脂溶性生理活性物質的制備方法

專利名稱：脂溶性生理活性物質的制備方法
技術領域：
本發明涉及脂溶性生理活性物質的制備方法。具體而言，涉及通過從含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或其微生物細胞破碎物 的水性懸浮液中提取脂溶性生理活性物質，從而制備脂溶性生理活性物質的方法。
背景技術：
生物體中有用的脂溶性生理活性物質已知有很多。其中，輔酶Q是廣泛分布于從細菌至哺乳動物的生物體內的必需成分，已知是作為生物體內細胞中的線粒體電子傳遞體系的組成成分。輔酶Q除了在線粒體中被反復的氧化和還原，承擔電子傳遞體系中的傳遞成分的功能外，輔酶Q中的還原型輔酶Q已知還具有抗氧化作用。在人中，輔酶Q的側鏈具有10個重復結構的輔酶QlO是主成分，在生物體內，其通常存在約40-90%的還原型。輔酶Q的生理作用可列舉通過線粒體活化作用激活能量生產、激活心臟機能、穩定細胞膜的效果、通過抗氧化作用而保護細胞的效果等。一直以來，輔酶QlO中的氧化型輔酶QlO被用作充血型心力衰竭藥或健康食品；近年來，逐漸認知具有更高生理活性作用的還原型輔酶Q10。輔酶QlO等脂溶性生理活性物質可以通過例如合成、發酵、自天然物中提取等而獲得。必要時，還可以將獲得的提取物，通過層析純化、析出結晶而結晶化，獲得更高純度的物質。例如，為了獲得輔酶Q10，一般可以培養生產輔酶QlO的微生物，使用有機溶劑從該微生物的懸浮液中提取微生物中的輔酶QlO的方法。一直以來，關于提取微生物細胞中所包含的有用成分的操作，已知有將培養后的微生物的水性懸浮液脫水，形成濕菌體，并使其與有機溶劑接觸的方法；將水性懸浮液脫水后進一步干燥，將干燥菌體與有機溶劑接觸的方法；直接將水性懸浮液與有機溶劑接觸，在液-液之間提取的方法。專利文獻I中記載了離心處理培養后的Phaffia酵母的懸浮液，回收菌體，將回收了的菌體噴霧干燥后，用己烷、乙醇等混合溶劑邊破碎菌體邊提取菌體中的蝦青素(astaxanthin)的例子。此外，還已知培養genus Mortierella的菌體,在將菌體懸浮液脫水、干燥后，通過己烷提取含有花生四烯酸的油的例子(專利文獻2);將培養了 genusMucor菌體的培養液破碎，冷凍干燥后，通過己烷等溶劑提取Y -亞麻酸的例子(專利文獻3)。在這些提取方法中，將干燥菌體與作為提取溶劑的有機溶劑混合，完成提取操作后，通過固液分離去除菌體殘渣，可以獲得含有目標物質的有機相。專利文獻4中公開了，使含有輔酶QlO的微生物的濕菌體或干燥菌體在低溫下與甲醇接觸，去除菌體內外的雜質后，再在高溫下與甲醇接觸，提取輔酶QlO的例子。在此類固-液提取操作中，由于菌體和提取溶劑的比重差大，因此具有易于提取后固液分離，目標物質損失少，可以高效提取的優點。但是，在這些方法中，在提取前，從培養后的微生物的水性懸浮液中將大量的水分通過離心分離、噴霧干燥器、冷凍干燥機等裝置而脫水、干燥的步驟是必需的，而且由于菌體中殘留的含水率，存在不能獲得充分的提取率的情況，此外還有裝置成本、運輸成本高等問題。將微生物的水性懸浮液不進行脫水、干燥而提取的例子已知有直接將培養后的微生物的破碎懸浮液與己烷、2-丙醇等有機溶劑接觸，提取菌體內的輔酶QlO (專利文獻5)。在此類液-液提取操作中，不進行脫水、干燥微生物，可以以高收率、大處理量提取目標物質，但是，在使用有機溶劑提取微生物細胞或該細胞破碎物的水性懸浮液，特別是該細胞破碎物的水性懸浮液，尤其是物理處理的該細胞破碎物的水性懸浮液的情況下，由于存在一部分蛋白質等細胞成分而易于發生乳化現象等，使含有目標物質的有機相大量困于微生物細胞的破碎懸浮液中，不僅存在不能有效分離有機相，導致收率降低的問題，而且存在所用的提取溶劑的回收率低的問題。此外，還存在除疏水性有機溶劑外，必須使用一定量的親水性有機溶劑等，使操作復雜化、成本增加的問題。此外一直以來，在液-液提取中使用表面活性劑的情況下，由于因界面效果而增加了水相和有機溶劑相的親和性，易于產生均相化，導致常常需要長時間來分離水相和有機溶劑相，或者即使花費了時間也不能分離，必須根據情況通過離心分離等操作來強制分 離。因此，在一般的液-液提取中，在提取步驟中使用表面活性劑被認為不是優選的。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:特開平7-41687號公報專利文獻2:特開2009-120840號公報專利文獻3:特開平5-17796號公報專利文獻4:專利第4275621號公報專利文獻5:特開2008-253271號公報

發明內容
發明要解決的問題如上所述，一直以來，在從微生物細胞中提取脂溶性生理活性物質等有用成分的提取操作中，提取前對微生物脫水或干燥等必需要特殊的設備，提取后含有有用成分的溶劑與菌體成分的分離性差，收率不充分，還必須使用多種溶劑等，導致操作復雜化、成本增加的問題。本發明的一個目的是，提供從含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞中，提取脂溶性生理活性物質，可以有效進行工業生產的制備方法，所述方法不使用特殊的脫水、干燥設備，并且不存在由于溶劑與菌體成分的分離性惡化而導致收率降低。發明解決問題的手段為了解決上述問題進行深入研究，結果發現使含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中存在特定的表面活性劑，進行使用有機溶劑的提取操作，不僅可以提高有機溶劑與水性懸浮液的親和性，而且在混合、靜置后，可以加快油水分離，有效提取脂溶性生理活性物質，也適合工業生產，完成本發明。換言之，本發明為如下所述。[I]脂溶性生理活性物質的制備方法，該方法包括在選自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑、蔗糖脂肪酸酯類、甘油脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑和烷基醚型表面活性劑中的至少一種非離子型表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或其微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，提取脂溶性生理活性物質。[2]上述[I]記載的制備方法，其中，脂溶性生理活性物質是輔酶Q10。[3]上述[2]記載的制備方法，其中，輔酶QlO是還原型輔酶Q10，或是還原型輔酶QlO和氧化型輔酶QlO的混合物。[4]上述[I]- [3]的任一項記載的制備方法，其中，非離子型表面活性劑至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑。[5]上述[I]_[4]的任一項記載的制備方法，其中，相對于微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液，非離子型表面活性劑的添加量為0.01重量％以上。 [6]上述[1]-[5]的任一項記載的制備方法，其中，有機溶劑是疏水性有機溶劑。[7]上述[6]記載的制備方法，其中，還組合使用了親水性有機溶劑。[8]上述[1]_[7]的任一項記載的制備方法，其中，提取是連續提取。[9]脂溶性生理活性物質的純化方法，該方法包括在選自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑、蔗糖脂肪酸酯類、甘油脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑和烷基醚型表面活性劑中的至少一種非離子型表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或其微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，提取脂溶性生理活性物質。