用于提高多能干細胞分化成肝細胞的3維支架的制作方法

專利名稱：用于提高多能干細胞分化成肝細胞的3維支架的制作方法
技術領域：
本發明涉及合成或動物來源的3維(3D)生物支架作為基體用于提高hPS (人類多能干細胞)的生長和分化的應用；這些支架適合與現有的細胞培養實驗室塑料器皿一起使用。更具體地說，本發明涉及用hPS細胞接種單獨的或具有各種生物基質涂層的這些支架，以提高所述hPS細胞分化成肝細胞或肝細胞樣細胞類型。本發明還涉及將部分分化的肝細胞祖細胞接種到支架上，以進一步分化成更成熟的肝細胞類型。
背景技術：
哺乳動物細胞培養多年來，哺乳動物細胞培養方法已被改善和標準化，并且允許細胞生長、擴增和分化所需要的條件已被充分確定。細胞可以在無菌塑料表面例如聚苯乙烯上常規培養，所述塑料表面往往與基質涂層一起使用，所述基質涂層被設計成更接近地重現細胞會正常生長的體內環境。在胚胎干細胞的情況下，往往需要飼養細胞層例如小鼠胚胎成纖維細胞層來為營養和支持所述細胞的·增殖提供更好的基體。典型地，哺乳動物細胞被培養在通常含有添加劑例如胎牛血清的支持性培養基中，所述培養基除了向細胞提供各種激素和生長因子之外，還含有同樣有助于復現細胞生長的理想微環境的許多細胞基質組分。當前，哺乳動物細胞培養具有各種各樣的下游應用，包括它們在基礎研究中的應用、它們在藥物和毒理學分析中的應用和它們在產生正確折疊的重組哺乳動物蛋白中的應用。最近，哺乳動物細胞培養已被進一步開發用于再生醫學領域，由此獲取組織例如皮膚真皮層并將其增殖一定的時間段，以便生成更大量的組織以供臨床外科用，例如修復外傷性損傷之后的傷口或修復患病的內臟器官。可是，從原代來源獲得的細胞在它們進一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要復雜的生長培養基配方和生長條件來進行成功培養。由于免疫排斥的問題，它們在再生醫學中的應用也有限。最近，在旨在越過這些障礙的胚胎干細胞研究領域中有許多進展。這種多能干細胞不僅能夠幾乎無限地增殖，它們還具有分化成構成完全發育的生物體的每種細胞和組織類型的能力。因此，多能干細胞在開發新藥的試驗中可能是重要的工具，并且因為它們的供應實際上是無限的，因此它們提供了更廉價并且可變性較少的來源。3D生物支架多能干細胞分化中的主要挑戰之一是控制分化，使得始終產生成熟、功能完全的細胞類型而不是部分分化、不成熟的前體細胞或各種細胞類型的高度異質性混合物。使多能干細胞分化的最簡單方式是在2D塑料基體上，但不幸的是，這往往產生缺乏成熟細胞類型的特征性表型的分化細胞。這部分是由于不能復現干細胞在正常胚胎發生期間所經受的條件，正常胚胎發生過程與2D培養物的不同之處在于它當然是在3維中發生的。研究人員試圖解決這個問題的一種方式是開發新的3D培養系統，所述新的3D培養系統旨在更忠實地復現細胞在胚胎發生期間所經受的一些條件并讓它們以更天然的方式分化。特別是，這樣的3D系統允許細胞在更大的程度上彼此相互作用，并允許開發比利用2D細胞培養觀察到的任何物體更類似于功能性器官的復雜的多細胞聚集體。
3D系統依賴于生物活性支架的存在，細胞可以接種并可以粘著在所述支架上。這樣的支架必須有助于引導細胞以所需的3D構造生長和增殖，并且也可能需要提供幫助細胞形成所需結構的某些分子信號。生物支架的另一個重要要求是它們是可放大的，以便組織生長和細胞分化可以在更大、更經濟的規模上進行。支架可以由各種材料構成，正確的支架選擇在引導接種到其上的任何細胞的生長、增殖和分化中可能是關鍵的。例如，支架通常由安排成多孔海綿形式的聚合材料構成。于是，接種到這種支架中的細胞可以通過支架內部相互連接的管道和通道網絡在所述支架的孔結構內部粘著和生長，當選擇適合的支架時，孔徑是重要的考慮因素。生體活性劑例如細胞外基質(ECM)組分，在沉積到支架表面上時，也可以用來增強支架功能，以容許更好的細胞粘著。最終的結果是為細胞提供一種體外環境，使細胞可以在其中更切實可行地并且以更接近地類似于它們正常的體內家園的方式進行相互作用。在幾種培養系統中，添加細胞外基質誘導細胞極性和組織的組織化。例如，當用第二層膠原蛋白進一步覆蓋培養在平的膠原蛋白層上的單層原代肝細胞時，即所謂的夾心培養，與常規2D培養物的肝細胞相比，所述細胞顯示出形態和功能改善(Dunn，J.等，1991)。所述覆蓋層導致細胞保持肌動蛋白絲與體內狀態相似，與此相反，在2D對照培養中看到異常的應激纖維形成(Berthiaume，F.等，1996)。生理更相關的細胞骨架組織化和隨后的細胞極性與形狀可能引起肝功能性提高，但是后來認為，夾心培養的有益效應主要起因于改善的細胞-細胞接觸而不是細胞與細胞外基質的接觸(Hamilton, G.等,2001)。膠原蛋白支架也已被用于將胚胎干細胞分化成肝細胞。Baharvand和同事發現，與傳統2D中分化的細胞相比，肝細胞樣細胞在膠原蛋白支架內部的分化改善了形態特征、基因表達模式和代謝活性(Baharvand, H.