使用分析物和過程控制信號的單次讀取確定而鑒定含分析物的樣品的方法和設備的制作方法

專利名稱：使用分析物和過程控制信號的單次讀取確定而鑒定含分析物的樣品的方法和設備的制作方法
使用分析物和過程控制信號的單次讀取確定而鑒定含分析物的樣品的方法和設備
相關申請案
本申請要求于2010年6月30日提交的美國臨時申請No. 61/360，296的權益。此在先申請的全部公開內容據此以引用方式并入。發明領域
本發明涉及關于診斷測定法的生物技術子領域。更具體地講，本發明涉及在包括內控的測定法中進行分析物檢測，其中使用不同的探針檢測分析物和內控。在一個高度優選的實施方案中，使用具有相同可檢測標記物的不同雜交探針檢測單一混合物中的核酸分析物。_4] 發明背景
檢測分析物(如核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物等)的存在的現代測定法依賴于使用陽性對照來確認過程可靠性。例如，測定法可能力圖使用核酸擴增和隨后通過探針雜交和檢測來測定靶核酸。經過擴增的樣品可包含與分析物核酸共擴增的內控(下文稱為“1C”) 核酸。擴增產物可有利地具有可使用不同的雜交探針檢測的非相同序列。檢測IC擴增產物將確認測定程序的擴增和檢測組成部分的完整性。該信息在未能檢出分析物擴增產物時很有用。在這種情況下檢出IC信號可驗證分析物陰性結果。分析物擴增子及IC擴增子的特異性雜交探針通常通過它們所具有的標記物或通過空間分離而區分。
包括內部過程控制的基于探針的測定法(包括蛋白和核酸測定法)對于IC和分析物的檢測通常有以下區別之一 (I)獨立于分析物來檢測IC ;以及⑵獨立于分析物加IC 的組合來檢測分析物。美國專利No. 6，586，234使用檢測IC和分析物核酸的兩次讀取系統闡述了這兩種可能性。當獨立于IC加分析物的組合來檢測分析物核酸時，可針對所產生的分析物雜交信號落在陽性評分所需的閾值截止值之下的樣品而評估后者的雜交信號。例如，低于分析物檢測的閾值截止值的信號作為另外一種選擇可表明不存在分析物或測定法失效。如果在代表IC加分析物的組合的第二次讀取中檢出信號，則將該結果解釋為驗證分析物陰性結果。換句話講，檢出IC加分析物的足夠信號表明必須已經檢出1C，并因此可驗證分析物陰性結果。應當顯而易見的是，這樣的系統要獲得成功取決于從代表IC和分析物的雜交信號的組合中分離分析物雜交信號的能力。
在分析物檢測領域中遇到的一個難題涉及當不同探針(例如，流體連通且在溶液中游離而非固定的不同探針)之間無空間分離而進行檢測時，分析多重反應所需的不同標記物的數量。這可以在共擴增IC核酸和兩種不同的靶核酸的測定法的背景下加以理解。通過具有一個標記物的IC探針，用于檢測其余兩個靶標的一套探針可用第二標記物進行標記。第二標記物的陽性檢測信號表明存在兩種分析物之一，但不能將一者與另一者進行區分。隨著分析物數量的增加，解析反應性物質所需的再次測試的次數也相似地增加。換句話說，在陽性評分多重測定法中用于鑒定反應性物質的再次測試負擔是不利的，尤其是當陽性樣品所占的分數變得很大時。
本發明解決了對簡化的分析物鑒定系統的需求。
發明概沭
在一個方面，本發明涉及通過過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的設備。一般而言，本發明的設備包括(a)被構造成容納樣品的支架；(b)被布置成當樣品容納在支架中時接收來自樣品的光學信號的光學檢測機構；以及(C)與光學檢測機構通信的處理器(如計算機)，該處理器被編程為執行確定多種情形中的哪一種情形適用的步驟。根據本發明，除了內控外，樣品進一步包含在接觸內控后生成內控信號的內控探針； 如果第一分析物存在于樣品中，則在接觸第一分析物后生成第一分析物信號的第一分析物探針；以及任選地如果第二分析物存在于樣品中，則在接觸第二分析物后生成第二分析物信號的第二分析物探針。進一步根據本發明，光學檢測機構被構造成測量內控探針和分析物探針所產生的組合信號而不用區分內控信號與分析物信號。光學檢測機構任選地被構造成測量第二分析物探針所產生的第二分析物信號。再進一步根據本發明，處理器被編程為確定以下哪一情形適用(i)樣品不含第一分析物，條件是組合信號的幅度小于第一分析物截止值并且(I)組合信號的幅度大于或等于有效性截止值或者(2)第二分析物探針包含在樣品中，光學檢測機構被構造成測量第二分析物信號，且第二分析物信號的幅度大于或等于第二分析物截止值，從而確立樣品包含第二分析物；(ii)樣品包含第一分析物，條件是組合信號的幅度大于或等于第一分析物截止值；以及(iii)無法確定樣品是否包含第一分析物，條件是組合信號的幅度小于第一分析物截止值且小于有效性截止值，并且如果第二分析物探針包含在反應混合物中，且光學檢測機構被構造成測量第二分析物信號，第二分析物信號小于第二分析物截止值。一般來講，第一分析物截止值的信號量大于有效性截止值的信號量，并且內控信號的可檢測最大值不能超過第一分析物截止值。
根據通過過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的一般描述的設備的第一高度優選實施方案，光學檢測機構被構造成測量通過第二分析物探針生成的第二分析物信號。這樣的話，優選地，支架基本上不改變光學檢測機構測量組合信號的運行過程中的溫度；第一分析物、第二分析物和內控各自都包含核酸；且光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號。作為另外一種選擇，優選地，光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號；并且設備進一步包括輸出裝置，其產生由處理器執行的確定步驟的有形記錄(如，打印的記錄或存儲在計算機可讀介質上的電子記錄)。更優選地，支架基本上不改變光學檢測機構測量組合信號的運行過程中的溫度；第一分析物、第二分析物和內控各自都包含核酸；且光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號。這樣的話，優選地，樣品在光學檢測機構測量組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。這可(例如)涉及使用溫控培養箱。作為另外一種選擇，優選地，光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。更優選地，檢測器為光度計。
