克隆法，是利用芽殖酵母具有的重組修復機制、在芽殖酵母內或分裂酵母內構筑質粒的構造的方法，是如果DNA片段具有同源區域則能夠發生同源重組而將DNA片段連接的方法(例如，參見Hisao Moriya, et al.,PLos ONE 2010)。因此，使用缺口修復法時，若制備具有同源且特異性序列的DNA片段，則能夠精度良好地連接該DNA片段。(1-1)利用PCR的外顯子序列的擴增工序(a)基因組的提取本發明的方法中，首先從含有目標基因的真核生物中提取基因組。基因組的提取可以利用本領域技術人員周知的方法進行。另外，也可以利用市售的試劑盒。(b)引物的設計本發明的方法中，利用PCR，使外顯子序列作為多個片段擴增。具體而言，外顯子被內含子外顯子截斷的情況，使各個外顯子作為片段擴增。另外，一個外顯子大到難以利用PCR擴增的程度時，使一個外顯子作為能夠利用PCR擴增的長度的多個片段擴增。對于缺口修復克隆法，具有同源區域的片段之間發生同源重組，兩個片段被連接(參見圖3)，因此，本發明中，片段必須在連接部位具有與連接片段的末端部分或連接載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。因此，本發明的方法中使用的引物如下設計:在利用PCR擴增片段的同時，在該片段的末端部分添加與連接的片段的末端部分或連接的載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。即，本發明中可使用的引物由下述序列構成:與模板鏈結合、發揮作為引物的功能的序列；和用于在末端添加與連接的序列同源的序列的序列。對于引物的設計，以下根據圖1，以下述情況為例，具體說明將4個外顯子(從5’末端側依次為外顯子I 4)分別擴增并連接，并入限制性酶處理過的載體中的情況。擴增外顯子I時，針對有義鏈的引物(外顯子I正向引物)設計成從5’末端向3’末端的方向依次地、包含與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫粗體表示)和與外顯子I的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用大寫表示)。針對反義鏈的引物(外顯子I反向引物)設計成從5’末端側開始依次地、包含與外顯子2的反義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用小寫斜體表示)和與外顯子I的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用大寫帶下劃線表示)。使用這些引物進行PCR反應時，可以作為擴增的片段得到下述序列:在外顯子I的5’末端添加有與載體的限制性酶處理末端部分的3’末端部分的序列同源的序列，在3’末端添加有與外顯子2的5’末端部分同源的序列。擴增外顯子2時，針對有義鏈的引物(外顯子2正向引物)設計成從5’末端向3’末端的方向依次地、包含與外顯子I的有義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫帶下劃線表示)和與外顯子2的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用小寫斜體表示)。針對反義鏈的引物(外顯子2反向引物)設計成從5’末端側依次地、包含與外顯子3的反義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用小寫表示)和與外顯子2的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用大寫斜體帶下劃線表示)。使用這些引物進行PCR反應時，可以作為擴增的片段得到下述序列:在外顯子2的5’末端添加有與外顯子I的3’末端部分同源的序列，在3’末端添加有與外顯子3的5’末端部分同源的序列。擴增外顯子3時，針對有義鏈的引物(外顯子3正向引物)設計成從5’末端向3’末端的方向依次地、包含與外顯子2的有義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫斜體帶下劃線表示)和與外顯子3的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用小寫表示)。