等，2006 )。藻酸鹽提供了多孔非粘著 性3D支架，支持肝細胞聚集形成強烈的細胞-細胞相互作用，導致肝功能改善(Dvir-Ginzberg, M.等,2003)。藻酸鹽基質中的環境還支持新生大鼠肝細胞的分化(Dvir-Ginzberg, M.等,2008)和 HepG2 成熟(Elkayam, T.等,2006)為更成熟的功能性表型。另外，當將C3A肝細胞系作為球狀體在藻酸鹽中進行培養時，因為許多不同CYP的酶活性比在2D單層培養中增加，因此，C3A肝細胞系顯示出藥物代謝提高(Elkayam, T.等,2006)。最近,市場上已推出幾種用于提供3D支架以支持細胞培養的新產品，包括已被發現改善肝細胞培養條件的3D交織納米纖維支架(Wang, S.等,2008)。另夕卜，多孔聚苯乙烯支架提供了空間，能夠讓細胞生長和分化并形成具有復雜的3D細胞-細胞相互作用的層(Bokhari, M.等,2007a ;Bokhari, M等,2007b)。在這些支架中，HepG2響應于生化試劑的方式遠比在2D中培養的細胞更加類似于體內組織的活性(Bokhari, M.等，2007a)。另外，小鼠ES細胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作為球狀體成功地向肝細胞分化，目的在于通過組合生長因子處理和多細胞球狀體形成來發展大量分化培養法(massdifferentiation culture method) (Matsumoto, K.等，2008)。肝細胞培養肝功能衰竭和終末期肝臟疾病在全世界造成為數巨大的死亡并且是醫療保健系統的主要負擔。肝臟移植仍然是最成功的治療。可是，這種方法的功效有限并且與許多并發癥例如感染或排斥關聯。肝臟移植還具有可利用的供體器官短缺的缺點，并且被治療的患者往往需要終身免疫抑制治療。通過減少對器官的需要，基于細胞的治療對于社會和患有這些嚴重疾病的個體都將是極為重要的。此外，肝臟是人體中代謝和解毒的中心，因此為了鑒定用于體外試驗的功能性細胞類型的可靠來源，已經進行了大量的嘗試。不幸的是，目前可利用的任何細胞類型都不能真實反映肝臟的復雜性和功能。從hPS細胞生成肝細胞樣細胞的方法往往包括胚狀體的形成和/或基于添加細胞毒性化合物進行早期選擇，所述肝細胞樣細胞可以進一步分化成成熟肝細胞(Rambhat I a, L.等,2003)。這些選擇步驟,特別是胚狀體的形成,往往導致大量細胞損失并進而導致效率低下。該方法是復雜的，大多數具有非常長的世代時間并包括幾個耗時的步驟。因此，需要迅速和簡單的方法用于形成源自于未分化的hBS細胞的肝細胞樣細胞。以前用于獲得肝細胞樣細胞的嘗試，例如如US20030003573中所公布的，產生了與起始材料有關的低收率。此外，原代人類肝細胞的可利用性非常有限，并且還知道，所述細胞在用于體外應用時迅速失去它們的正常表型和功能性質。一種經常使用的原代細胞替代物是轉而包含非常低水平(或完全缺乏)的代謝酶并且其他重要蛋白質的分布與體內天然肝細胞顯著不同的肝細胞系。因此，雖然已知肝臟代謝是物種特異性的并因此在預測所測試的物種以外的其他物種的肝臟代謝和毒性中產生困難，但許多試驗仍然使用動物材料來進行。在藥物開發中，肝臟不良反應仍然是最突出的副作用。因此早期預測發生人類肝臟毒性的傾向性在選擇化合物進入臨床試驗時具有至高的重要性。提高這方面的能力的嘗試必須解決可利用性問題和模型建立這兩者，這為與引起人類肝臟不良損傷相符的復雜生物過程提供更好的覆蓋度。因此，迫切需要一種模型系統，所述模型系統模擬人類肝細胞，而且能夠在新藥或化學品的開發中預測候選分子的效應。就可利用性和生理相關性這兩方面而言，hPS細胞可以擔任功能性人類肝細胞的理想的可再生來源。

發明內容

本發明的發明人已經制定了許多穩妥的方案，這些方案允許將hPS細胞、肝細胞前體細胞或肝細胞祖細胞接種到3D生物支架上，以可再現地和可放大地產生具有成熟的形態和功能的肝細胞。本發明包括用于提高人類多能干細胞(hPS)分化成肝細胞祖細胞或肝細胞細胞類型的方法，其中所述hPS細胞初始被培養在2維培養表面上，然后轉移到一組定義的3D生物支架之一上用于進一步分化和成熟。hPS細胞初始也可以在2維表面上部分分化成肝細胞祖細胞類型。隨后，將肝細胞祖細胞或hPS細胞接種到裸露的3維支架或已經涂覆有基質化合物的支架上，并進一步培養。作為本發明的重要方面，本發明人已經發現，通過將hPS細胞在2D環境中初始生長并任選初始分化，然后將所述細胞轉移到3D環境中，顯著增加了肝細胞相關基因的表達和肝細胞相關酶的產生。定義在本文中使用時，“人類多能干細胞”(hPS)是指可以源自于任何來源并且在適合的條件下能夠產生源自于全部3個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的不同細胞類型的人類子代細胞的細胞。