根據通過過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的一般描述的設備的第二高度優選實施方案，光學檢測機構不被構造成測量通過第二分析物探針生成的第二分析物信號。這樣的話，優選地，支架基本上不改變光學檢測機構測量組合信號的運行過程中的溫度；第一分析物和內控各自都包含核酸；且光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號。作為另外一種選擇，光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號；并且設備進一步包括輸出裝置，其產生由處理器執行的確定步驟的有形記錄。更優選地，支架基本上不改變光學檢測機構測量組合信號的運行過程中的溫度；第一分析物和內控各自都包含核酸；且光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號。這樣的話，優選地，樣品在光學檢測機構測量組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。 作為另外一種選擇，優選地，光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。更優選地， 檢測器為光度計。
除了一般描述的設備的前述高度優選實施方案外，還存在許多可用來改變本發明的設備的一般優選的修改。在一個一般優選的實施方案中，樣品容納在反應容器中，而支架被構造成容納多個反應容器。更優選地，反應容器選自試管和多孔板的孔。在另一個一般優選的實施方案中，光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。更優選地，檢測器為光度計。在又一個一般優選的實施方案中，處理器為包含軟件查表的計算機(如獨立計算機)。 在再一個一般優選的實施方案中，支架基本上不改變光學檢測機構測量組合信號的運行過程中的溫度；第一分析物、第二分析物和內控各自都包含核酸；且光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號。在另一個一般優選的實施方案中，樣品在光學檢測機構測量組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。更優選地，其中支架容納在溫控培養箱內。在另一個一般優選的實施方案中，光學檢測機構不測量第一分析物信號，也不測量內控信號；并且設備進一步包括輸出裝置，其產生由處理器執行的確定步驟的有形記錄。
在另一個方面，本發明涉及采用過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的方法。一般而言，該方法包括第一步驟(a):其用于制備待測試第一分析物的存在的反應混合物。反應混合物包含樣品；在接觸內控后生成內控信號的內控探針；如果第一分析物存在于樣品中，則在接觸第一分析物后生成第一分析物信號的第一分析物探針；以及任選地如果第二分析物存在于樣品中，則在接觸第二分析物后生成第二分析物信號的第二分析物探針。接下來為步驟(b)，其用于測量(i)內控探針和分析物探針生成的組合信號， 而不用區分內控信號與分析物信號；和(ii)任選地如果第二分析物探針包含在反應混合物中，則第二分析物探針生成的第二分析物信號。再下來為步驟(C)，其用于確定以下哪一情形適用(i)樣品不含第一分析物，條件是組合信號的幅度小于第一分析物截止值，并且(I)組合信號的幅度大于或等于有效性截止值，或者(2)第二分析物探針包含在反應混合物中，在步驟(b)中測量第二分析物信號，且在步驟(b)中測量的第二分析物信號的幅度大于或等于第二分析物截止值，從而確立樣品包含第二分析物；(ii)樣品包含第一分析物， 條件是組合信號的幅度大于或等于第一分析物截止值；以及(iii)無法確定樣品是否包含第一分析物，條件是組合信號的幅度小于有效性截止值，并且如果第二分析物探針包含在反應混合物中，則在步驟(b)中測量第二分析物信號，且在步驟(b)中測量的第二分析物信號的幅度小于第二分析物截止值。一般來講，第一分析物截止值的信號量大于有效性截止值的信號量，并且內控信號的可檢測最大值不能超過第一分析物截止值。
根據一般描述的方法的第一高度優選實施方案，在步驟(a)中制備的反應混合物包含第二分析物探針；步驟(b)包括在恒定溫度下測量；以及通過計算機自動進行步驟 (C)。更優選地，步驟(b)包括光學測量。在一種情況下，步驟(b)優選地包括用選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。更優選地，該裝置為光度計。在另一種情況下，內控探針、 第一分析物探針和第二分析物探針各自進行可檢測地標記。更優選地，內控探針和第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。例如，內控探針和第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。作為另外一種選擇，內控探針和第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。
根據該一般描述的方法的第二高度優選實施方案，在步驟(a)中制備的反應混合物不含第二分析物探針；步驟(b)包括在恒定溫度下測量；以及通過計算機自動進行步驟 (c)。更優選地，步驟(b)包括光學測量。在一種情況下，步驟(b)優選地包括用選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。更優選地，該裝置為光度計。在另一種情況下，內控探針、 第一分析物探針和第二分析物探針各自進行可檢測地標記。更優選地，內控探針和第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。例如，內控探針和第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。作為另外一種選擇，內控探針和第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。