[10]上述[9]記載的純化方法，其中，脂溶性生理活性物質是輔酶Q10。[11]上述[10]記載的純化方法，其中，輔酶QlO是還原型輔酶Q10，或是還原型輔酶QlO和氧化型輔酶QlO的混合物。[12]上述[9]_[11]的任一項記載的純化方法，其中，非離子型表面活性劑至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑。[13]上述[9]-[12]的任一項記載的純化方法，其中，相對于微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液，非離子型表面活性劑的添加量為0.01重量％以上。[14]上述[9]_[13]的任一項記載的純化方法，其中，有機溶劑是疏水性有機溶劑。[15]上述[14]記載的純化方法，其中，還組合使用了親水性有機溶劑。[16]上述[9]_[15]的任一項記載的純化方法，其中，提取是連續提取。發明的效果一直以來，從微生物細胞中提取有用成分的方法就存在設備、制備成本等方面、操作穩定性的問題，脂溶性生理活性物質的制備方法也具有同樣的問題，但是，通過本發明的制備方法，可以通過液-液提取操作有效的進行脂溶性生理活性物質的提取，也適合工業生產。進一步的，本發明發現在液-液提取操作時使用優選的特定表面活性劑，可以在提取時使含有目標物質的分散相在提取溶劑中微細分散，促進目標物質向提取溶劑中移動，同時，由于有機相和水相靜置后的油水分離也能快速進行，不僅可以穩定的以高收率制備脂溶性生理活性物質，而且可以抑制由于有機相移動至水相中而造成的提取溶劑的損失。此外，一直以來，為了以更高的收率獲得目標物質，在提取操作中必須使用多種提取溶劑，與該情況相對的，本發明可以僅使用單一溶劑而進行高收率的操作，因此可以獲得實現簡化裝置、操作，而且可以獲得減少用于溶劑回收的能量，以及降低環境負荷等效果。本發明的實施方式以下文詳細的說明了本發明的實施方式。本發明是脂溶性生理活性物質的制備方法，該方法包括在后述特定的非離子型表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，將脂溶性生理活性物質提取到有機溶劑相中。在本發明的制備方法中，作為提取對象的脂溶性生理活性物質只要是微生物細胞中生產的、對有機溶劑具有親和性(脂溶性)，且對生物體有用的生理活性物質即可，沒有特殊的限制。其具體例子可列舉例如，輔酶QlO等輔酶Q類；維生素A、維生素D、維生素E或維生素K等維生素類；胡蘿卜素、蝦青素或巖藻黃質等類胡蘿卜素類；脂溶性多酚類、黃 酮類、麥角甾醇等甾醇類、α-硫辛酸、L-肉毒堿等。其中，輔酶QlO或蝦青素、麥角甾醇等是優選的，輔酶QlO是特別優選的。如上所述，輔酶QlO存在氧化型和還原型。本發明的輔酶QlO可以以氧化型輔酶Q10、還原型輔酶QlO中任一種為對象，但優選是含有還原型輔酶QlO的輔酶Q10，S卩，以單獨地還原型輔酶QlO，或者是還原型輔酶QlO與氧化型輔酶QlO的混合物這樣的輔酶QlO為對象。需要說明的是，在本說明書中，在僅記載輔酶QlO的情況下，表示不論氧化型輔酶QlO還是還原型輔酶Q10，且在兩種混合存在的情況下，表示混合物全體。用于本發明中的含有脂溶性生理活性物質的微生物只要是在菌體內產生作為目標的脂溶性生理活性物質或其前體的微生物，或本身就含有一定量以上的所述物質的微生物即可，可以不限制的使用細菌、酵母、霉菌中的任一種。其中，在菌體內產生所述脂溶性生理活性物質的微生物是優選的。具體而言，上述微生物可列舉例如農桿菌(Agrobacterium)屬、曲霉(Aspergillus)屬、乙酸桿菌(Acetobacter)屬、氨基桿菌(Aminobacter)屬、氣單抱菌屬(Agromonas)屬、嗜酸菌(Acidiphilium)屬、布勒擔抱酵母屬(Bulleromyces)屬、布勒擲孢酵母(Bullera)屬、短波單胞菌(Brevundimonas)屬、隱球菌(Cryptococcus)屬、Chionosphaera 屬、念珠菌(Candida)屬、Cerinosterus 屬、Exisophiala 屬、夕卜擔菌(Exobasidium)屬、Fellomyces 屬、線黑粉菌(Filobasidiella)屬、線黑粉酵母(Filobasidium)屬、地霉(Geotrichum)屬、果黑粉菌(Graphiola)屬、葡糖桿菌(Gluconobacter)屬、考克娃酵母(Kockovaella)屬、克氏擔抱酵母(Kurtzmanomyces)屬、Lalaria屬、白冬抱酵母(Leucosporidium)屬、軍團桿菌(Legionella)屬、甲基桿菌(Methylobacterium)屬、枝動桿菌(Mycoplana)屬、卵抱酵母(Oosporidium)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、Psedozyma 屬、副球菌(Paracoccus)屬、石座菌(Petromyces)屬、紅酵母(Rhodotorula)屬、紅冬抱酵母(Rhodosporidium)屬、根單胞菌(Rhizomonas)屬、紅菌(Rhodobium)屬、紅游動菌(Rhodoplanes)屬、紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬、紅細菌(Rhodobacter)屬、擲抱酵母(Sporobolomyces)屬、鎖擲酵母(Sporidiobolus)屬、Saitoella 屬、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬、銷氛醇單胞菌(Sphingomonas)屬、抱子絲菌(Sporotrichum)屬、Sympodiomycopsis 屬、Sterigmatosporidium 屬、外囊菌(Tapharina)屬、銀耳(Tremella)屬、毛孢子菌(Trichosporon)屬、腥黑粉菌(Tilletiaria)屬、腥黑穗病菌(Tilletia)屬、稗凝黑穗病菌(Tolyposporium)屬、Tilletiopsis 屬、黑粉菌(Ustilago)屬、Udeniomyces 屬、XanthophlIomyces 屬、黃色(無芽胞)桿菌(Xanthobacter)屬、擬青霉(Paecilomyces)屬、支頂抱(Acremonium)屬、Hyhomonus屬、根瘤菌(Rhizobium)屬、紅發夫酵母(Phaffia)屬、雨生紅球藻(Haematococcus)屬等微生物。從易于培養、生產性觀點出發，優選細菌或酵母，細菌中的非光合細菌是更優選的，進一步的，可列舉農桿菌(Agrobacterium)屬、葡糖桿菌(Gluconobacter)屬、甲基桿菌(Methylobacterium)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、副球菌(Paracoccus)屬、紅細菌(Rhodobacter)屬等，酵母中的裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬、SaitoelIa屬、紅發夫酵母(Phaffia)屬等為特別優選的例子。需要說明的是，在菌體外產生脂溶性生理活性物質，即在培養液中產生所述物質的微生物也包括在本發明中。作為產生脂溶性生理活性物質的微生物，不僅可以為上述微生物的野生型，還可 以優選使用例如，將與上述微生物的目的脂溶性生理活性物質的生物合成相關的基因的轉錄和翻譯活性、或表達蛋白質的酶活性進行了改良的變體或重組體。通過培養上述微生物，可以獲得含有輔酶QlO等脂溶性生理活性物質的微生物細胞。培養方法沒有特殊的限制，可以恰當的選擇適合作為對象的微生物，或適合作為目的的脂溶性生理活性物質生產的培養方法。培養時間也沒有特殊的限制，只要可以在微生物細胞中產生所需目標量的脂溶性生理活性物質即可。在上述情況下的脂溶性生理活性物質的產量(含量)根據目的沒有特殊的限制，就例如單位培養基中的脂溶性生理活性物質的含量而言，可以是例如O. 