hPS細胞可以具有在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在組織培養中形成可識別的所有三個胚層的細胞的能力。人類多能干細胞的定義中包括各種類型的胚胎細胞，包括人類胚胎干(hES)細胞(參見，例如，Thomson, J.A.等(1998)，Heins, N.等(2004))，以及誘導的多能干細胞(參見，例如Yu，J.等，(2007) ;Takahashi，K.等(2007))。本文中描述的各種方法和其他實施方式可能需要或利用來自各種來源的hPS細胞。例如，適合使用的hPS細胞可以從發育中的胚胎獲得。另外或可選地，合適的hPS細胞可以從建立的細胞系和/或人類誘導的多能干(hiPS)細胞獲得。在本文中使用時，“hiPS細胞”(也稱為“iPS”)是指人類誘導的多能干細胞。在本文中使用時，“定型內胚層(DE)”和定型內胚層細胞(DE細胞)是指表現出例如但不限于定型內胚層細胞典型的蛋白質或基因表達和/形態的細胞，或者包含大量與定型內胚層細胞類似的細胞的組合物。在本文中使用時，“肝前體細胞”或“肝祖細胞”是指表現出例如但不限于定型內胚層細胞典型的蛋白質或基因表達和/或形態的標志物的細胞，或者包含大量與肝前體細胞或肝祖細胞的細胞類似的細胞的細胞組合物。在本文中使用時，“肝細胞”或“肝細胞樣細胞(HCLC)”用來表示表達至少一些成熟的肝臟標志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和CYP2D6的細胞類型。在本文中使用時，“hESC-HEP”用來表示源自于人類胚胎干細胞并表達成熟的肝臟標志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6 的
細胞類型。在本文中使用時，“hiPS-HEP”用來表示源自于誘導的多能干細胞并表達成熟的肝臟標志物例如白蛋白、CYP3A 4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的細胞類型。在本文中使用時，“無異源(Xeno-free)”是指細胞系或細胞材料從來沒有直接或間接暴露于非人類動物來源的材料，例如細胞、組織和/或體液或其衍生物。在本文中使用時，“Wnt信號轉導”是指Wnt信號轉導中所包括的途徑，如例如Nejak-Bowen 和 Monga (2008)中所綜述的。在本文中使用時，HDAC抑制劑是指組蛋白去乙酰化酶抑制劑。在本文中使用時，“GSK抑制劑”是指抑制GSK(尤其是GSK3，包括GSK3a或GSK3 3 )的化合物。用于本發明的優選GSK抑制劑的實例包括下列的一種或多種:BIO (2，Z, 3’ E)_6_ 溴靛紅 _3’ -肟(GSK3 抑制劑 IX)；BIO-丙酮肟(2’ Z, 3’ E)_6_溴靛紅_3’ -丙酮肟(GSK3抑制劑X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制劑XIII);吡啶咔唑-環戊二烯釕復合物(GSK3抑制劑XV)；TDZD-8 4_ 芐基 _2_ 甲基-1, 2，4_ 噻二唑啉 _3，5_ 二酮(GSK3 β 抑制劑 I)；2-硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]_噁二唑(GSK3 3抑制劑II)；0TDZT2, 4_ 二芐基_5_氧代噻二唑啉_3_硫酮(GSK3 β抑制劑III)；a -4- 二溴苯乙酮(GSK3 β 抑制劑 VII);AR-AO 14418 N-(4-甲氧基芐基)-N’- (5_ 硝基 _1，3_ 噻唑 _2_ 基)脲(GSK-3 β抑制劑VIII)；
3-(1-(3-羥丙基)-1H_吡咯并[2，3_b]卩比啶_3_基]_4_吡嗪_2_基-批咯-2，5- 二酮(GSK-3 β 抑制劑 XI);TffSI 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3 β抑制劑XII);L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 或其肉豆蘧酰化形式(GSK3 β 抑制劑 XIII);和2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)_乙酮(GSK3 3抑制劑VI);和氨基嘧啶CHIR99021。另外，許多無翅型蛋白或Wnt蛋白的功能與GSK抑制劑、特別是本發明的GSK抑制劑相似。因此，它們被歸入術語GSK抑制劑下。可以用于本發明的不例性 fct 蛋白包括 Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wntl0、Wntl4、Wntl4b、Wntl5 和 Wntl6中的一種或多種，以及其他fct蛋白。