除了該一般描述的方法的前述高度優選實施方案外，還存在許多可用來改變本發明的方法的一般優選的修改。在一個一般優選的實施方案中，步驟(b)包括在恒定溫度下測量，且通過計算機自動進行步驟(C)。在另一個一般優選的實施方案中，在步驟(a)中制備的反應混合物包含第二分析物探針。更優選地，在步驟(b)中測量第二分析物信號；在步驟(b)中測量的第二分析物信號的幅度小于第二分析物截止值；以及在步驟(b)中測量的組合信號的幅度大于或等于有效性截止值，從而確定樣品不含第二分析物。在又一個一般優選的實施方案中，在步驟(a)中制備的反應混合物不含第二分析物探針。更優選地，在步驟(b)中測量的組合信號的幅度小于第一分析物截止值但大于或等于有效性截止值，并在步驟(C)中確定樣品不含第一分析物。在再一個一般優選的實施方案中，第一分析物、內控和第二分析物各自都包含核酸。在另一個一般優選的實施方案中，內控探針、第一分析物探針和第二分析物探針各自進行可檢測地標記。更優選地，內控探針和第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。這樣的話，優選地，內控探針和第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。作為另外一種選擇，優選地，內控探針和第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。在另一個一般優選的實施方案中，內控探針、第一分析物探針和第二分析物探針各自包含化學發光標記物。在另一個一般優選的實施方案中，步驟(b)包括光學測量。更優選地，步驟(b)包括用選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。還更優選地，該裝置為光度計。在另一個一般優選的實施方案中， 步驟(C)涉及使用包含軟件查表的計算機進行確定。在另一個一般優選的實施方案中，每個探針都包含核酸。
發明詳述
簡介和概述
本發明提供鑒定含分析物樣品的工具和方法，方式是使用單通道檢測僅以單次讀取而無需區分IC和分析物探針結合所貢獻的信號來檢測相同反應混合物中的IC信號和分析物信號。在高度優選的實施方案中，使用單個可檢測標記物質來同時標記分析物探針(可用于檢測分析物擴增子)和IC探針(可用于檢測IC擴增子)。在另一個實施方案中，標記物可以不同，只要它們可在檢測裝置的單通道中被檢出并且只要IC檢測探針生成的最大信號落在分析物檢測的閾值截止值之下即可。根據所述的方法，將代表分析物和IC檢測的信號的幅度用作變量，因而需要多個閾值來解釋結果。以此方式，可能的是，無需空間分離或單獨的標記物來檢測IC擴增子和分析物擴增子，并能夠驗證分析物檢測的陰性結果。當在恒定的溫度下評估探針雜交(如下所示)時尤其如此，從而將本發明所公開的技術與熱熔融分析區別開來。實際上，所述技術不需要監測在多種溫度條件下的探針雜交程度。
附圖
簡沭
圖I是柱狀圖，示出了如何根據本發明所公開的技術將組合IC信號加分析物信號的幅度用于在IC驗證測定法中確定分析物的存在與否。坐標圖的縱軸代表組合信號幅度。 縱軸上標出了用于解釋實驗結果的有效性(“A”)和分析物(“B”)截止值。落在有效性截止值之下的組合信號不能表明測定結果有效(即，可能表明反應失敗或無效)。達到或超過有效性截止值但未達到或超過分析物截止值的組合信號表明不含分析物的有效反應。達到或超過分析物截止值的組合信號表明包含分析物并被自動視為有效的反應。
圖2是柱狀圖，顯示了多重測定的結果，其中單獨地或組合地檢測兩種分析物。空心柱表示使用IC和分析物-I的特異性探針檢測的組合信號的幅度。這些探針具有相同類型的AE標記物(B卩，閃光體)，并且信號代表均相測定形式下的累積探針雜交信號。所有四個試驗(即，陰性對照、僅分析物-I、僅分析物-2以及分析物-I與分析物-2)都給出了可檢測的閃光體信號。填充柱表示使用分析物_2的特異性探針檢測的信號的幅度，其中該探針具有與用于標記IC和分析物-I的特異性探針的類型不同的類型的AE(S卩，發光體)。只有包含分析物_2核酸模板的試驗才產生可檢測的分析物_2信號。
定義
以下術語在本說明書中具有指定的含義，除非明確地表明具有不同的含義。
所謂“樣品”或“測試樣品”是指疑似含有目標生物體或生物分子(諸如衍生自目標生物體的核酸)的任何物質。該物質可以為(例如)未處理的臨床標本、含有標本的緩沖介質、含有標本和裂解劑(用于釋放屬于目標生物體的核酸)的介質，或含有衍生自目標生物體的核酸(已在反應容器中或反應材料或裝置上分離和/或純化)的介質。在某些情況下， 樣品或測試樣品可包含生物標本的產物，諸如待檢測的擴增核酸。
所謂“分析物”是指在分析程序中檢測或測量的物質，諸如核酸或蛋白質。分析物可包含在進行測試的樣品中。
如本文所用，“標準樣品”是包含已知量的分析物的樣品。
如本文所用，“多核苷酸”是指RNA、DNA或同時包含RNA和DNA的嵌合分子。
所謂“分析物多核苷酸”或“分析物核酸”是指待檢測或定量的所關注的多核苷酸。
所謂“分析物多核苷酸標準品”是指已知量的分析物多核苷酸或其片段。例如，病毒分析物多核苷酸標準品可包含已知數量的以下拷貝病毒基因組、病毒轉錄體或體外合成的代表病毒基因組一部分的轉錄體。
“核酸”是指包含核苷或核苷類似物的多聚化合物，這些核苷或核苷類似物具有含氮雜環堿基或堿基類似物，它們通過磷酸二酯鍵或其它鍵合連接形成多核苷酸。核酸包括 RNA、DNA或嵌合DNA-RNA聚合物以及它們的類似物。核酸“主鏈”可由多種鍵合構成，包括糖-磷酸二酯鍵合、肽-核酸(PNA)鍵(PCT NO.W095/32305)、硫代磷酸酯鍵合、甲基膦酸酯鍵合中的一種或多種，或它們的組合。核酸的糖部分可以是核糖或脫氧核糖，或具有已知取代的類似物化合物，諸如2'甲氧基取代和2’鹵取代(如2’-F)。含氮堿基可以是常規堿基(A、G、C、T、U);其類似物(如肌苷)；嘌呤或嘧啶堿基的衍生物，諸如N4-甲基脫氧鳥苷，去氮或氮雜嘌呤，去氮或氮雜嘧啶，在5或6位具有取代基團的嘧啶堿基，在2、6和/或8位具有改變的或置換取代基的嘌呤堿基，諸如2-氨基-6-甲氨基嘌呤、O6-甲基鳥嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基嘧啶、4- 二甲基肼嘧啶和O4-烷基嘧啶；以及吡唑并化合物，諸如未取代或3-取代的吡唑并[3，4-d]嘧啶(美國專利No. 5，378，825,6, 949，367和PCTNo. W093/13121)。核酸可包含“脫堿基”位置，其中主鏈的一個或多個殘基不含含氮堿基(參見美國專利No. 5，585，481)。核酸也包括“鎖核酸” (LNA)，它是一種含一個或多個LNA核苷酸單體與一個以RNA模擬糖構象鎖定的雙環呋喃糖單元的類似物(Vester等，2004, Biochemi stry43 (42) : 13233-41)。核酸可只含在RNA和DNA中發現的常規糖、堿基和鍵合，或者可包含常規組分和取代(例如，通過2'甲氧基主鏈連接的常規堿基，或包含常規堿基與一種或多種堿基類似物的混合物的核酸)。體外合成核酸的方法在本領域中是熟知的。