針對反義鏈的引物(外顯子3反向引物)設計成從5’末端側依次地、包含與外顯子4的反義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫帶虛線表示)和與外顯子3的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用大寫帶雙線表示)。使用這些引物進行PCR反應時，可以作為擴增的片段得到下述序列:在外顯子3的5’末端添加有與外顯子2的3’末端部分同源的序列，在3’末端添加有與外顯子4的5’末端部分同源的序列。擴增外顯子4時，針對有義鏈的引物(外顯子4正向引物)設計成從5’末端向3’末端的方向依次地、包含與外顯子3的有義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫帶雙線表示)和與外顯子4的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1中用大寫帶虛線表示)。針對反義鏈的引物(外顯子4反向引物)設計成從5’末端側依次地、包含與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分互補的序列(圖1中用大寫粗體帶下劃線表示)和與外顯子4的反義鏈的5’末端部分互補的序列(圖1中用小寫粗體表示)。使用這些引物進行PCR反應時，可以作為擴增的片段得到下述序列:在外顯子4的5’末端添加有與外顯子3的3’末端部分同源的序列，在3’末端添加有與載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。外顯子I反向引物和外顯子2正向引物、外顯子2反向引物和外顯子3正向引物、外顯子3反向引物和外顯子4正向引物分別包含互補的序列(圖1中用相同的字體表示互補的序列)。弓丨物序列中，與模板鏈結合發揮作為弓丨物的功能的序列部分的長度、即本發明中正向引物及反向引物的3’末端側的序列部分的長度，只要為在PCR中引物有效地發揮功能的長度即可。對于在PCR中能有效地發揮功能的引物的長度，只要為本領域技術人員就能夠適當設定，沒有限定，例如為5 50bp,優選為10 40bp,較優選為15 30bp。另外，引物整體的長度只要為在缺口修復克隆法中能夠發生同源重組的長度即可，這樣的同源序列的長度為約25bp，優選為約50bp，較優選約75bp。因此，本發明中使用的引物整體的長度沒有限定，例如可以為約25bp,優選為約50bp,較優選為約75bp。(c)片段的擴增將從真核生物提取的基因組作為模板，使用如上述(b)所記載而設計的引物，利用PCR，將外顯子序列作為多個片段擴增。對于PCR的反應條件，可由本領域技術人員適當設定。另外，PCR反應可以使用市售的試劑盒進行。使用如上述(b)所記載而設計的引物時，可以得到在外顯子的兩末端分別添加有連接的外顯子或載體的末端部分的序列的片段。(1-2) cDNA片段的合成及擴增工序(a)mRNA的提取及使用逆轉錄酶的cDNA片段的合成本發明的一個方案中，首先，從包含目標基因的真核生物中提取mRNA。mRNA的提取可以利用本領域技術人員所周知的方法進行。另外，也可以利用市售的試劑盒。例如，提取總RNA后，可以使用寡dT柱精制mRNA。接下來，使用逆轉錄酶合成所得的mRNA的單鏈互補的DNA(cDNA)片段。逆轉錄反應可以利用本領域技術人員所周知的方法進行。例如，可以使用寡dT引物或寡dT接頭引物得到單鏈cDNA片段。或者可以對提取的總RNA應用寡dT引物或寡dT接頭引物和逆轉錄酶，僅使mRNA逆轉錄，得到單鏈cDNA片段。(b)引物的設計與上述(1-1) (b)所記載的同樣地，通過具有同源區域的片段間的同源重組連接片段，因此，本發明中，片段必須在連接部位具有與連接的片段的末端部分或連接的載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。因此，本發明的方法中使用的引物如下設計:在利用PCR擴增片段的同時，在該片段的末端部分添加與連接的片段的末端部分或連接的載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。即，本發明中可使用的引物包含下述序列:與模板鏈結合并發揮作為引物的功能的序列、和用于在末端添加與連接的序列同源的序列的序列。因此，對于用于使cDNA片段擴增的引物，與上述(1-1) (b)記載的方法同樣地、基于外顯子及內含子的預測序列以及導入的載體的限制性酶處理末端的序列進行設計。(C)片段的擴增將通過上述(a)得到的單鏈cDNA片段作為模板，使用如上述(b)所述而設計的引物，利用PCR擴增cDNA片段。