優選使用Wnt3a。此外，小分子可用于指導Wnt信號轉導。同樣，對誘導Wnt信號轉導的GSK33阻斷劑或抑制劑可以用于調節Wnt信號轉導以實現指導分化和成熟。可以在起動之后較晚的階段或在誘導發生之前誘導fct信號轉導途徑。在本文中使用時，“CYP”用來表示細胞色素P，更具體地是表示細胞色素P450，細胞色素P450是肝臟的主要I相代謝酶，由許多不同的同工酶組成，例如CYP1A1、CYP1A2、CYPlBU CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7 和 CYP7A1。在本文中使用時，術語“GST”用來表示谷胱甘肽轉移酶，其亞型的實例是GSTAl-UGST Ml-1 和 GST Pl-10 在本文中使用時，術語“UGT”用來表示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶，它是催化葡萄糖醛酸化活性的一組肝臟酶。在本文中使用時，術語“細胞色素P450還原酶”(亦稱CPR)用來表示其生理功能是通過電子轉移來還原細胞色素P450酶并因此是細胞色素P450酶介導的反應所需要的蛋白質。術語“功能性藥物代謝酶”用來表示屬于I相和II相酶的功能性酶，所述I相和II相酶執行異源生物物質和藥物的化學修飾，即所謂的藥物或異源生物物質代謝。在本文中使用時，術語“功能活性”是指有效的可測定的肝細胞功能，例如藥物轉運蛋白的可測定的藥物轉運以及細胞色素P450 (CYP)的可測定的酶代謝，它們通常是在原代人類肝細胞中被檢測到的。在本文中使用時，術語“胚外內胚層(ExE)”用來表示分化的內胚層細胞，它們與定型內胚層相反，在人類發育中將構成胚胎外部的區室，例如卵黃囊。在本文中使用時，術語“AAT”用來表示肝臟標志物α-抗胰蛋白酶。在本文中使用時，術語“醇脫氫酶I”用來表示一種脫氫酶類型，其促進醇與醛或酮之間的相互轉化，其中將NAD+還原為NADH。醇脫氫酶I起到分解原本可能有毒的醇的作用。在本文中使用時，術語“AFP”用來表示肝臟標志物α-甲胎蛋白。在本文中使用時，術語“BSEP ”用來表示膽汁轉運蛋白膽鹽輸出泵。在本文中使用時，術語“CK”用來表示肝臟標志物細胞角蛋白(可互換使用)，它有不同的亞型，例如細胞角蛋白18 (CK18/KRT18)、細胞角蛋白19 (CK19/KRT19)、細胞角蛋白8 (CK8)和細胞角蛋白7 (CK7)。
在本文中使用時，術語“FGF”是指成纖維細胞生長因子，優選為人和/或重組來源的，屬于它的亞型是例如“bFGF”(是指堿性成纖維細胞生長因子，有時也稱為FGF2)和FGF4。“aFGF”是指酸性成纖維細胞生長因子(有時也稱為FGF1)。在本文中使用時，術語“BMP”是指骨形態發生蛋白，優選為人和/或重組來源的，屬于它的亞型是例如BMP4和BMP2。在本文中使用時，術語“HGF”是指肝細胞生長因子，優選為人和/或重組來源的。在本文中使用時，“HNF3i3 ”或“HNF3b”可互換使用，用來表示肝細胞核因子3，它是調節內胚層來源的組織例如肝臟、胰島和脂肪細胞中基因表達的轉錄因子。HNF3 0有時也可以稱為HNF3b或Fox2A,后一名稱起源于該轉錄因子是叉頭框(Forkhead box)轉錄因子家族的成員。在本文中使用時，術語“0CT-1”用來表示有機陽離子轉運蛋白I。0CT-1是主要的肝轉運蛋白，它介導許多有機陽離子從血液攝取到肝臟中，化合物可以在肝臟中被代謝或分泌到膽汁中。在本文中使用時，術語“MDR”用來表示多藥耐藥性轉運蛋白。MDRl和3是ATP結合盒(ABC)轉運蛋白家族的成員，二者都是藥物外排轉運蛋白。MDRl在調節藥物、肽和異源生物物質運輸到身體中以及在保護身體對抗異源生物物質損傷和藥物毒性方面是重要的，而MDR3是磷脂分泌到膽汁中所必不可少的。在本文中使用時，術語“激活素”用來表示一個TGF-β家族成員，它表現出范圍廣泛的生物活性，包括調節細胞增殖和分化，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素屬于常見的TGF-β配體超家族。在本文中使用時，術語“ROCK抑制劑”用來表示ROCK Rho激酶的小分子抑制劑，例如Y-27632或法舒地爾。 在本文中使用時，術語“無異源”用來表示完全避開了直接或間接暴露于非人類動物組分。在本文中使用時，術語“肝細胞毒性”是指細胞反應例如壞死性毒性、凋亡、線粒體毒性、磷脂沉積、脂肪變性和膽汁酸轉運。發明的具體描述本發明的一個方面涉及用于將人類多能干細胞(hPS)或肝細胞前體細胞分化成成熟肝細胞或肝細胞樣細胞的方法，所述方法包括以下步驟:i)在2維表面上接種hPS或肝細胞前體細胞以起始分化ii)將步驟i)的初始分化的細胞轉移到3維(3D)支架上用于進一步分化和成熟。