所謂“寡核苷酸”或“寡聚物”是指由連在一起的兩個或更多個核苷亞單元或核堿基亞單元構成的聚合物。寡核苷酸的長度范圍優選地為10-100個核苷酸，更優選地為10-80個核苷酸，還更優選地為15-60個核苷酸。寡核苷酸可以是DNA和/或RNA以及它們的類似物。核苷亞單元的糖基可以是核糖、脫氧核糖以及它們的類似物，包括(例如)具有對呋喃核糖部分的2’-O-甲基取代的核糖核苷。包含具有2’取代的核苷亞單元并可用作檢測探針的寡核苷酸、捕獲寡核苷酸和/或擴增寡核苷酸由Becker等在美國專利No. 6，130，038中公開。核苷亞單元可通過以下方式接合鍵合，諸如磷酸二酯鍵合、修飾鍵合；或不會防止寡核苷酸與其互補靶核酸序列雜交的非核苷酸部分。修飾鍵合包括其中標準磷酸二酯鍵合被不同鍵合取代的那些鍵合，諸如硫代磷酸酯鍵合或甲基膦酸酯鍵合。核堿基亞單元可(例如)通過將DNA的天然磷酸脫氧核糖主鏈用偽肽主鏈(諸如通過羧甲基連接基將核堿基亞單元連接到中央仲胺的2-氨乙基甘氨酸主鏈)替換而接合。(具有偽肽主鏈的DNA類似物通常稱為“肽核酸”或“PNA”，并由Nielsen等在美國專利No. 5，539，082 “Peptide Nucleic Acids”中公開。)本發明設想的寡核苷酸或寡聚物的其它非限制性實例包括含雙環和三環核苷的核酸類似物以及稱為“鎖核酸”、“鎖核苷類似物”或“LNA”的核苷酸類似物。(鎖核酸在以下專利中被公開=Wang的美國專利 No. 6，083，482 “ConformationalIy Locked Nucleosides and Oligonucleotides”； Imanishi 等的美國專利 No. 6，268，490 “Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues” ；以及 Wengel 等的美國專利 No. 6, 670, 461 “Oligonucleotide Analogues”。) 本發明設想了任何核酸類似物，前提是修飾的寡核苷酸可在嚴格雜交條件下或擴增反應條件下雜交到靶核酸。
如本文所用，“擴增”是指獲得靶核酸序列、其互補序列或其片段的多個拷貝的體外程序。例如，體外擴增反應是一種酶催化反應，其導致合成靶核酸序列、其互補序列或其片段的多個拷貝。可用于準備體外擴增反應的擴增方法的實例在下文中給出。優選的體外擴增反應以指數方式合成擴增子，這意味著一個擴增子將作為產生新擴增子的模板。
所謂“擴增子”或“擴增產物”是指在核酸擴增反應中生成的核酸分子。擴增子或擴增產物含有可以與靶核酸同義或反義的靶核酸序列。
所謂“分析物擴增子”或“分析物擴增產物”是指在核酸擴增反應中使用分析物核酸作為模板而合成的擴增子。
如本文所用，“探針”是指可用于檢測靶標諸如靶生物分子的靶的分析物特異性試劑。探針的實例包括核酸雜交探針、抗體探針、細胞表面受體和受體特異性配體。
所謂“雜交”是指兩條完全或部分互補的核酸鏈在規定的雜交測定條件下合在一起形成具有雙鏈區域的穩定結構的能力。該雙鏈結構(有時稱為“雜交體”)的兩條組成鏈通過氫鍵合在一起。雖然這些氫鍵最常見的是在單條核酸鏈上在含腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶(A與T或U)或者胞嘧啶與鳥嘌呤(C與G)堿基的核苷酸之間形成，但是堿基配對也可在不屬于這些“常規”配對成員的堿基之間形成。非常規的堿基配對在本領域中是熟知的。
如本文所用，“雜交探針”是在促進雜交的條件下特異性雜交到核酸(優選擴增的核酸)中的靶序列以形成可檢測雜交體的寡核苷酸。探針任選地可包含可檢測的部分，其可連接到探針的末端或可處于內部。探針中與靶多核苷酸結合的那些核苷酸不必嚴格鄰接， 當可檢測的部分處于探針序列內部時即可能如此。檢測可以是直接的(即，由探針直接雜交到靶序列或擴增的核酸而產生)或間接的(即，由探針雜交到中間分子結構而產生，該中間分子結構將探針連到靶序列或擴增的核酸)。探針的“靶” 一般是指擴增核酸序列內所含的序列，其可使用標準氫鍵結合(即，堿基配對)特異性雜交到探針寡核苷酸的至少一部分。探針可包含靶特異性序列和任選地不與待檢測的靶序列互補的其它序列。
如本文所用，“可檢測標記物”或簡稱為“標記物”是指可被檢測或可導致可檢測響應的化學部分。根據本發明的可檢測標記物可直接或間接地連接到探針，諸如雜交探針。優選的可檢測標記物的實例包括放射性同位素、酶、半抗原、諸如染料或賦予可檢測顏色的粒子(如乳膠小珠或金屬粒子)的發色團、發光化合物(如生物發光、磷光或化學發光部分)和熒光化合物。
如本文所用，“均相可檢測標記物”是指可以通過確定標記物是否位于結合到靶序列的探針上而以均相方式檢測的標記物。也就是說，均相可檢測標記物可無需從標記物或標記探針的非結合(如，未雜交)形式物理地除去結合(如，雜交)而進行檢測。當使用標記探針進行檢測核酸時，均相可檢測標記物是優選的。均相標記物的實例在以下專利中有詳細描述ArnoId等的美國專利No. 5，283，174、Woodhead等的美國專利No. 5，656，207和 Nelson等的美國專利No. 5，658，737。用于均相測定法的優選標記物包括化學發光化合物 (例如參見Woodhead等的美國專利No. 5，656，207、Nelson等的美國專利No. 5，658，737和 Arnold, Jr.等的美國專利No. 5，639，604)。優選的化學發光標記物為吖啶酯(“AE”)化合物，諸如標準AE或其衍生物(如萘基-AEjMi -AE、I-或3-甲基_AE、2，7- 二甲基-AE、 4，5- 二甲基-AE、鄰二溴-AE、鄰二甲基-AE、間二甲基-AE、鄰甲氧基-AE、鄰甲氧基(桂皮酸)-AE^P甲基-AE、鄰氣_AE、1_或3-甲基鄰氣-AE、1_或3-甲基間二氣-AE和2-甲基 _AE)。
“均相測定”是指在確定特異性探針結合程度前不需要將結合的探針與未結合的探針物理分離的檢測程序。示例性均相測定(諸如本文所述的那些)可采用分子炬、分子信標或具有莖環結構并在雜交到合適靶標時發出熒光信號的其它自我報告探針，除非存在于雜化雙鏈中否則可通過化學方法選擇性破壞的化學發光吖啶酯標記物，以及本領域的普通技術人員將會熟悉的其它均相可檢測標記物。
在本發明的背景下，將某些方法用于作出或輸出診斷確定結果。例如，基于一組數據，將得出特定分析物存在于測試樣品中的可能性極高的結論。方法的輸出結果可表示為 “確定”或“指定”或“建立”或“稱作”特定分析物存在或可能不存在的步驟。