對于PCR的反應條件，可由本領域技術人員適當設定。另外，PCR反應可以使用市售的試劑盒進行。(2)載體的限制性酶處理本發明中，載體用限制性酶消化、切斷后使用。作為限制性酶，可以使用本領域技術人員周知的限制性酶，利用本領域技術人員周知的方法進行限制性酶處理。使用限制性酶，載體可以在I處被切斷，也可以在2處以上被切斷。使用具有芽殖酵母或分裂酵母的復制起點及選擇標記的載體。作為以酵母作為宿主的載體,可以舉出YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YcP型載體等，例如可以使用PGPD-2等。作為選擇標記，例如可以包括營養缺陷型報告基因或編碼可追蹤的標記蛋白質的基因，例如編碼綠色熒光蛋白質(GFP)、黃色熒光蛋白質(YFP)、及藍綠色熒光蛋白質(CFP)的基因；以及其他報告基因，例如LacZ基因及耐藥性基因。另外，載體可以包含啟動子區域及轉錄終止區域等。將啟動子區域及轉錄終止區域配置在載體內，以使啟動子區域及轉錄終止區域控制目標基因及選擇標記的表達。(3)表達載體的制作工序將利用PCR擴增的片段和限制性酶處理過的載體同時導入芽殖酵母或分裂酵母中來進行轉化。由此，在芽殖酵母或分裂酵母內、于具有同源序列的片段間及片段和載體的限制性酶處理末端部分之間發生同源重組，形成連接有片段的表達載體。本發明的方法中，對于想要表達的推定基因序列、以及合成該基因序列編碼的蛋白質的推定底物的酶的基因、該蛋白質的修飾酶的基因等多個基因制作片段，導入一個載體。如上述(1-1) (b)所述，根據圖1，以分別擴增外顯子1 4、連接并并入至限制性酶處理過的載體中的情況(圖3)為例，在下面進行說明。

在利用PCR的擴增工序中，形成在外顯子1 4的兩端分別添加有與連接的外顯子或載體同源的序列的片段。因此，在載體的限制性酶處理3’末端部分的序列和在外顯子I的5’末端添加的與載體的限制性酶處理3’末端部分同源的序列之間發生同源重組。對于外顯子I及外顯子2，外顯子I在3’末端部分、外顯子2在5’末端部分分別具有由外顯子I的3’末端部分的序列和外顯子2的5’末端部分的序列構成的序列，因此，在該序列間發生同源重組，結果在外顯子I的3’末端連接外顯子2的5’末端。對于外顯子2和外顯子3、及外顯子3和外顯子4也同樣地，在外顯子2的3’末端連接外顯子3的5’末端，在外顯子3的3’末端連接外顯子4的5’末端。由于在外顯子4的3’末端添加有與載體的限制性酶處理5’末端部分的序列同源的序列，所以在所述序列和載體的限制性酶處理5’末端部分的序列之間發生同源重組。通過上述同源重組，可以制作包含下述序列的表達載體，所述序列為基因中所含的外顯子I 4按照 被基因編碼的順序所連接成的序列，即推定為基因的cDNA序列的序列。另外，本發明的一個方案中，利用同源重組，可以制作包含cDNA片段所連接成的序列、即全長cDNA序列的表達載體。作為將片段等導入芽殖酵母或分裂酵母的方法，例如可以使用電穿孔法等周知的方法。由于同源重組可在多個片段的末端部分同時發生，所以使用本發明的方法時，可以同時并入多個片段。另外，本發明的方法中，可以并入約20kbp以下的片段。使用本發明的方法時，可以將約20kbp以下、約15kbp以下、約IOkbp以下、或約5kbp以下的基因的cDNA序列并入至表達載體中。制作的表達載體利用選擇標記選擇轉化體，回收該轉化體中含有的表達載體。3.來自球毛殼霉(Chaetomium globosum)的PKS基因表達載體作為本發明的一個方案，可以按照上述2.的方法，制作來自球毛殼霉(Chaetomium globosum)的PKS基因表達載體。球毛殼霉中存在推定為PKS基因的基因組，但并未發現它們編碼的蛋白質作為天然產物被生產，也未通過合成獲得。可以從這樣的基因(CHGG_10128、ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286、及CHGG_09586)中除去內含子，僅將外顯子序列連接，制作包含該連接成的序列的表達載體。即，可以制作包含上述基因的推定cDNA序列(序列號29及序列號15 21)的表達載體(序列號14及序列號22 28)。另外，本發明的一個方案中，也可以制作包含將上述PKS基因(CHGG_10128、ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286、及CHGG_09586)的cDNA片段連接得到的全長cDNA序列的表達載體。