然而，所述細胞在3D支架上的接種密度可以高于在2D培養物上的接種密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。此外，可以添加Rho激酶(rock)抑制劑和/或可以在無飼養細胞或無異源的條件下執行所述方法。本發明的方法中所使用的細胞可以是無異源的細胞，例如無異源的hPS細胞系或來源于無異源的hPS細胞系的細胞，或者所述細胞可以是人類胚胎干(hES)細胞或誘導的多能干(iPS)細胞。本發明的肝細胞前體細胞可以是定型內胚層(DE)細胞或不是定型內胚層細胞，并且可以具有胚胎內胚層或肝內胚層的特征。可以在2至25天、例如4至15天之后執行從步驟i)到ii)的過渡，即將步驟i)中獲得的細胞轉移到3D支架上(步驟ii)。3維支架可以選自下列類型之一:i)多孔藻酸鹽海綿，ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物，iii)乳液模板型聚苯乙烯，iv)合成納米纖維復合物，V)具有至少一個非直立側壁的微孔裝置，vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海綿，或者所述3維支架可以是另一種合適的類型。多孔藻酸鹽海綿可以具有50-200 μ M的孔徑，而乳液模板型聚苯乙烯支架的孔徑在0.1-1000 μ M、例如15-45 μ M范圍內。此外，本發明涉及如上所述的方法，其中3D支架是未涂覆的。在另一個方面，用例如一種或多種細胞外基質組分預先涂覆3D支架。這樣的細胞外基質組分的實例包括:明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、聚賴氨酸、玻連蛋白、透明質酸、透明質酸水凝膠、絲纖蛋白、殼聚糖、或任何前述項的復合物。本發明的3D支架可以被包含在合適的培養容器內，所述培養容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板,或其他合適的·細胞培養容器。因此，本文詳述的發明包括用于提高hPS細胞向更具肝臟表型的細胞或最終具有部分或完全成熟的肝臟表型的細胞分化的方法，這種方法要求細胞初始被培養在2維培養表面上，然后轉移到六種可能的3維支架之一上。肝臟表型的這種改善與任何具體的細胞培養基的組成無關(對于所采用的細胞培養方案的詳情，參見圖9)。根據基因表達和代謝研究，本發明的發明人發現，與更傳統的2D基體相比，3D支架為hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞的成熟和進一步分化提供了更好的環境(

圖1-6)。此外，本發明人發現，當將細胞培養在2D表面上、然后將所述細胞接種到3D環境中時，有進一步的效果。這可以通過比較幾種肝臟標志物基因例如Cyp2C9、白蛋白、Cyp3A4和UGT2B7的表達看出，所述標志物基因在3D支架上培養的細胞中的表達均比在2D表面上培養的細胞中的表達高，而與細胞系、基質涂層、培養天數或所選的支架無關。特別是，當被培養在3D中時，許多肝轉運蛋白(BSEP、FABPl、MRP2、NTCP, 0ATP2、OCTI)的表達水平高得多，表明肝細胞更成熟和更具功能。在一系列不同的支架類型上，包括拓撲形態支架(topographicalscaffolds)例如 Ultraweb (圖 3)和 Aggrewell (圖 5)、多孔海綿類型例如 AlgiMatrix (圖2)和聚L-賴氨酸(圖6)，以及在基于合成聚合物的支架例如Artelon (圖1)和Alvatex (圖4)上，都可以看到這種結果。可以預先用基質組分涂覆3D支架，以更好地類似于肝細胞正常遇到的體內微環境。特別是，基質組分明膠和基質膠已經顯示出在與支架一起使用時提高一些肝臟標志物的表達水平。幾種標志物(TAT，CYP2C9，0ATP2)在基質膠涂覆的Artelon (Artimplant)上的表達高于未涂覆的(圖1C和E ;圖1A和D)。許多標志物(TAT和UGT2B7)在基質膠涂覆的Alvatex上的表達顯著高于未涂覆的(圖4F和G，在第18天時分析)，并且對于幾種其他標志物(例如TAT，UGT2B7)也是如此，它們在明膠涂覆的Alvatex上的表達程度高于未涂覆的(圖4E和G)。根據希望看到哪種標志物高度表達，可以任選應用本發明的這種具體實施方式
。因為特定的標志物組的表達將暗含肝譜系的某些表型或階段，因此，本發明這方面的運用可以允許程度更精細地控制所生成的肝細胞的功能性。這方面的擴展是可以向接種到3D支架上的hPS細胞或hPS來源的肝祖細胞添加一種或多種不同的細胞類型，使得在3D支架上共同培養細胞系。值得注意的是，可以將細胞以不同的相對密度接種在3D支架上。相對密度可以是標準的Xl密度(即，與接種在2D對照表面上的細胞密度相同)或高三倍的初始密度(表示為x3)或高10倍的密度或其間的任何密度。圖1H和I顯示，當使用未涂覆的Artelon(Artimplant)時，標志物0ATP2、0CT1和TAT的表達在以較低的xl初始密度接種的細胞中更高。某些標志物(例如CYP7A1)在未涂覆的Alvatex上以x3接種的細胞中的表達也比以xl接種的細胞中的表達低(圖4N和0)，但其他標志物(例如OCTl)在未涂覆的Alvatex上以x3接種的細胞中具有更高的表達(圖41和K)。因此，這種具體實施方式