如本文所用，“內控”是包含在反應混合物中用來檢測分析物存在與否的試劑，其中內控的直接或間接檢測用于驗證測定過程步驟。在使用擴增反應檢測核酸分析物的測定法的背景下，內控可以是能與核酸分析物一起共擴增并在雜交反應中檢測的核酸模板。檢測適當水平的內控擴增產物可確認擴增和雜交過程步驟的成功。在一個實施方案中，內控核酸使用與擴增分析物核酸相同的引物進行擴增，但內控擴增子和分析物擴增子使用不同的雜交探針進行檢測。優選的內控包括加到用于檢測分析物存在與否的反應混合物中的外源性試劑。
所謂“內控擴增子”或“ IC擴增子”或“ IC擴增產物”或其變化形式是指使用內控核酸作為模板在核酸擴增反應中合成的擴增子。
如本文所用，“設備”是指執行某一目的或實現特定用途必需的事物。
如本文所用，“支架”是將某物保持在適當位置的結構元件。例如，支架可容納試管、多孔板、毛細管或其它反應容器。支架可包括用于保持所夾持的事物的機械夾具。優選地，可用于執行本發明的測定法的設備的支架將允許在所夾持的樣品(諸如液相反應混合物)與光學檢測機構之間具有光學通路。
如本文所用，“光學檢測機構”是指從進行測試的樣品中采集光學信號所必需的組件的集合。可用的光學檢測機構的優選實例包括熒光計和光度計。
如本文所用，能量傳感器裝置(諸如配有光能傳感器的裝置)的“通道”是指可排除其它波段而檢測或定量的限定波段。例如，光度計的一個檢測通道能夠將一定波長范圍內的一種或多種化學發光標記物發出的光能作為單一事件而檢測。在化學發光反應過程中發出的光可通過光度計用相對光單位(RLU)定量，計量單位表示在給定波長或波段下樣品發出的光子的相對數量。因熒光而發出的光可作為給定波長下或某一波段內的相對熒光單位 (RFU)而定量。
如本文所用，“單通道檢測”是指這樣一種過程，借以可在能量傳感器裝置的一個通道所代表的限定波段內檢出一個或多個信號。如果例如有兩種可檢測標記物，每種設置在不同的探針上，兩者均發出彼此不同的特征性波長光，并且如果那些波長在對應于能量傳感器裝置的一個檢測通道的限定波段內檢出，則該檢測將被稱為“單通道檢測”。通過單通道檢測，當光子由不同的標記物產生，并具有落在單檢測通道的檢測范圍內的波長時，產生被檢測光子的標記物之間沒有區別。
如本文所用，“單次讀取確定”是指在探針與分析物之間的結合反應后通過檢測步驟獲得結果的過程。通過單次讀取確定，沒有必要更改反應條件(諸如探針雜交條件)，或者進行二次雜交反應。
如本文所用，“內控信號”(有時稱為“1C信號”)是可測量的信號，它表明反應混合物中存在內控或其產物(例如擴增產物)。例如，如果內控帶有標記，則IC信號可由內控直接產生。作為另外一種選擇，內控信號可由與內控或其產物發生特異性相互作用的探針(如內控探針)產生。優選的內控包括蛋白質和核酸。
如本文所用，“分析物信號”是可測量的信號，它表明反應混合物中存在分析物或其產物(例如擴增產物)。例如，如果分析物帶有標記，則分析物信號可由分析物直接產生。 作為另外一種選擇，分析物信號可由與分析物發生特異性相互作用的探針(如分析物探針) 產生。優選的分析物包括蛋白質和核酸。
如本文所用，“組合信號值”是單個值，它表示對單個反應混合物中的分析物和IC所測得的可檢測信號的組合。組合信號不區分內控信號與分析物信號。例如，組合信號值對于化學發光標記物可記錄為RLU (相對光單位)或對于熒光標記物可記錄為RFU (相對熒光信號)。
在某些檢測不止一種分析物的多重測定法中，不同的分析物可分別通過檢測或測量“第一分析物信號”和“第二分析物信號”而檢測。不同分析物的存在與否可通過將相應信號的幅度與相應截止值(如，“第一”和“第二”分析物截止值)進行比較而判定。
如本文所用，“閾值”或“閾值截止值”或簡稱為“截止值”是指用于解釋實驗結果的定量限，其中高于和低于截止值的結果將導致相反的結論。例如，落在截止值之下的測得信號可表示不存在特定靶標，但是超過同一截止值的測得信號則可表示存在該靶標。按照慣例，對于達到截止值(即，剛好等于截止值)的結果，其解釋與超過截止值的解釋相同。
如本文所用，“有效性截止值”是用于確定過程步驟是否有效(如，有效或無效)的截止值。例如，達到或超過有效性截止值的內控信號可表示過程按預期進行，而包括該過程的測定法的結果是有效的。反之，落在有效性截止值之下的內控信號可表示過程未按預期進行，而相應測定法的結果是無效的。
如本文所用，“分析物截止值”是用于表示分析物在反應混合物或測試樣品中存在與否的截止值。例如，達到或超過分析物截止值的分析物信號可表示分析物存在于反應混合物或測試樣品中。反之，落在分析物截止值之下的分析物信號如果經過程控制驗證，則將表示不存在分析物。
如本文所用，“查表”是指相對于(如，<或彡)閾值截止值而表示的陽性和陰性結果的可能組合的集合。集合中的組合可與為進行測試的樣品中的分析物存在性指定陽性或陰性狀態的解釋相關聯。也可指定測定有效性狀態。查表可存儲在計算機可讀介質上，并通常用于解碼實驗結果。
所謂“套裝”是指通常旨在彼此相互結合使用的材料的包裝組合。根據本發明的套裝可包含“有形”形式的說明或其它信息(如，印刷信息、以電子方式記錄在計算機可讀介質上或以其它方式記錄在機器可讀介質諸如用于存儲數值的條形碼上的信息)。
本發明的優詵實施方案
本文所述的分析技術在某些方面與許多其它人所用的先前方法相反。例如，不同于上面提到的美國專利No. 6，586，234，其描述了使用將(a)分析物信號從(b)分析物信號與IC信號的組合中區分開來的兩次讀取方法進行IC驗證，而本發明的方法完全不用分離這些信號。更具體地講，本發明的方法采用單次讀取法，其不需要歸屬由IC和分析物探針產生的信號的來源或幅度，即便使用檢測裝置的單檢測通道進行多個信號檢測時也是如此，這種情況可以通過在兩個探針上使用相同的標記物而產生。實際上，本發明的技術使用單通道檢測法，來同時檢測單一反應混合物中由IC探針和分析物探針兩者產生的信號。本發明的技術不在單獨的檢測反應中分離IC和分析物探針，而是將兩種探針相結合，并同時檢測由它們產生的信號。再次提到，IC和分析物探針可有利地具有相同的可檢測標記物或使用檢測裝置的單通道檢測的不同標記物。他人可能使用單個截止值檢測來自使用相同標記物檢測的多個靶標的信號，但本發明的技術需要使用單獨的截止值(如，所謂的有效性截止值和分析物截止值)。使用多個單獨的截止值能避免單獨讀取以區分不同探針產生的信號。根據本發明的技術，存在多個閾值截止值，并要求由IC探針的檢測所產生的信號的幅度不能超過用于指示分析物的存在的截止值。換句話說，最大可檢測IC信號不能超過用于指示分析物的存在的截止值。總而言之，這些差別將本發明的技術與先前方法區分開來。