來自球毛殼霉的PKS基因表達載體還可以進一步含有編碼修飾PKS從而發揮功能的修飾酶的基因即npgA基因、及編碼產生作為PKS的底物的丙二酰-CoA的酶的基因即matB基因的一方或兩方。這些基因可以事先并入至載體中，或者與PKS基因一同作為片段制備、利用同源重組而導入。4.導入了表達載體的轉化體可以將按照本發明的方法而得到的、包含外顯子所連接成的序列或全長cDNA序列的表達載體導入宿主細胞中，得到轉化體。作為宿主細胞，可以為大腸桿菌及酵母中的任一種，但使用以酵母作為宿主的體系使其表達時，即使為異源表達也能在不使真核生物的蛋白質變性的情況下合成，因此優選使用酵母。轉化時，可以將一個或多個表達載體導入一個細胞，并且將多個基因導入染色體上。5.轉化體產生的蛋白質本發明的一個方案中，可以得到導入了表達載體的轉化體產生的蛋白質。可以在被導入至表達載體的外顯子所連接成的序列或全長cDNA序列能夠表達的條件下培養本發明的轉化體，得到蛋白質。該轉化體可以在本領域通用的培養基中進行培養。培養方法可以按照本領域技術人員周知的方法進行，關于溫度、pH、培養時間、是否進行通氣或攪拌等，可由本領域技術人員適當設定。在從培養的轉化體中提取蛋白質時，可以使用下述方法:培養后，用周知的方法收集轉化體，將其懸浮在適當的緩沖液中，通過超聲波、溶菌酶及/或凍融等破壞轉化體，然后離心分離或過濾，得到粗提取液。緩沖液中可以適當添加表面活性劑或蛋白質變性劑等。作為從得到的粗提取液中分離 純化蛋白質的方法，可以使用硫酸鋁沉淀法等鹽析、凝膠過濾等本領域中周知的方法。對于轉化體產生的蛋白質，也可以應用基因工程上常用的融合產生方法，使其作為具有標簽的融合蛋白質而表達。作為標簽，可以使用His標簽、HA標簽、myc標簽、FLAG標簽等周知的標簽。添加標簽時，作為分離 純化方法，可以使用親和色譜法等。6.使用表達載體，制造由包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列編碼的蛋白質產生的化合物的方法本發明的一個方案中，可以制造由導入了表達載體的轉化體產生的蛋白質合成的化合物。在被導入至表達載體的外顯子所連接成的序列或全長cDNA序列能夠表達的條件下，培養本發明的轉化體，使該序列編碼的蛋白質表達。本發明的轉化體可以在本領域通用的培養基中進行培養。另外，培養方法可以按照本領域技術人員周知的方法進行，關于溫度、pH、培養時間、是否進行通氣或攪拌等，可由本領域技術人員適當設定。培養基、培養方法、培養時間等培養條件優選進行最優化，使化合物的生產量變多。通過培養，使在轉化體內或培養液中蓄積由被導入至表達載體的外顯子所連接成的序列或全長cDNA序列編碼的蛋白質合成的化合物。從轉化體或培養液中提取化合物。提取的方法可以根據化合物的物性、從本領域中周知的方法中適當選擇。例如，培養液中蓄積有化合物時，通過離心分離等從培養液中除去轉化體后，可以通過對培養液單獨或組合進行溶劑萃取法、離子交換樹脂法、吸附或分配色譜法及凝膠過濾法等來提取。在轉化體內蓄積的化合物的情況，通過離心分離等從培養液中回收轉化體，將其懸浮在適當的緩沖液中，通過超聲波、溶菌酶及/或凍融等破壞轉化體，通過離心分離或過濾得到粗提取液，然后通過單獨或組合溶劑萃取法、離子交換樹脂法、吸附或分配色譜法及凝膠過濾法等來提取。進而，提取的化合物可以根據其物性、使用本領域中周知的方法進行純化。如實施例2所示，使用本發明的表達載體制造化合物時，可以從IL的培養液中得到Ig左右的化合物。實用化水平的生產效率為從IL的培養液中得到0.1g左右，因此，可以說該生產效率與實用化水平的生產效率相比足夠高。本發明的一個方案中，通過制作包含霉菌的二次代謝產物的生物合成基因或推定為基因的基因組序列的表達載體，培養導入了該表達載體的轉化體，從而能夠得到二次代謝產物。因此，使用本發明的方法時，能夠得到未知的二次代謝產物，所以有可能創制有用的生物活性物質。本說明書中明示引用的所有專利及參考文獻的內容全部作為參照引入本說明書中。另外，作為本申請的要求優先權的基礎的申請、即日本專利申請2010-181279號及2011-007312號的說明書及附圖中記載的內容，全部作為參照引入本說明書中。以下，基于實施例進一步詳細說明本發明，但這些實施例并不限制本發明。[實施例1]