5 μ g/mL以上,優選I μ g/mL以上,更優選2 μ g/mL以上。在本發明的制備方法中，從上述含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞中提取脂溶性生理活性物質時，可以從微生物細胞中直接提取，也可以根據需要破碎上述微生物細胞成為微生物細胞破碎物，從所述破碎物中提取。破碎細胞有助于有效提取微生物細胞中產生、積累的脂溶性生理活性物質。關于細胞破碎處理，在細菌的情況下有時并非必需采用，對于使用酵母或霉菌細胞的情況，進行細胞破碎處理是特別優選的。在使用酵母或霉菌細胞的情況下，如果不破碎細胞，則對細胞中產生、積累的脂溶性生理活性物質的回收效率降低。不言而喻的是細胞破碎和提取也可以同時進行。此外，本發明中的“破碎”是指細胞壁等表面結構受到能夠達到提取目標脂溶性生理活性物質的程度的損傷即可，不一定要破壞微生物細胞，或使其碎片化。在本申請中，“微生物細胞或其微生物細胞破碎物的水性懸浮液”是指將微生物細胞或其微生物細胞破碎物懸浮在水、生理鹽水、緩沖液、培養基等水性溶劑中，優選懸浮在水和/或培養基中。作為上述細胞破碎的對象的微生物細胞的形態，可以是微生物細胞的水性懸浮液、培養液、將培養液濃縮而得到的物質、從培養液中采集的微生物細胞的濕菌體、將上述這些洗凈而得的物質、將濕菌體懸浮在溶劑(包括例如水、生理鹽水、緩沖液等)中而得的物質、干燥上述濕菌體后得到的干燥菌體、將干燥菌體懸浮在溶劑(包括例如水、生理鹽水、緩沖液等)中而得的物質等，優選微生物細胞的水性懸浮液、培養液、濃縮培養液或這些洗凈后的物質，根據操作性等方面，更優選的是培養液、濃縮培養液或其洗凈后而得到的物質。上述微生物細胞的破碎可以按任意順序進行下列一個或多個破碎方法。破碎方法可列舉例如物理處理、化學處理、酶處理，此外，加熱處理、自消化、滲透壓溶解、質壁分離(原形質溶解)等。上述物理處理可列舉例如使用高壓勻漿器、旋轉刃式勻漿器、超聲波勻漿器、弗氏壓碎器、球磨機等，或這些的組合。上述化學處理可列舉例如使用鹽酸、硫酸等酸(優選強酸)處理；使用氫氧化鈉或氫氧化鉀等堿(優選強堿)處理等，或這些的組合。上述酶處理可列舉例如使用溶菌酶、酵母破碎酶(zymolyase)、葡聚糖酶、novozyme、蛋白酶、纖維素酶等的方法，也可以恰當的使用這些的組合。上述加熱處理可列舉例如在60_140°C下處理30分鐘_3小時左右。 上述自消化可列舉例如通過乙酸乙酯等溶劑處理。此外，通過使用與細胞內的鹽濃度不同的溶液進行處理，也可以引起細胞的滲透壓溶解或原生質體溶解。但是，僅用這些方法破碎細胞的效果常會不充分，優選與上述物理處理、化學處理、酶處理、加熱處理、自消化等組合使用。在本發明中，作為提取、回收脂溶性生理活性物質的預處理的細胞破碎方法，可以是上述破碎方法中的,優選物理處理、化學處理(特別是酸處理,優選強酸(例如,水溶液中PKa在2. 5以下的酸)處理)或加熱處理是優選的，從破碎效率的角度，更優選物理處理。在本發明中，使含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞，或如上所述獲得的含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞的破碎物，以水性懸浮液的狀態，進行脂溶性生理活性物質的提取。在本發明中，制備微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液的方法沒有特殊的限制，可以是例如，培養產生脂溶性生理活性物質的微生物后的培養液、將所述培養液濃縮和/或洗凈而得到物質、將所述微生物細胞的濕菌體或干燥菌體懸浮在水或水性溶劑中而制備。或者可以通過上述方法破碎微生物細胞的水性懸浮液而制備。在本發明的制備方法中，作為提取對象的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中的菌體濃度，沒有特殊的限制，按菌體干重換算，通常是在1-25重量％的范圍，經濟地優選在10-20重量％的范圍內實施。在本發明的制備方法中，在特定的非離子型表面活性劑的存在下，將上述含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，通過液-液提取來提取有機溶劑相中的脂溶性生理活性物質，優選不需強制性油水分離的步驟，靜置混合液而油水分離，從分離的有機溶劑相中進行回收脂溶性生理活性物質。即，可以將從所述水性懸浮液和有機溶劑的混合液中提取脂溶性生理活性物質的步驟、靜置混合液而油水分離的步驟連續地進行，從而有效的獲得所述物質。在本發明的制備方法中，作為提取時使用的非離子型表面活性劑，使用甘油脂肪酸酯類、蔗糖脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑或烷基醚型表面活性劑是必要的。此外，可以組合使用2種以上的這些非離子型表面活性劑，也可以將這些非離子型表面活性劑與其他表面活性劑組合使用。作為上述甘油脂肪酸酯類，可列舉例如，脂肪酸的部分甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、聚甘油縮合蓖麻醇酸酯等。脂肪酸的部分甘油酯可列舉例如，單甘油單辛酸酯、單甘油單癸酸酯、單甘油二辛酸酯、單甘油二癸酸酯、單甘油二月桂酸酯、單甘油二豆蘧酸酯、單甘油二硬脂酸酯、單甘油二油酸酯、單甘油二芥酸酯、單甘油二山崳酸酯等單甘油脂肪酸酯；單甘油辛酸琥珀酸酯、單甘油硬脂酸檸檬酸酯、單甘油硬脂酸乙酸酯、單甘油硬脂酸琥珀酸酯、單甘油硬脂酸乳酸酯、單甘油硬脂酸二乙酰酒石酸酯、單甘油油酸檸檬酸酯等單甘油脂肪酸有機酸酯等。聚甘油脂肪酸酯可列舉例如，在以聚合度2至10的聚甘油為主要成分的聚甘油中，聚甘油的一個以上的羥基被碳原子數分別為6-22的脂肪酸酯化而得的聚甘油脂肪酸酯。具體而言，可列舉例如六甘油單辛酸酯、六甘油二辛酸酯、十甘油單辛酸酯、三甘油單月桂酸酯、四甘油單月桂酸酯、五甘油單月桂酸酯、六甘油單月桂酸酯、十甘油單月桂酸酯、三甘油單豆蘧酸酯、五甘油單豆蘧酸酯、五甘油三豆蘧酸酯、六甘油單豆蘧酸酯、十甘油單豆蘧酸酯、二甘油單油酸酯、三甘油單油酸酯、四甘油單油酸酯、五甘油單油酸酯、六甘油單油酸酯、十甘油單油酸酯、二甘油單硬脂酸酯、三甘油單硬脂酸酯、四甘油單硬脂酸酯、五甘油單硬脂酸酯、五甘油三硬脂酸酯、六甘油單硬脂酸酯、六甘油三硬脂酸酯、六甘油二硬脂酸酯、十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油三硬脂酸酯等。聚甘油縮合蓖麻醇酸酯可列舉例如，聚甘油的平均聚合度為2-10、聚蓖麻醇酸的平均縮合度(蓖麻醇酸的平均縮合數)為2-4的聚甘油縮合蓖麻醇酸酯，可列舉例如四甘油縮合蓖麻醇酸酯、五甘油縮 合蓖麻醇酸酯、六甘油縮合蓖麻醇酸酯等。作為上述蔗糖脂肪酸酯類，可列舉蔗糖的一個以上的羥基被碳原子數分別為6-18，優選6-12的脂肪酸酯化而得的蔗糖脂肪酸酯。具體而言，可列舉蔗糖棕櫚酸酯、蔗糖硬脂酸酯等。作為上述脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，可列舉脫水山梨糖醇類的一個以上的羥基被碳原子數分別為6-18，優選6-12的脂肪酸酯化而得的脫水山梨糖醇脂肪酸酯。具體而言，可列舉脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單油酸酯等。作為上述聚醚多元醇型表面活性劑，可列舉例如株式會社ADEKA生產的AdecanolLG 系列(LG-109、LG-126、LG-294、LG-295S、LG-299、LG-805)等。作為上述聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑，優選是在碳原子數為12-22的脂肪族醇上聚合添加氧化乙烯而獲得的表面活性劑，可列舉例如花王株式會公司生產的Emulgen系列(103、104P、105、106、108、109P、120、123P、147、150、210、220、306P、320P、350、404、408、409PV、420、430、705、707、709、1108)等。