一般而言，本文所公開的技術可應用于檢測多種分析物，包括核酸(如DNA和 RNA)、蛋白質(如抗體、激素或其它配體的受體等)以及具有生物學意義的其它分子。通過本發明所公開的方法鑒定的特別優選的分析物為使用互補雜交探針檢測的核酸。IC優選地為外源性合成核酸，其在與分析物核酸共擴增前包含在測試分析物核酸的存在的反應混合物中。將具有不同堿基序列的單獨的雜交探針用于檢測分析物和IC擴增子。檢測步驟在恒定溫度下進行。在一個高度優選的實施方案中，將具有不同靶核酸(即，IC和分析物)特異性的不同探針用相同的化學可檢測標記物質進行標記。然而，如果將不同的可檢測標記物用于標記不同的探針，則由不同標記物產生的信號必須可使用檢測裝置的單通道檢測。優選地，兩種可檢測標記物產生使用檢測裝置的單通道檢測的光學信號，其中該通道由預定的波長范圍限定。
閾倌
本發明的一個方面涉及定義和使用可檢測信號的多個閾值截止值，所述可檢測信號用在通過IC驗證的測定法中鑒定分析物的存在與否。優選地，當使用具有相同化學可檢測標記物質的不同探針來檢測IC和分析物時，對于在檢測分析物信號和IC信號的檢測儀器的單通道中檢出的信號存在兩個閾值截止值。這兩個閾值截止值中的低值(即，“有效性截止值”)用于驗證IC過程控制。這兩個閾值截止值中的高值用于表示分析物在進行測試的樣品中存在與否。未能達到或超過有效性截止值的信號表示因測定過程失敗而導致反應無效。這樣的情形可因測定法的擴增步驟和/或檢測步驟受到抑制而引起。超過有效性截止值但未達到或超過分析物檢測的閾值截止值的信號表示測定法的擴增和檢測步驟成功， 并進一步表示分析物不存在于樣品中。該后一結果可通過本文所公開的方法評定為“有效， 分析物陰性”。最后，檢出既超過有效性截止值也超過分析物閾值截止值的信號則表示分析物存在于樣品中(即，“分析物陽性”樣品)。這樣的話，無需報告或質疑測定結果的有效性。 本發明的這些特征在圖I中示出。
本文所公開的技術的成功取決于以下兩者間的某些一般關系代表IC和分析物檢出的信號的容許幅度，以及多個閾值截止值。重要的是，當使用具有可檢測標記物(它們產生的信號可在檢測裝置的單通道內檢出)的不同探針來檢測分析物和IC時，有效性截止值必須不同于且低于分析物檢測的閾值截止值。在高度優選的實施方案中，所述可檢測標記物是相同的可檢測標記物(如，相同的化學突光標記物質或化學發光標記物，諸如AE標記物)。實際上，通過IC擴增和檢測而產生的超過有效性截止值的信號不應含糊不清地表明使用具有相同化學可檢測標記物質的探針檢測的分析物的存在性。這可通過例如以下方式得以保證要求僅由檢測IC擴增子(B卩，無分析物存在于反應中)而產生的信號的幅度具有無法超過的上限閾值。在特別優選的方法中，這通過以下方式實現確保對本發明所公開的測定法的IC擴增和檢測組成部分進行校準，使得IC信號無法超過不含分析物的擴增反應中的上限閾值截止值。這可防止因僅擴增和檢測IC而表明存在分析物的假陽性結果。用于檢測分析物的閾值截止值始終大于有效性截止值。檢出達到或超過分析物檢測的閾值截止值的信號將自動驗證分析物陽性測定結果。
當使用單一化學可檢測標記物質或可使用檢測裝置的單通道進行檢測的不同可檢測標記物來檢測IC和分析物時，許多不同的方法可用于確保由IC檢測(如，IC擴增子檢測)產生的最大信號低于用于檢測分析物的閾值截止值。例如，可使IC擴增子的比活性(如， 可通過每單位質量探針的可檢測標記單位數來度量)相對于用于檢測分析物擴增子的探針的比活性降低。用于雜交反應的IC特異性探針的量或濃度可相對于分析物特異性探針的量或濃度降低。設置在IC特異性探針上的標記物可選擇為其檢測有效性相對設置在分析物特異性探針上的標記物的有效性低。在高度優選的實施方案中，將用于檢測IC擴增子和分析物擴增子的不同探針用相同的化學可檢測標記物質(如，化學發光標記物，諸如特定結構的吖啶酯標記物；或者作為另外一種選擇，特定結構的熒光標記物)標記，并且用于檢測 IC擴增子的IC特異性探針的量小于用于檢測分析物擴增子的分析物特異性探針的量。當然，用于共擴增反應的IC模板核酸的輸入量也可進行調整，使得通過檢測IC擴增子產生的雜交信號的幅度低于分析物截止值。例如，可將IC核酸的輸入量選擇為不大于分析物檢測下限的十倍，更優選地不大于分析物檢測下限的三倍，更優選地不大于分析物檢測下限的兩倍，還更優選地不大于分析物檢測下限。例如，用于擴增反應的IC模板核酸的量優選地落在以下范圍內從測定法中分析物檢測下限的二分之一到十倍，更優選地從測定法中分析物檢測下限的十分之一到一倍。任何這些低輸入水平的IC模板與任何上述控制量的探針的組合也已得到了成功應用，并落在本發明的范圍內。
當IC和分析物靶標使用單一化學物質作為可檢測標記物(如，同一化學發光標記物、同一熒光標記物等)或可使用檢測裝置的單通道檢測的不同化學可檢測標記物質進行檢測時，閾值截止值的前述討論與IC和分析物的分析相關。通過此方法獲得的結果分析在表I中示出。使用與用于檢測IC和第一分析物不同的可檢測標記物來檢測第二分析物能夠實現，并可涉及使用不同的閾值截止值。實際上，用于評估第二分析物存在與否的閾值截止值可獨立于用于評估第一分析物和IC的結果的閾值截止值。通過該后一方法獲得的結果的分析在表2中示出。
信號幅度和閾值截止值之間的某些關系
如本文其它地方所述，在代表內控和一種或多種分析物檢出的信號幅度與各種相應的閾值截止值之間存在許多有意義的關系。例如，在包括內控和第一分析物的任選地包括第二分析物的測定法以及執行該測定法的設備的背景下，可將測得的組合信號(如，通過內控探針和第一分析物探針產生)的幅度與有效性截止值以及與第一分析物截止值進行比較。如果該測定法包括測量第二分析物信號(如，通過第二分析物探針產生，并區別于組合信號)，則可將該第二分析物信號與第二分析物截止值進行比較。如果組合信號的幅度大于或等于有效性截止值，則通過過程控制確立測定結果有效。如果組合信號的幅度大于或等于第一分析物截止值，則確立檢出第一分析物。如果組合信號的幅度小于有效性截止值，則通過過程控制不能確立測定結果有效。如果反應混合物包含第二分析物探針，并且如果第二分析物信號的幅度大于或等于第二分析物截止值，則通過過程控制確立測定結果有效， 并確立檢出第二分析物。如果反應混合物包含第二分析物探針，并且如果第二分析物信號的幅度小于第二分析物截止值，則不能確立檢出第二分析物，并且通過過程控制不能確立測定結果有效。因此，當檢出第二分析物信號時，該信號也可用于驗證測定結果，包括檢測第一分析物的陰性結果。這些確定過程的每一個都可以通過根據本發明的設備的處理器或計算機元件而確立。確立的實例