來自球毛殼霉的PKS基因表達載體的制作及基因表達1.CHGG_10128針對作為霉菌的一種的球毛殼霉，解讀了全基因組序列，利用NCBI (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)的程序預測編碼聚酮合酶(PKS)的基因區域、以及該區域中的外顯子序列和內含子序列。對于推定為編碼聚酮合酶(PKS)的基因中的一個(CHGG_10128)(序列號I)，進行以下的實驗。(I)利用PCR的外顯子序列的擴增從球毛殼霉中提取DNA。推定CHGG_10128具有3個內含子序列，因此，利用PCR將除去這些內含子序列的4個外顯子序列擴增。合成正向引物，使其從5’末端向3’末端的方向依次具有與使擴增的片段連接所得的片段的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3 ’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列,合成反向引物,使其從5’末端向3’末端的方向依次具有與使擴增的片段連接所得的片段的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖1)。如圖1所示，使外顯子序列從5’端依次為外顯子I 4(序列號10 13)時，將外顯子I的正向引物示于序列號2，將外顯子I的反向引物示于序列號3，將外顯子2的正向引物不于序列號4,將外顯子2的反向引物不于序列號5,將外顯子3的正向引物不于序列號6,將外顯子3的反向引物不于序列號7,將外顯子4的正向引物不于序列號8,將外顯子4的反向引物不于序列號9。PCR反應在94°C下使其變性2分鐘后，進行30個循環的下述反應:外顯子I在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下I分鐘，外顯子2在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下5分鐘，外顯子3在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下2分鐘，外顯子4在98°C下10秒、55。。下30秒、68°C下I分鐘。聚合酶使用KOD-Plus-Neo (東洋紡)。(2)利用同源重組的表達載體的制作通過電泳確認外顯子1、外顯子2、外顯子3、及外顯子4被擴增后(圖2)，表示目標條帶的PCR產物、限制性酶處理過的載體、以及編碼作為標簽的His及HA標簽的序列導入芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用市售的pRS425作為載體,使用SalI及SacI作為限制性酶。通過酵母內的重組酶引起同源重組，制作包含外顯子1、外顯子2、外顯子3及外顯子4的表達載體(序列號14 )(圖3)。利用同源重組，并入有由外顯子I 4構成的序列(序列號29)的表達載體使用Leu作為標記進行選擇。(3)目標蛋白質在酵母中的表達將所得的表達載體導入酵母中，使其轉化。在SC/Leu (2%棉子糖)培養液中培養24小時，投入半乳糖使最終濃度為2%。培養12小時后，回收酵母，從酵母中提取蛋白質。將提取的蛋白質供給蛋白質免疫印跡，確認了基因表達。基于連接外顯子I 4的序列(序列號29)的PKS的分子量為279kDa，標簽肽的分子量為8kDa，因此，預測在分子量287kDa處檢測出條帶，結果實際上在其附近確認到條帶(圖4)。蛋白質免疫印跡中，使用抗His抗體(Sigma) (4000倍)作為一抗、抗小鼠抗體(Invitrogen) (I倍)作為二抗，檢測中使用利用堿性磷酸酶的化學發光。
2.其他基因對于推定為編碼PKS 的其他基因(ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286 及 CHGG_09586)，也與上述 I 同樣地進行實驗,制作包含推定為這些基因的cDNA序列的序列(依次不于序列號15 21)的表達載體(依次不于序列號22 28)。與上述I同樣地將這些表達載體導入酵母中并轉化時，確認了蛋白質的表達。[實施例2]在體內的化合物(6~甲基水楊酸)的生產將6-甲基水楊酸(6-methylsalicylic acid, 6-MSA)作為代表的來自真菌的聚酮化合物進行了研究，另外，已知其合成酶￠-甲基水楊酸合成酶、6-MSA合成酶、MSAS)也能在大腸桿菌中表達。因此，為了表示導入了根據本發明的方法制作的表達載體的轉化體實際上能夠生產化合物，針對6-甲基水楊酸合成酶進行以下實驗。1.表達載體的構筑及MSAS的表達從作為霉菌的土曲霉中提取DNA。