作為上述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑，可以是在聚丙二醇兩端添加氧化乙烯而獲得的嵌段共聚物，除在氧化乙烯(EO)鏈之間具有氧化丙烯(PO)鏈的共聚物(EOxPOyEOz)之外，還包括反向聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物等。作為上述在氧化乙烯(EO)鏈之間具有氧化丙烯(PO)鏈的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列舉例如株式會社ADEKA生產的普朗尼克(Pluronic)L系列(L_31、L-34、L-44、L-61、L-62、L-64、L-71、L-72、L-10U L-121)、普朗尼克 P 系列(P-65、P-84、P-85、P-103、P-105、P-123)、普朗尼克F系列(F-68、F-108、F-127)或B ASF公司生產的普朗尼克PE系列等。作為上述反向聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列舉例如株式會社ADEKA生產的普朗尼克R系列(25R-l、25R-2、17R-2、17R-3、17R-4)或B ASF公司生產的普朗尼克RPE
系列等。作為上述乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，可列舉例如，株式會社ADEKA生產的普朗尼克TR系列(TR-701、TR-702、TR-704)或B ASF公司生產的Tetronic系列(poloxamine)等。進一步的，與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑同樣地，在本發明的制備方法中，還可以使用具有與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑相似的結構、在2個氧化乙烯(EO)鏈之間具有氧化丁烯(B O)鏈的三嵌段共聚物型表面活性劑(E0x B OyEO z )。在上述這些聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(及其類似物)中，優 選質量平均分子量在500-8000范圍內的表面活性劑，更優選質量平均分子量在1000-4000范圍內的表面活性劑。作為上述烷基醚型非離子型表面活性劑，可列舉例如株式會社ADEKA生產的Adekatol L B 系列(L B -53 B、L B -720、L B -820、L B -54C、L B -83、L B -93、LB -103、L B -1220、L B -1520)、Adekatol LA 系列(LA-675 B、LA-775、LA-875、LA-975、LA-1275)等。不言而喻的是，可以組合使用2種以上的、本文中所示的非離子型表面活性劑。在上述非離子型表面活性劑中，優選至少使用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑。在此情況下，可以單獨使用I種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑，特別優選的是組合使用2種以上的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑，或者組合使用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑和其以外的非離子型表面活性劑。作為與聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑組合使用的非離子型表面活性劑，可列舉上述的非離子型表面活性劑，即，甘油脂肪酸酯類、蔗糖脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑、烷基醚型表面活性劑。其中，優選是2種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑的組合，或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑與蔗糖脂肪酸酯類的組合，更優選是2種聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑的組合，特別優選是在氧化乙烯(EO)鏈之間具有氧化丙烯(PO)鏈的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物與乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物的組合。在聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑與其以外的非離子型表面活性劑的組合情況下，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑的使用量優選多于其以外的非離子型表面活性劑，例如，優選相對于所使用的非離子型表面活性劑的總量，其用量是50重量％以上，更優選60重量％以上，更優選75重量％以上。在液-液提取操作中使用這樣的表面活性劑，可以在提取時，使含有作為目標物質的脂溶性生理活性物質的分散相在作為提取溶劑的有機溶劑中細微分散化。其結果是，提高了提取溶劑與脂溶性生理活性物質的接觸效率，促進了脂溶性生理活性物質向有機溶劑相移動。另一方面，一直以來，當在液-液提取中使用表面活性劑時，由于因界面效果而使得水相與有機溶劑相的親和力增加，易于發生均相化，常有水相與有機溶劑相的分離需要較長時間，或者即使花費了時間也不能分離的情況，需要根據情況通過離心分離等操作進行強制性的分離。因此，迄今為止，在一般的液-液提取中，提取步驟中使用表面活性劑被認為不是優選的。但是，本發明首次發現當使用有機溶劑，從含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中，液-液提取有機溶劑相中的脂溶性生理活性物質時，使上述特定的表面活性劑，特別是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑在提取時共存，不僅可以提高有機溶劑與水性懸浮液的親和性，而且在混合、靜置后，可以快速進行油水分離。因此，用本發明的制備方法，可以穩定且高收率地回收溶解了作為目標物質的脂溶性生理活性物質的有機溶劑相。