的運用也取決于使用者需要的肝細胞的期望表型。為了容許控制分化，細胞被接種到3D支架上時的分化階段是相關的，即被接種到3D支架中之前培養較長時間則表型更成熟。hPS細胞可以在幾個不同的分化階段，例如作為未分化的細胞(第O天)、或用激活素A進行定型內胚層誘導處理之后(第4-7天)、或作為肝前體細胞(第9、11、13、14和15天)，被接種到所述支架中用于在3D支架中成熟。在接種到支架上之前，可以對這樣的前體細胞進行表征，以確定它們是處于胚胎內胚層譜系(圖11)還是更晚期的肝細胞前體(圖12)，依據的是這兩個階段特征性的所定義的標志物基因的表達。在被培養在Artelon (Artimplant)上的細 胞中容易觀察到差別，其中例如在14天時接種的細胞中OCTl的表達水平幾乎是在第11天時接種的細胞的兩倍(圖1F和H)。與此相反，在14天時接種到Artelon (Artimplant)上的細胞中，0ATP2的水平比在第11天時接種的細胞低(圖1J和M)。在被培養在Alvatex上的細胞中也可以看出這種趨勢，其中14日齡接種的細胞同樣具有比11天細胞低的0ATP2表達水平，這可能表明0ATP2是更不成熟的肝細胞表型的標志物(圖41和J)。以類似的方式能夠看出，在更年輕時(第11天)接種的細胞中OCTl的水平也比更成熟(第14天)的細胞中的高(圖4N和P)。因此，細胞培養和分化時間的長度是本發明在控制所產生的細胞的最終表型方面的重要因素，并可以相應地進行改變。如圖9和下面表中所概括的，可以調整培養的持續時間和培養基組成，以優化通過本文中公開的方法獲得的細胞的成熟度和發育階段。相關的方面涉及細胞在接種到支架上之前所接受的分化方案，如實施例2中所詳述的，特別是細胞是否暴露于含有Rho激酶ROCK抑制劑的培養基，這種抑制劑被用來在2D和3D兩階段中傳代和接種之后提高存活率和再粘著。已經觀察到，與生長在常規的2D表面上的肝細胞相比，接種到3D支架上的肝細胞中的功能和代謝活性改善。根據實施例6，在3D支架中成熟的hESC來源的肝細胞，當暴露于藥物非那西汀(APAP)、咪達唑侖或雙氯芬酸時，顯示出比2D對照培養更高的CYP活性誘導(圖7和8、10),其中Alvatex支架顯示出比Ultraweb更高的誘導。對培養在Alvatex(Reinnervate)上的細胞的進一步研究顯示,在起始分化之后23和29天時,如由CYP2C9活性所測定的，那些細胞均比培養在2D表面上的細胞具有高得多的代謝活性。CYP2C9活性在培養在3D表面上的細胞中已經是高的，但是當用雙氯芬酸處理細胞時還觀察到升高(圖8)。這再次顯示在3D支架上分化的肝細胞在與2D培養物細胞相比時，具有優異的肝細胞代謝功能。這些結果得到以下實驗結果的支持:當對藥物咪達唑侖的細胞代謝分解產物進行分析時，發現與2D對照相比，關鍵的肝臟標志物CYP3A在培養在基質膠涂覆的Alvatex(Reinnervate)上的細胞中的水平也較高,在培養在Ultraweb上的細胞中的水平略高(圖8)。因此，本發明已經顯示了在培養在3D支架上的細胞中肝代謝活性提高的幾個實施例。因此，正如以上的討論，本發明的一方面涉及一種方法，其中如由一種或多種CYP標志物例如CYP2C9或CYP3A的表達增加和/或選自CYP1A1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT的肝細胞相關遺傳標志物的水平升高所顯示的，肝細胞或肝細胞祖細胞表現出代謝活性升高。此外，本發明的一方面涉及一種方法，其中肝細胞或肝細胞祖細胞表現出一種或多種肝相關轉運蛋白例如BSEP、FABPl、MRP2、NTCP、0ATP2、OCTl的表達增加。正如以上的討論，本發明方法刺激了肝細胞或肝細胞祖細胞與非肝細胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο前述權利要求任一項的方法，其中將肝細胞或肝細胞祖細胞與至少一種其他細胞類型共同培養在3D支架上，所述其他細胞類型選自但不限于:星形肝細胞、肝免疫(Kuppfer)細胞、肝內皮細胞、膽管上皮細胞或成纖維細胞。因此并且正如以上的討論，本發明的一方面涉及可通過本文中描述的方法獲得的hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞或者包含hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞的組合物。本發明的其他方面涉及通過本文中的方法獲得的hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞或者包含hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞的組合物在治療、再生醫學、藥物篩選、毒性測試或藥物遞送中的應用。所述組合物還可以包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸鹽海綿、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型 聚苯乙烯或合成納米纖維復合物。