6-MSA合成酶的基因(序列號30)具有I個內含子序列，因此利用PCR將除去該內含子序列的2個外顯子序列擴增。此時，以在各片段上添加與連接的片段的末端或載體的限制性酶處理末端部分同源的序列的方式，設計正向引物(序列號31)和反向引物(序列號32)、及正向引物(序列號33)和反向引物(序列號34)來使用。與實施例1同樣地，利用同源重組，將擴增的外顯子序列的片段及編碼作為標簽的HA的序列導入pKW1250 (Leu2d)的ORF (開放閱讀框)中，構筑包含6-MSA合成酶基因的cDNA的表達載體(序列號35)。另外，使用GRC法，也一并并入npgA及matB。表達載體使用Ura (尿嘧啶)作為標記 進行選擇。將上述表達載體導入酵母進行轉化，確認MSAS (204kDa)的表達。具體而言，將所得的表達載體導入酵母并使其轉化后，在SC/Leu (2%棉子糖)培養液中培養24小時，投入半乳糖，使最終濃度為2%。培養12小時后，回收酵母。用珠破碎提取回收的酵母，使用鎳柱(N1-NTA樹脂，QIAGEN)精制該提取物，得到以下樣品(圖5);無細胞提取液(泳道I)、可溶性餾分(泳道2)、非吸附餾分(泳道3)、洗滌餾分(泳道4)、洗脫餾分(咪唑濃度IOOmM)(泳道5)、洗脫餾分(咪唑濃度200mM)(泳道6)、洗脫餾分(咪唑濃度500mM)(泳道7)。將所得的樣品供給SDS-PAGE及蛋白質免疫印跡，確認了基因表達。凝膠進行CBB染色，蛋白質免疫印跡中，使用抗HA抗體(Roche) (1000倍)作為一抗,使用抗小鼠抗體(Invitrogen)(I倍)作為二抗，檢測中使用利用堿性磷酸酶的化學發光。結果示于圖5。作為對照，也檢測出了丙二酰-CoA合成酶(MATB) (57kDa)及磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(SFP) (32kDa)，僅MSAS的生產量極少。需要說明的是，酵母中的蛋白質的表達方法參考Jay D.Keasling等的Nature(2006)。2.6-MSA 的參考由于MSAS不能在體外進行酶反應,所以從美國Santa Cruz Biotechnologi公司購入6-MSA，作為由酶反應生產的化合物的標準品。用LC/MS及制備用HPLC檢測該化合物，得到參考數據。對于LC/MS的測定條件，通過電子離子化法進行離子化并檢測。LC/MS的結果示于圖6A及圖6B。圖6A的a為檢測254nm的吸收波長的色譜圖，圖6A的b為目標化合物的紫外吸收光譜，圖6B的a為質量分析的譜圖，圖6B的b為目標化合物的質譜圖。由圖6A的b及圖6B的b可知6-MSA難以被離子化，因而采用MS的檢測困難，但采用UV檢測容易。制備用HPLC的測定條件使用C18柱，檢測流速lmL/min、254nm的吸收波長。將制備用HPLC的結果示于圖7。由圖7可知保留時間27.4分鐘的峰相當于6-MSA。3.在體內的6-MSA的生產將上述1.中制作的表達載體導入酵母進行轉化，如下所述培養該酵母。1:在 SC/Ura plate 中、30°C下培養 48 小時2:SC/Ura 2mL、30°C下震蕩培養 24 小時3:SC/Leu 25mL、30°C下震蕩培養 48 小時`4:YPD 1L、30°C下震蕩培養12小時
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5:添加半乳糖使最終濃度為2%6:震蕩培養6天將培養液離心，回收上清液后，使用HCl將上清液的pH調節為1-2。用與上清液等量的乙酸乙酯提取目標化合物(6-MSA)，使其干燥，結果從IL的培養液中得到約Ig的目標化合物。使得到的固體溶解于甲醇 用LC/MS分析，用HPLC分離得到。測定條件與上述
2.相同。將LC/MS的光譜示于圖8，將HPLC的光譜示于圖9。圖8A的a為檢測254nm的吸收波長所得的色譜圖，圖8A的b為目標化合物的紫外吸收光譜，圖SB的a為質量分析的譜圖，圖SB的b為目標化合物的質譜圖。基于上述2.中得到的參考數據，用HPLC分離得到保留時間為27分鐘的餾分。使分離得到的餾分干燥后，溶解于氘代甲醇(MeOD(4D))中，進行NMR譜分析。結果示于圖1OA及圖10B。由上述結果能夠確認，被轉化的酵母產生6-MSA。即，確認了導入了按照本發明的方法制作的表達載體的轉化體實際上能夠生產二次代謝產物。