此外，在本發明的制備方法中，當使用糊狀和薄片狀的非離子型表面活性劑時，優選使用用于溶解表面活性劑的溶劑。此外，當使用液態表面活性劑時，在其粘性高時優選使用溶劑。此時使用的溶劑，優選是水或醇類，可以分別單獨使用，也可以以水和醇的混合溶劑的形式使用。在本發明的制備方法中，就提取操作時上述特定的非離子型表面活性劑的使用量而言，以相對于微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液的濃度表示，優選是0.01重量％以上，更優選是在O. 01-10重量％的范圍內，更優選是在O. 1-5重量％的范圍內，特別優選是在O. 5-5重量％的范圍內。當上述表面活性劑的添加量在O. 01重量％以下時,不能促進有機溶劑中的水性懸浮液的細微分散化，不能保證充分的提取效率。另一方面，當上述表面活性劑的添加量超過10重量％時，由于將有機溶劑與水性懸浮液的親和性提高至必要以上，因此，雖然促進了有機溶劑中的水性懸浮液的細微分散化，但靜置處于混合狀態的有機溶劑與水性懸浮液時的油水分離性惡化。在本發明的制備方法中，作為上述在特定非離子型表面活性劑的存在下進行提取的方法沒有特殊的限制，只要是在提取時可以在水性懸浮液與有機溶劑的混合液中共存設定量的表面活性劑的方法即可，沒有特殊的限制，可列舉在提取前向微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中添加表面活性劑的方法；向提取時使用的有機溶劑中添加表面活性劑的方法；向有機溶劑與水性懸浮液的混合液中添加表面活性劑的方法；此外，還可以是在制備微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液之時或之前預先添加表面活性劑的方法；或直接在提取時使用破碎微生物細胞時使用的表面活性劑的方法等。在本發明的制備方法中，作為提取時使用的有機溶劑，可列舉烴類、脂肪酸酯類、醚類、醇類、脂肪酸類、酮類、氮化合物類(包括腈類、酰胺類)、含硫化合物類等。作為烴類，沒有特殊的限制，可列舉例如脂肪族烴、芳香族烴、鹵代烴等。其中優選脂肪族烴、芳香族烴，更優選脂肪族烴。作為脂肪族烴，不論環狀或非環狀，不論飽和或不飽和，都沒有特殊的限制，一般優選使用飽和的。使用的碳原子數一般是3-20個，優選碳原子數5-12個，更優選碳原子數5-8個。具體例子可列舉例如丙烷、丁烷、異丁烷、戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、庚烷異構體(例如，2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷)、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5_三甲基己燒、癸燒、十二燒、2-戍烯、1-己烯、1-庚烯、1-辛烯、1-壬烯、1-癸烯、環戍燒、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、P-薄荷烷、環己烯等。優選戊烷、2-甲基丁烷、己燒、2-甲基戍燒、2，2-二甲基丁燒、2，3-二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3-二甲基戊烷、2，4-二甲基戊烷、辛烷、2，2，3-三甲基戊烷、異辛烷、壬烷、2，2，5_三甲基己烷、癸烷、十二烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷、P-薄荷烷等。更優選戊烷、2-甲基丁烷、己烷、2-甲基戊烷、2，2-二甲基丁烷、2，3-二甲基丁烷、庚烷、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戍燒、2，4- 二甲基戍燒、辛燒、2，2, 3- 二甲基戍燒、異辛烷、環戊烷、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷等；更優選戊烷、己烷、環己烷、甲基環己烷等。作為芳香族烴，沒有特殊的限制，一般使用碳原子數6-20，優選碳原子數6-12，更優選碳原子數7-10的芳香族烴。具體例子可列舉例如苯、甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、異丙基苯、三甲基苯、四氫化萘、丁基苯、對異丙基苯甲燒、環己基苯、二乙基苯、戍基苯、二戍基苯、十二燒基苯、苯乙烯等。優選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、乙基苯、異丙基苯、三甲基苯、四氫化萘、丁基苯、對異丙基苯甲燒、環己基苯、二乙基苯、戊基苯等。更優選甲苯、二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對二甲苯、異丙基苯、四氫化萘等。最優選是異丙基苯。作為鹵代烴，不論環狀或非環狀，也不論飽和或不飽和，都沒有特殊的限制，一般優選使用非環狀的。更優選的鹵代烴是氯代烴、氟代烴，更優選的是氯代烴。此外，適合使用 的是碳原子數是1-6個，優選碳原子數1-4個，更優選碳原子數1-2個。具體例子可列舉例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2_ 二氯乙烷、1，I,1-三氯乙烷、1，1,2-三氯乙烷、1，I, 1,2-四氯乙烷、1，1,2, 2-四氯乙烷、五氯乙烷、六氯乙烷、1，1-二氯乙烯、I, 2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、1，2-二氯丙烷、1，2，3-三氯丙烷、氯苯，I, I, I, 2-四氟乙烷等。優選是二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1,2-二氯乙烷、1，I,1-三氯乙烷、1，1,2-三氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1,2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，I, I, 2-四氟乙烷等。更優選是二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯、氯苯、1，I, 1,2-四氟乙烷等。作為脂肪酸酯類，沒有特殊的限制，可列舉例如丙酸酯、乙酸酯、甲酸酯等。優選是乙酸酯、甲酸酯，更優選是乙酸酯。酯基沒有特殊的限制，一般使用碳原子數1-8個的烷基酯、碳原子數7-12個的芳烷基酯，優選碳原子數1-6個的烷基酯，更優選碳原子數1-4個的燒基酷。丙酸酯的具體例子可列舉例如丙酸甲酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯、丙酸異戊酯等。優選丙酸乙酯等。乙酸酯的具體例子可列舉例如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲-丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲-己酯、乙酸環己酯、乙酸芐酯等。優選乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲-丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯、乙酸仲-己酯、乙酸環己酯等。更優選乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯等，最優選乙酸乙酯。甲酸酯的具體例子可列舉例如甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸仲-丁酯、甲酸戊酯等。優選甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、甲酸戊酯等。最優選甲酸乙酯。作為醚類，不論環狀或非環狀，也不論飽和或不飽和，都沒有特殊的限制，一般優選使用飽和的。一般使用碳原子數3-20，優選碳原子數4-12，更優選碳原子數為4-8個的
醚。具體例子可列舉例如二乙基醚、甲基叔-丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、二己基醚、乙基乙烯基醚、丁基乙烯基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二烷、呋喃、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚、乙二醇單丁基醚等。優選二乙基醚、甲基叔-丁基醚、二丙基醚、二異丙基醚、二丁基醚、二己基醚、苯甲醚、苯乙醚、丁基苯基醚、甲氧基甲苯、二P惡烷、2-甲基呋喃、四氫呋喃、四氫吡喃、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、乙二醇二丁基醚、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚等。更優選二乙基醚、甲基叔-丁基醚、苯甲醚、二P惡烷、四氫呋喃、乙二醇單甲基醚、乙二醇單乙基醚等。更優選二乙基醚、甲基叔-丁基醚、苯甲醚等，最優選甲基叔-丁基醚。作為醇類，不論環狀或非環狀，也不論飽和或不飽和，都沒有特殊的限制，一般優選使用飽和的。使用的碳原子數一般是1-20個，優選碳原子數1-12個，更優選碳原子數