閾值截止值(S卩，有效性截止值和分析物截止值)與代表IC加分析物檢測的組合信號的測得測試信號之間的比較可通過可供選擇的方法執行。在一個優選的實施方案中，將預定的閾值截止值用于評估測試結果并確定分析物是否存在。在不同的優選實施方案中， 使用在待用于測試的各種不同機器上運行的校準品確立閾值截止值。
確立具體機器和/或試劑組特定的閾值截止值可以按不同的方式進行，但通常將采用一個或多個校準標準品(即，一個或多個含有已知量的待擴增和檢測的相關核酸的標準品)。各校準反應均包括內控。對于將視為有效的測定法，“陰性”校準品可用于確立必須由代表IC和分析物檢出的信號超過的有效性截止值。陰性校準品反應優選地包括可以擴增并檢測的IC模板核酸，但不包括任何分析物核酸。確立有效性截止值的一種方法是計算在陰性校準品運行(即，擴增和檢測程序)中測得的信號的值的二分之一(即50%)，或更優選地在多個陰性校準品擴增和檢測反應中測得的信號的平均值的二分之一。產生的組合信號值低于該有效性截止值的任何測試反應在不存在第二分析物測得的驗證結果的情況下將被視為無效(即，表示過程失敗)。陰性校準品結果除了二分之一以外的分數(如60%、70% 等)作為另外一種選擇可被選為具有良好結果的有效性截止值。產生的信號值高于有效性截止值的任何測試反應將被視為有效。
對于要視為分析物陽性的結果(B卩，“分析物陽性”)而言必須超過的最簡單形式的上限閾值(即，“分析物截止值”)也可通過使用陰性校準品反應獲得的結果加以確定。分析物截止值優選地將為陰性校準品試驗測得的信號值(或陰性校準品運行的平均值)的至少一點五倍。更優選地，分析物截止值將為陰性校準品試驗測得的信號值的至少兩倍。還更優選地，分析物截止值使用得自陰性校準品試驗以及得自陽性校準品試驗的結果加以確定。 例如，分析物截止值可通過以下方式確定將多個陰性校準品的值加上產生代表IC和分析物檢出的信號的陽性校準品的測得值的一定百分比(如，10%、20%、30%，或在10%-30%的范圍內)，其中兩個靶標都使用單通道檢測進行檢測。這將在下文的實施例中示出。
核酸檢測
在優選的實施方案中，當檢測雜交信號時，核酸擴增子在溶液中用不固定到固體載體上的液相雜交探針進行檢測。這明顯不同于陣列檢測形式，諸如核酸微陣列，其中探針雜交結果的解釋依賴于一個探針與另一個的空間分離。同樣，本發明的方法可使用以下IC 探針和分析物探針(例如，它們的每一個都為核酸雜交探針)加以實踐，這些探針具有相同的化學可檢測標記物質，或者足夠相似以允許使用檢測裝置中的單檢測通道進行檢測的標記物。要注意的是，優選的程序不涉及檢測只代表分析物存在的信號，也不檢測代表IC存在的信號。同樣地，優選的程序不涉及檢測只代表IC存在的信號，而在分析物也可檢測時將分析物排除在外不進行檢測。例如，在某些實施方案中，檢測表示IC和分析物均存在的累積信號，這意味著不單獨檢測IC信號和分析物信號。以此方式，本發明的方法不同于其中要單獨檢測分析物信號和IC信號的某些其它測定形式。
本文所述的方法可便利地采用查表來解釋結果并確定樣品中分析物存在與否，以及驗證測定完整性。表I表示可用于根據本發明所公開的使用分析物和IC信號的單通道檢測來檢測分析物和IC的方法進行結果解釋的基本查表，這些信號可通過用單一類型的可檢測標記物(即，每種探針上的標記物相同)標記的不同探針(即，IC和分析物的單獨探針) 提供。參照閾值截止值的排列，檢出的信號低于分析物的閾值截止值也低于有效性截止值時表明測試無效。反之，檢出的信號低于分析物的截止值但高于有效性截止值則表明測試有效且分析物陰性。最后，信號高于分析物截止值則表明測試為分析物陽性。因此，使用少至兩種的具有相同化學可檢測標記物質的探針可了解分析過程的有效性以及了解分析物的存在與否。
表I
對使用單標記物質檢測IC和分析物獲得的結果進行的分析
權利要求
1.一種通過過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的設備，所述設備包括 (a)被構造成容納所述樣品的支架， 所述樣品進一步包含 在接觸所述內控后生成內控信號的內控探針， 如果第一分析物存在于所述樣品中，則在接觸所述第一分析物后生成第一分析物信號的第一分析物探針，以及 任選地如果第二分析物存在于所述樣品中，則在接觸所述第二分析物后生成第二分析物信號的第二分析物探針； (b)被布置成當所述樣品容納在所述支架中時接收來自所述樣品的光學信號的光學檢測機構， 其中所述光學檢測機構被構造成測量所述內控探針和所述分析物探針所產生的組合信號而不用區分所述內控信號與所述分析物信號，并且 其中所述光學檢測機構任選地被構造成測量所述第二分析物探針產生的所述第二分析物信號； (C)與所述光學檢測機構通信的處理器，所述處理器被編程為執行下列步驟 確定以下哪一,清形適用， (i)所述樣品不含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度小于第一分析物截止值并且 所述組合信號的幅度大于有效性截止值，或 所述第二分析物探針包含在所述樣品中，所述光學檢測機構被構造成測量所述第二分析物信號，且所述第二分析物信號的幅度大于第二分析物截止值，從而確立所述樣品包含所述第二分析物； ( )所述樣品包含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度大于所述第一分析物截止值，以及 (iii)無法確定所述樣品是否包含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度小于所述第一分析物截止值且小于所述有效性截止值，并且所述第二分析物探針包含在所述反應混合物中，且所述光學檢測機構被構造成測量所述第二分析物信號，所述第二分析物信號小于所述第二分析物截止值， 其中所述第一分析物截止值的信號量大于所述有效性截止值的信號量，并且 其中所述內控信號的可檢測最大值不能超過所述第一分析物截止值。
2.根據權利要求I所述的設備，其中所述光學檢測機構被構造成測量所述第二分析物探針產生的所述第二分析物信號。
3.根據權利要求2所述的設備，其中所述支架基本上不改變所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中的溫度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述內控各自都包含核酸，并且其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號也不測量所述內控信號。