[實施例3]來自球毛殼霍的PKS某閔(CHGG 00542)表汰載體的制作及某閔表汰1.CHGG_00542基因表達載體的構筑對于球毛殼霉具有的推定為編碼聚酮合酶(PKS)的基因中的一種(CHGG_00542)的、將5個腺嘌呤(492、3925、3965、4529及6077殘基)置換為鳥嘌呤的序列(序列號36)進行以下實驗。(I)利用PCR的外顯子序列的擴增從球毛殼霉提取DNA。推定CHGG_00542具有3個內含子序列，因此，利用PCR擴增除去這些內含子序列的4個外顯子序列(從5’端依次為外顯子I 4(序列號37 40))。此時，設計并使用外顯子I正向引物(序列號41)和外顯子I反向引物(序列號42)、外顯子2正向引物(序列號43)和外顯子2反向引物(序列號44)、及外顯子3正向引物(序列號45)和外顯子3 *4反向引物(序列號46)(圖11)，使在各片段上附加與連接的片段的末端或載體的限制性酶處理末端部分同源的序列。合成具有下述序列的外顯子`3 4反向引物，從5’末端向3’末端的方向依次具有與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、與外顯子4的反義鏈的序列互補的序列、及與外顯子3的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列(圖11)。
PCR反應在94°C下使其變性2分鐘后，進行30個循環的下述反應:外顯子I在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下30秒，外顯子2在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下30秒、外顯子3 *4在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下6分鐘。聚合酶使用KOD-Plus (東洋紡)。(2)利用同源重組的表達載體的制作通過電泳確認外顯子1、外顯子2及外顯子3 *4被擴增后(圖12)，表示目標條帶的PCR產物、限制性酶處理過的載體、以及編碼作為標簽的His及HA標簽的序列導入芽殖酵母。使用市售的PRS425作為載體，使用SalI及SacI作為限制性酶。通過酵母內的重組酶引起同源重組，制作包含外顯子1、外顯子2及外顯子3 *4的表達載體(圖13)。利用同源重組，并入有由外顯子I 4構成的序列(序列號47)的表達載體使用Leu作為標記進行選擇。另外，使用GRC法,也一并并入npgA及matB。

(3)目標蛋白質在酵母中的表達利用與實施例1同樣的方法，確認了目標蛋白質在酵母中的表達。基于連接外顯子I 4的序列的PKS的分子量為239kDa,標簽肽的分子量為8kDa,預測在分子量247kDa檢測出條帶，結果實際上在其附近確認到條帶(圖14)。2.利用體內合成系統的CHGG_00542的酶功能分析、以及合成產物的分離及構造
確定將由上述1.得到的酵母培養液離，回收上清液后，用與上清液等量的乙酸乙酯提取目標化合物，使其干燥。從IL的培養液中得到約0.0lg的固體。使所得的固體溶解在甲醇中，用LC/MS分析，用HPLC分離得到。測定條件與6-MSA的情況(實施例2的2.)相同。將LC/MS的光譜與HPLC的光譜一同示于圖15中。由于分離得到2種化合物，所以將一方作為化合物I (CHGG_542-1)、另一方作為化合物2 (CHGG_542_2)使。將分離得到的這些化合物干燥后，分別溶解于氘代丙酮(acetone (6D))，進行NMR譜分析。從1HNMR譜(圖16)的分析結果明確了分離的化合物I (CHGG_542_1)是化學結構已經確定的化合物，化合物2(CHGG_542-2)為新化合物。由上述結果可以確認，被轉化的酵母產生化合物1(CHGG_542_1)及化合物2(CHGG_542-2)。即，確認了導入了按照本發明的方法制作的表達載體的轉化體實際上能夠生產新化合物。[產業上的可利用性]根據本發明，能夠從基因序列中除去內含子，僅使外顯子連接，因此，可以說能夠人為地進行剪接。使用本發明時，能夠使未知的生物合成基因組表達，因此，有可能能夠創制目前為止沒有確定分離結構的該基因群編碼的蛋白質、及該蛋白質合成的有用的生物活性物質。因此，根據本發明，能夠提供新的藥品、農藥、或它們的先導化合物。
權利要求