1-6個。其中，碳原子數1-5個的一元醇、碳原子數2-5個的二元醇、碳原子數為3個的三元 醇是優選的。作為這些醇類的具體例子，可列舉例如，甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、
2-丁醇、異丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔-戊醇、
3-甲基-2-丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1- 丁醇、
1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、1-十二烷醇、烯丙醇、炔丙醇、芐醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等一元醇；1，2-乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1，4- 丁二醇、2，3- 丁二醇、1，5-戊二醇等二元醇；甘油等三元醇。作為一元醇，優選是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、2-乙基-1-己醇、1-壬醇、1-癸醇、1-1^一烷醇、1-十二烷醇、芐醇、環己醇、1-甲基環己醇、2-甲基環己醇、3-甲基環己醇、4-甲基環己醇等。更優選的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1- 丁醇、2- 丁醇、異丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇、1-己醇、2-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-丁醇、環己醇等。更優選的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、
2-丁醇、異丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔-戊醇、
3-甲基-2-丁醇、新戊醇等。特別優選的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇等，最優選是2-丙醇。作為二元醇，優選是1,2-乙二醇、1，2_丙二醇、1，3_丙二醇等，最優選是1，2_乙
二醇。三元醇優選是甘油。脂肪酸類可列舉例如甲酸、乙酸、丙酸等。優選是甲酸、乙酸，最優選是乙酸。酮類沒有特殊的限制，適合使用的是碳原子數3-6個。具體的例子可列舉例如丙酮、甲基乙酮、甲基丁酮、甲基異丁酮等。優選是丙酮、甲基乙酮，最優選是丙酮。作為腈類，不論環狀或非環狀，也不論飽和或不飽和，都沒有特殊的限制，一般優選使用飽和的。使用的碳原子數一般是2-20個，優選碳原子數2-12個，更優選碳原子數2-8 個。具體的例子可列舉例如乙腈、丙腈、丙二腈、丁腈、異丁腈、丁二腈、戊腈、戊二腈、己腈、庚腈、辛腈、i^一烷腈、十二烷腈、十三烷腈、十五烷腈、十八烷腈、氯乙腈、溴乙腈、氯丙腈、溴丙腈、甲氧基乙腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、甲苯基腈、苯基腈、氯苯基腈、溴苯基腈、氰基安息香酸、硝基苯基腈、茴香腈、酞菁、溴甲苯基腈、甲氰基安息香酸、甲氧基苯基臆、乙酸基苯基臆、蔡甲臆、聯苯臆、苯丙臆、苯丁臆、甲基苯基乙臆、_■苯基乙臆、蔡基乙腈、硝基苯基乙腈、氯苯乙腈、環丙腈、環己腈、環庚腈、苯基環己腈、甲苯基環己腈等。優選是乙腈、丙腈、丁二腈、丁腈、異丁腈、戊腈、氰基乙酸甲酯、氰基乙酸乙酯、芐臆、節基臆、氯丙臆，更優選是乙臆、丙臆、丁臆、異丁臆，最優選是乙臆。作為除了腈類以外的含氮化合物類，可列舉例如甲酰胺、N-甲基甲酰胺、N，N_ 二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺類，或硝基甲烷、三乙胺、吡啶等。含硫化合物類可列舉例如二甲亞砜、環丁砜等。上述有機溶劑中，優選考慮沸點、熔點、粘性等性質來進行選擇。例如，就沸點而言，從可以進行為了提高溶解度的恰當加熱，并且容易進行從濕體干燥去除溶劑或晶析濾液等中回收溶劑的觀點考慮，沸點優選是在I個大氣壓下，約30-150°C的范圍；就熔點而 言，從在室溫操作時和在室溫以下冷卻時難以凝固的觀點考慮，熔點是約20°C以下，優選約10°C以下，更優選約0°C以下；就粘性而言，優選例如在20°C時約IOCp以下等較低的粘性。在上述有機溶劑中，在從微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液提取回收脂溶性生理活性物質的目的中，從進行采用2相系統的液-液提取的觀點考慮，優選使用疏水性有機溶劑或含有疏水性有機溶劑的溶劑作為提取溶劑。作為在此情況下使用的疏水性有機溶劑，沒有特殊的限制，可以使用上述有機溶劑中的完全不與水混溶的、形成2相系統的疏水性有機溶劑，優選使用烴類、脂肪酸酯類、醚類等疏水性有機溶劑，更優選烴類，更優選脂肪族烴類。在脂肪族烴類中，適合使用碳原子數5-8的烴。作為上述碳原子數5-8的脂肪族烴類的具體例子，可列舉例如戊烷、2-甲基丁燒、己燒、2-甲基戍燒、2，2- 二甲基丁燒、2，3- 二甲基丁燒、庚燒、2-甲基己燒、3-甲基己燒、2，3- 二甲基戍燒、2，4- 二甲基戍燒、辛燒、2，2, 3- 二甲基戍燒、異辛燒、環戍燒、甲基環戊烷、環己烷、甲基環己烷、乙基環己烷等。特別優選的是己烷、庚烷、甲基環己烷，最優選的是己燒、庚燒。在本發明的制備方法中，在表面活性劑的存在下進行提取，可以提高微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液與上述疏水性有機溶劑的親和性，獲得充分的提取效率；此外，作為提取時所用的有機溶劑，在上述疏水性有機溶劑的基礎上，輔助性地組合使用親水性有機溶劑，可以進一步地促進有機溶劑中的水性懸浮液更加微細化、提高靜置時的高油水分離的穩定性，是更加優選的。在本發明的制備方法中，作為與疏水性有機溶劑組合使用的親水性有機溶劑，沒有特殊的限制，可以使用上述有機溶劑中的親水性的溶劑，優選是醇類。在醇類中，適合使用碳原子數1-5個的一元醇。其具體例子是例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、叔-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、2-甲基-1- 丁醇、異戊醇、叔-戊醇、3-甲基-2- 丁醇、新戊醇等。特別優選的是甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇，最優選的是2-丙醇。在本發明的制備方法中，作為提取溶劑使用的疏水性有機溶劑的使用量，沒有特殊的限制，相對于提取體系的總溶液(微生物細胞或該細胞破碎物的水性懸浮液、提取溶劑、非離子型表面活性劑等的混合溶液)體積，以提取時的濃度表示，優選在25-80體積％的范圍內使用，更優選在50-75體積％的范圍內使用。此外，上述的組合使用親水性有機溶劑時的親水性有機溶劑的使用量只要在可以維持2相體系的范圍內即可，沒有特殊的限制，相對于總溶液體積，優選在O. 1-50體積％的范圍內使用，更優選在O. 1-10體積％的范圍內使用，更優選在O. 2-5體積％的范圍內使用。