實施例實施例L來源于人類多能干細胞的肝細胞的起始材料所有hPS細胞(如上所定義)均可被用作本發明的起始材料。對于下面的實施例而言，肝細胞樣細胞在體外來源于被培養在mEF細胞上的未分化人類胚胎干細胞(hESC)(Heins, N.等2004，Stem Cells)。用于這個實驗的細胞系可以是、但不限于hES細胞系SA002、SA121、SA181、SA461 (Cellartis AB，CiGteborg,瑞典，http://www.cellartis.com),并且它們可以如Heins，N等2004所描述的進行增殖。在NIH干細胞登記處、UK干細胞庫和歐洲hESC登記處中列出了這些細胞系，并且可通過請求來獲得這些細胞系。與從hESC獲得的hPS—起，從hiPS (誘導的多能干細胞)獲得的hPS已被用于在本發明實施例中獲得肝細胞。在這種情況下，“hiPS-HEP”用來表示源自于誘導的多能干細胞并表達成熟的肝臟標志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的細胞類型(也參見“定義”)。無異源的iPS細胞或無異源來源的hES細胞系例如SA611(Cellartis AB, GSteborg，瑞典,http://www.cellartis.com)的應用可以任選讓整個發明
在無異源的條件下用于產生無異源的細胞產物。實施例2.
利用3D支架從人類多能干細胞獲得肝細胞
按照下面詳述的方案a-e，從hES細胞和人類hiPS細胞二者獲得肝細胞。在開始分化之前，用PBS洗滌培養物兩次。新鮮制備不同的培養基(表1)，并從O天以后根據方案概述添加所述培養基。在初始分化(ID)步驟期間，每天或每兩天更換培養基，以后每兩天或每三天更換培養基。每個實驗只使用一種細胞系，但是任選在將初始細胞系接種到3D支架上時可以添加第二種(或更多種)細胞系，讓所述細胞共同培養。除了在實驗114和116中，2D培養物被接種在明膠涂覆的培養容器上之外，2D培養物均被接種在基質膠涂覆的培養容器上。2D培養物以150.000-200.000細胞/cm2進行接種。下表顯示了關于不同實驗、哪種細胞系被用作起始材料、如圖9中概括的不同形式的分化方案、分化方案中細胞被接種到3D支架中時的時間、對細胞進行分析時的分化時間、和在接種到支架中時是否向培養基添加了 IOmM ROCK抑制劑的概述(對于所采用的方案的示意性細節，也參見圖9):
權利要求
1.關于將人類多能干細胞(hPS)或肝細胞前體細胞分化成肝細胞祖細胞、肝細胞樣細胞或成熟肝細胞的方法，所述方法包括以下步驟: i)在2維表面上接種和生長hPS或肝細胞前體細胞以起始分化 ii)將步驟i)的初始分化的細胞轉移到3維(3D)支架上用于進一步分化和成熟。
2.權利要求1的方法，其中細胞在3D支架上的接種密度高于在2D培養物上的接種密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。
3.權利要求1的方法，其中在細胞存活因子例如ROCKRho激酶抑制劑的存在下接種細胞。
4.述權利要求任一項的方法，其中在無飼養細胞的條件下執行步驟i)或ii)中的至少一個。
5.述權利要求任一項的方法，其中在無異源的條件下執行步驟i)或ii)中的至少一 個。
6.述權利要求任一項的方法，其中hPS細胞或肝細胞前體細胞是無異源的細胞，例如來源于無異源的hPS細胞系。
7.述權利要求任一項的方法，其中hPS細胞是人類胚胎干(hES)細胞。
8.述權利要求任一項的方法，其中hPS細胞是誘導的多能干(iPS)細胞。
9.權利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞是定型內胚層(DE)細胞。
10.權利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞不是定型內胚層(DE)細胞。
11.權利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞具有胚胎內胚層的特征。
12.權利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞具有肝內胚層的特征。