1.一種制作表達載體的方法，所述方法將真核生物具有的、包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列的外顯子序列連接，制作包含該連接成的序列的表達載體，所述方法包括以下工序: 工序(a):利用PCR，從提取自真核生物的基因組，將外顯子序列作為多個片段擴增， 這里，PCR中使用的正向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，反向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，通過使用這些引物，在擴增的片段的末端添加與連接在該片段上的片段的末端部分同源的序列或與載體的限制性酶處理末端部分同源的序列，及 工序(b):將通過工序(a)得到的片段和經限制性酶處理過的載體同時轉化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重組得到片段和片段、及片段和載體連接成的表達載體。
2.一種制作表達載體的方法，所述表達載體包含真核生物具有的、包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列的全長cDNA序列，所述方法包括以下工序: 工序(a):從提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段，利用PCR擴增該cDNA片段， 這里，PCR中使用的正向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的有義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的有義鏈的3’末端部分的序列 互補的序列、及與擴增的片段的有義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，反向引物從5’末端向3’末端的方向依次具有:與使擴增的片段連接所得的片段的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、或與載體的限制性酶處理末端部分的反義鏈的3’末端部分的序列互補的序列、及與擴增的片段的反義鏈的5’末端部分的序列互補的序列，通過使用這些引物，在擴增的片段的末端添加與連接在該片段上的片段的末端部分同源的序列或載體的限制性酶處理末端部分同源的序列，及 工序(b):將通過工序(a)得到的cDNA片段和經限制性酶處理過的載體同時轉化至芽殖酵母或分裂酵母，由此利用同源重組得到片段和片段、及片段和載體連接成的表達載體。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，真核生物為霉菌。
4.如權利要求3所述的方法，其中，霉菌為青霉屬(Penicilium屬)、毛殼屬(Chaetomium 屬)、或曲霉屬(Aspergillus 屬)。
5.如權利要求1 4中任一項所述的方法，其中，基因或推定為基因的基因組序列為4 20kbo
6.如權利要求1 5中任一項所述的方法，其中，基因或推定為基因的基因組序列為編碼聚酮合酶或非核糖體肽合成酶的序列。
7.如權利要求1 6中任一項所述的方法，其中，被連接的序列為包含序列號15 21、29及47中的任一個表不的堿基序列的多核苷酸。
8.一種轉化體，導入有通過權利要求1 7所述的方法制作的表達載體。
9.一種蛋白質，由權利要求8所述的轉化體產生。
10.一種得到化合物的方法，所述方法使用通過權利要求1 7所述的方法制作的表達載體，得到由包含內含子的基因或推定為基因的基因組序列編碼的蛋白質產生的化合物。
11.如權利要求10所述的方法，包 括下述工序:培養導入了表達載體的轉化體，從培養液或轉化體中提取化合物。
全文摘要
本發明涉及一種表達載體的制作方法，所述方法從真核生物具有的包含內含子的基因中除去該基因所包含的內含子，僅將外顯子序列連接，從而制作包含該連接的序列的表達載體。詳細而言，涉及以下方法利用PCR從包含內含子的霉菌的巨大基因中將外顯子序列作為一個或多個片段擴增，利用缺口修復克隆法將該片段及經限制性酶處理的載體連接，從而制作包含連接的外顯子序列的表達載體的方法；合成巨大基因的cDNA片段并連接，制作包含全長cDNA序列的表達載體的方法；導入了利用該方法制作的表達載體的轉化體；由該轉化體產生的蛋白質；以及得到使用該表達載體由該蛋白質產生的化合物的方法。
文檔編號C12N1/21GK103119161SQ201180041800
公開日2013年5月22日 申請日期2011年8月11日 優先權日2010年8月13日
發明者渡邊賢二, 守屋央朗 申請人:靜岡縣公立大學法人, 國立大學法人岡山大學