就親水性有機溶劑的使用量而言，即使是相對于總溶液的體積在O. 2-2體積％這樣少的量，也可以在本發明中發揮其效果。在本發明的制備方法中，當組合使用親水性有機溶劑和疏水性有機溶劑時，對各種溶劑的添加方法沒有特殊的限制，可以將親水性有機溶劑和疏水性有機溶劑進行恰當混合，然后作為提取溶劑使用，也可以在向微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中添加親水性有機溶劑，然后再添加疏水性有機溶劑，也可以相反的操作。在本發明的制備方法中，提取時的溫度沒有特殊的限制，一般可以在0_60°C，優選20-50°C的范圍內實施。作為提取方法，可以用分批提取、連續提取的任一種方法進行，在工業上，連續提取在生產性方面優選的，連續提取中的逆流多級提取是特別優選的。分批提取時的攪拌時 間沒有特殊的限制，一般是5分鐘以上，連續提取時的平均滯留時間沒有特殊的限制，一般是10分鐘以上。在本發明的制備方法中，通常，在實施了將微生物細胞或該細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑以及上述表面活性劑混合設定時間而提取后，靜置這些的混合液，使其分離為水相和包含脂溶性生理活性物質的有機溶劑相，在油水界面的分離非常慢的情況下，可以使用離心機、連續離心機、液體旋風分離器(cyclone)等強制性分離。采用上述本發明的制備方法，可以高效提取包含在微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中的脂溶性生理活性物質。本發明的制備法中的提取率通常是70%以上，更優選80%以上，更優選90%以上。在本文中所述的提取率是指，相對于提取前的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液中所含的脂溶性生理活性物質的總量，提取操作結束后的提取液中所含的脂溶性生理活性物質的量的比例，具體而言，可如下文所述實施例而求得。在本發明的制備方法中，通過上述操作，可以從含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物中，通過將脂溶性生理活性物質提取到有機溶劑中而分離、回收脂溶性生理活性物質。所獲得的含脂溶性生理活性物質的有機溶劑溶液可以直接利用，也可以繼續施加常規純化方法，進一步高度純化。例如，也可以用活性炭或白陶土等吸附劑純化后，去除有機溶劑，作為含脂溶性生理活性物質的提取物或脂溶性生理活性物質的純化物。此外，也可以施加通過常用的柱層析或液-液分配、其他的水或有機溶劑洗滌等純化處理。需要說明的是，這些純化處理可以單獨進行，或多種組合進行。此外，必要時，還可以增加皂化、氧化、還原、其他合成反應處理等步驟。此外，還可以用結晶析出操作等，獲得作為目標的脂溶性生理活性物質的晶體。例如，在以輔酶QlO作為目標脂溶性生理活性物質的情況下，可以通過本發明的制備方法，從含有輔酶QlO的微生物細胞或其微生物細胞破碎物中，將輔酶QlO提取到有機溶劑中，將獲得的含有輔酶QlO的提取液，用本身公知的方法純化，獲得輔酶Q10。例如，可以根據期望，使用活性炭或白陶土等吸附劑處理或柱層析等進行純化，在其前后，根據需要進行氧化或還原處理，使用析出結晶的操作，獲得高純度輔酶QlO的結晶。作為本發明的其他形態，列舉了脂溶性生理活性物質的純化方法，該方法包括在選自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑、蔗糖脂肪酸酯類、甘油脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑和烷基醚型表面活性劑中的至少一種非離子型表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或其微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，提取脂溶性生理活性物質。各定義或條件等與上述列舉的相同。
實施例下文通過實施例更具體的說明本發明，但本發明不限于這些實施例。各實施例中的提取率如下計算。向進行提取前的含有輔酶QlO的微生物細胞破碎液ImL中，加入甲醇-氯仿(3:1)混合液至總量50mL，在25°C下攪拌30分鐘后，固液分離菌體來源的固體物質，在下列HPLC條件下測量所獲得的液層部分的輔酶Q濃度，計算包含 在微生物細胞破碎液中的提取對象輔酶Q的量。同樣的，在下列HPLC條件下測量提取操作后的提取液中的輔酶Q濃度，計算提取的輔酶Q的量，通過下式計算提取率。提取率(%)=提取液中所含的輔酶Q的重量/提取前的微生物細胞破碎液中所含的輔酶Q的重量X 100(HPLC分析條件)柱YMC-Pack4.6 X 250mm (YMC. Co.，LTD.生產)流動相甲醇/正己烷=85/15流速ImL/分檢測UV275nm(實施例1)使用IOL培養基(蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麥芽提取物3g/L、葡萄糖20g/L、pH6. O)，將產生輔酶 QlO 的 Saitoella complicata IF010748 株在 25°C下好氧培養 72 小時。通過壓力式勻漿器(Rannie公司生產)，在破碎壓力SOMpa下破碎所獲得的包含微生物菌體的培養液2次，制備含有輔酶QlO的微生物細胞破碎液。向獲得的微生物細胞破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62，ADEKA公司生產)至3. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與己烷70體積份混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，相對于混合液的總液量，提取殘渣(下層的包含源自微生物的固體物質的水相部分)的體積比是O. 37。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為90. 8%。(實施例2)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62，ADEKA公司生產)至1. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與己烷69體積份、2-丙醇I體積份混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣相對于總液量的體積比是O. 33。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為92. 5%。(實施例3)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，加入聚醚多元醇型表面活性劑(Adecanol LG-126, ADEKA公司生產)至3. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 39。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為79. 5%。(實施例4)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，加入烷基醚型表面活性劑(AdekatolLA-775，ADEKA公司生產)至3. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 35。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為85. 3%。(實施例5)