13.述權利要求任一項的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，將步驟i)中獲得的細胞轉移到3D支架上(步驟ii)。
14.述權利要求任一項的方法，其中3D支架選自下列之一: i)多孔藻酸鹽海綿 ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物 iii)乳液模板型聚苯乙烯 iv)合成納米纖維復合物 V)具有至少一個非直立側壁的微孔裝置 vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海綿。
15.權利要求14的方法，其中3D支架是孔徑為50-200μ M的多孔藻酸鹽海綿。
16.權利要求14的方法，其中3D支架是孔徑在0.11000 μ Μ、例如15-45 μ M范圍內的乳液模板型聚苯乙烯支架。
17.述權利要求任一項的方法，其中3D支架是未涂覆的。
18.權利要求1-16任一項的方法，其中用一種或多種細胞外基質組分預先涂覆3D支架。
19.權利要求18的方法，其中一種或多種細胞外基質組分選自:明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、聚賴氨酸、玻連蛋白、透明質酸、透明質酸水凝膠、絲纖蛋白、殼聚糖、或任何前述項的復合物。
20.述權利要求任一項的方法，其中支架被包含在合適的培養容器內，所述培養容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合適的細胞培養容器。
21.述權利要求任一項的方法,其中如由一種或多種CYP標志物例如CYP2C9或CYP3A的表達增加所顯示的，肝細胞或肝細胞祖細胞表現出代謝活性升高。
22.述權利要求任一項的方法，其中肝細胞或肝細胞祖細胞表現出一種或多種肝相關轉運蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、0ATP2、0CT1的表達增加。
23.述權利要求任一項的方法，其中肝細胞或肝細胞祖細胞與非肝細胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο
24.述權利要求任一項的方法，其中將肝細胞或肝細胞祖細胞與至少一種其他細胞類型共同培養在3D支架上， 所述其他細胞類型選自但不限于:星形肝細胞、肝免疫(Kuppfer)細胞、肝內皮細胞、膽管上皮 細胞或成纖維細胞。
25.PS來源的肝細胞、肝細胞樣細胞或肝細胞祖細胞，其顯示出選自下列的肝細胞相關遺傳標志物的水平升高:CYPIA1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
26.權利要求25的hPS來源的肝細胞、肝細胞樣細胞或肝細胞祖細胞，其被培養在或已經被培養在3D支架中，并且當與生長在2D表面上的相應細胞相比時，顯示出一種或多種以下標志物的水平升高:CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
27.PS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞，其可通過權利要求1-24任一項描述的方法獲得。
28.權利要求27的hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞在治療、再生醫學、藥物篩選、毒性測試或藥物遞送中的應用。
29.合物，其包含可通過前述權利要求任一項描述的方法獲得的hPS來源的肝細胞或肝細胞祖細胞。
30.權利要求29的組合物，其還包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸鹽海綿、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型聚苯乙烯或合成納米纖維復合物。
31.權利要求29-30任一項的組合物在治療、再生醫學、藥物篩選、毒性測試或藥物遞送中的應用。
全文摘要
本發明涉及合成或動物來源的3維(3D)生物支架作為基體用于提高hPS(人類多能干細胞)的生長和分化的應用；這些支架適合與現有的細胞培養實驗室塑料器皿一起使用。更具體地說，本發明涉及用hPS細胞接種單獨的或具有各種生物基質涂層的這些支架，以提高所述hPS細胞分化成肝細胞或肝細胞樣細胞類型。本發明還涉及將部分分化的肝細胞祖細胞接種到支架上，以進一步分化成更成熟的肝細胞細胞類型。
文檔編號C12N5/071GK103097517SQ201180037237
公開日2013年5月8日 申請日期2011年6月14日 優先權日2010年6月11日
發明者楊內·延森 申請人:塞拉帝思股份公司