向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，加入烷基醚型表面活性劑(AdekatolLA-1275，ADEKA公司生產)至O. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，然后通過離心機實施強制性油水分離。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為71. 3%ο(實施例6)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，分別加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62，ADEKA公司生產)至1. 3重量％、蔗糖硬脂酸酯(S-1670，
三菱化學食品公司生產)至O. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 32。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為84. 6%。(實施例7)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，分別加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62，ADEKA公司生產)至1. 3重量％、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物型表面活性劑(普朗尼克TR-702，ADEKA公司生產)至O. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 30。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為83. 0%。(實施例8)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中，分別加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62，ADEKA公司生產)至1. 3重量％、乙二胺型聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物型表面活性劑(普朗尼克TR-701，ADEKA公司生產)至O. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 31。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為89. 9%。(實施例9)使用IOL培養基(蛋白胨5g/L、酵母提取物3g/L、麥芽提取物3g/L、葡萄糖20g/L、pH6. O)，將產生麥角留醇的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) IF00309株在28°C下好氧培養72小時。通過壓力式勻漿器(Rannie公司生產)，在破碎壓力80Mpa下破碎所獲得的微生物菌體2次，制備含有麥角留醇的微生物細胞破碎液。向獲得的微生物細胞破碎液中，加入聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑(普朗尼克L-62、ADEKA公司生產)至3. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 35，收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，麥角留醇的提取率是89. 1%。(比較例I)將與實施例1相同制備的菌體破碎液30體積份和己烷70體積份混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 35，收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為60. 2%ο(比較例2)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中加入溶血卵磷脂(Degussa公司生產)至O. 7重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，由于油水分離沒有進展，因此通過離心機實施強制性油水分離。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為62. 2%。(比較例3)向與實施例1相同制備的菌體破碎液中加入聚乙烯醇(和光純藥公司生產)至3. 3重量％的濃度，將30體積份的上述混合物與70體積份己烷混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 35，收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為61. 9%。(參考例)將按與實施例1相同制備的菌體破碎液30體積份、己烷52體積份、2-丙醇18體積份的比例混合，在45°C下進行60分鐘分批提取操作。在混合設定的時間后，靜置，確認了有快速的油水分離，提取殘渣與總液量的體積比是O. 48，結果是所使用的提取溶劑向水相中移動的量非常多。收集分離的己烷相作為提取液，進行HPLC分析，輔酶QlO的提取率為91. 5% 。表I中顯示了實施例1-9、比較例1-3和參考例中的加入條件、脂溶性生理活性物質的提取率和提取殘渣的體積比的結果。
權利要求
1.脂溶性生理活性物質的制備方法，該方法包括在選自聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑、蔗糖脂肪酸酯類、甘油脂肪酸酯類、脫水山梨糖醇脂肪酸酯類、聚醚多元醇型表面活性劑、聚氧乙烯烷基醚型表面活性劑和烷基醚型表面活性劑中的至少一種非離子型表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或其微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，提取脂溶性生理活性物質。
2.權利要求1記載的制備方法，其中，脂溶性生理活性物質是輔酶Q10。
3.權利要求2記載的制備方法，其中，輔酶QlO是還原型輔酶Q10，或者是還原型輔酶 QlO和氧化型輔酶QlO的混合物。
4.權利要求1-3中任一項記載的制備方法，其中，非離子型表面活性劑至少是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物型表面活性劑。
5.權利要求1-4中任一項記載的制備方法，其中，相對于微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液，非離子型表面活性劑的添加量為O. 01重量％以上。
6.權利要求1-5中任一項記載的制備方法，其中，有機溶劑是疏水性有機溶劑。
7.權利要求6記載的制備方法，其中，還組合使用了親水性有機溶劑。
8.權利要求1-7中任一項記載的制備方法，其中，提取是連續提取。
全文摘要
本發明提供了脂溶性生理活性物質的制備方法，該方法包括在特定的表面活性劑的存在下，將含有脂溶性生理活性物質的微生物細胞或微生物細胞破碎物的水性懸浮液與有機溶劑混合，將脂溶性生理活性物質提取到有機溶劑相中。通過所述制備方法，可以不使用特殊的脫水、干燥設備，并且可以在不存在因溶劑與菌體成分的分離性惡化而導致的收率降低的情況下而進行提取，可以有效的工業生產。
文檔編號C12P7/66GK103025881SQ201180035870
公開日2013年4月3日 申請日期2011年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者金谷健登, 鈴木康之, 神田彰久, 橫江和哉 申請人:株式會社鐘化