4.根據權利要求2所述的設備，其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號，也不測量所述內控信號，并且其中所述設備進一步包括輸出裝置，其產生由所述處理器執行的所述確定步驟的有形記錄。
5.根據權利要求4所述的設備，其中所述支架基本上不改變所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中的溫度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述內控各自都包含核酸，并且其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號也不測量所述內控信號。
6.根據權利要求5所述的設備，其中所述光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。
7.根據權利要求6所述的設備，其中所述檢測器為光度計。
8.根據權利要求5所述的設備，其中所述樣品在所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。
9.根據權利要求I所述的設備，其中所述光學檢測機構不被構造成測量所述第二分析物探針產生的所述第二分析物信號。
10.根據權利要求9所述的設備，其中所述支架基本上不改變所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中的溫度，其中所述第一分析物和所述內控各自都包含核酸，并且其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號也不測量所述內控信號。
11.根據權利要求9所述的設備，其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號，也不測量所述內控信號，并且其中所述設備進一步包括輸出裝置，其產生由所述處理器執行的所述確定步驟的有形記錄。
12.根據權利要求11所述的設備，其中所述支架基本上不改變所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中的溫度，其中所述第一分析物和所述內控各自都包含核酸，并且其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號也不測量所述內控信號。
13.根據權利要求12所述的設備，其中所述光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。
14.根據權利要求13所述的設備，其中所述檢測器為光度計。
15.根據權利要求12所述的設備，其中所述樣品在所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。
16.根據權利要求I所述的設備，其中所述樣品容納在反應容器中，并且其中所述支架被構造成容納多個反應容器。
17.根據權利要求16所述的設備，其中所述反應容器選自試管和多孔板的孔。
18.根據權利要求I所述的設備，其中所述光學檢測機構包括選自光度計和熒光計的檢測器。
19.根據權利要求18所述的設備，其中所述檢測器為光度計。
20.根據權利要求I所述的設備，其中所述處理器為包含軟件查表的獨立計算機。
21.根據權利要求I所述的設備，其中所述支架基本上不改變所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中的溫度，其中所述第一分析物、所述第二分析物和所述內控各自都包含核酸，并且其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號也不測量所述內控信號。
22.根據權利要求I所述的設備，其中所述樣品在所述光學檢測機構測量所述組合信號的運行過程中保持基本上恒定的溫度。
23.根據權利要求22所述的設備，其中所述支架容納在溫控培養箱內。
24.根據權利要求I所述的設備，其中所述光學檢測機構不測量所述第一分析物信號，也不測量所述內控信號，并且其中所述設備進一步包括輸出裝置，其產生由所述處理器執行的所述確定步驟的有形記錄。
25.一種采用過程控制確定包含內控的樣品中第一分析物存在與否的方法，所述方法包括以下步驟 (a)制備待測試所述第一反應物的存在的反應混合物，所述反應混合物包含 所述樣品 接觸所述內控后生成內控信號的內控探針， 如果第一分析物存在于所述樣品中，則在接觸所述第一分析物后生成第一分析物信號的第一分析物探針，以及 任選地如果第二分析物存在于所述樣品中，則在接觸第二分析物后生成第二分析物信號的第二分析物探針； (b)測量 (i)所述內控探針和所述分析物探針所產生的組合信號而不用區分所述內控信號與所述分析物信號，并且 ( )任選地如果所述第二分析物存在于所述反應混合物中則測量所述第二分析物信號；以及 (C)確定以下哪一,清形適用， (i)所述樣品不含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度小于第一分析物截止值并且 所述組合信號的幅度大于有效性截止值，或 所述第二分析物探針包含在所述反應混合物中，在步驟(b)中測量所述第二分析物信號，而在步驟(b)中測量的所述第二分析物信號的幅度大于第二分析物截止值，從而確立所述樣品包含所述第二分析物； ( )所述樣品包含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度大于所述第一分析物截止值，以及 (iii)無法確定所述樣品是否包含所述第一分析物，條件是所述組合信號的幅度小于所述有效性截止值，并且所述第二分析物探針包含在所述反應混合物中，在步驟(b)中測量所述第二分析物信號，而在步驟(b)中測量的所述第二分析物信號的幅度小于所述第二分析物截止值， 其中所述第一分析物截止值的信號量大于所述有效性截止值的信號量，并且 其中所述內控信號的可檢測最大值不能超過所述第一分析物截止值。
26.根據權利要求25所述的方法，其中步驟(b)包括在恒定溫度下測量，并且其中通過計算機自動進行步驟(C)。
27.根據權利要求25所述的方法，其中在步驟(a)中制備的所述反應混合物包含所述第二分析物探針，其中步驟(b)包括在恒定溫度下測量，并且其中通過計算機自動進行步驟(c)。
28.根據權利要求27所述的方法，其中步驟(b)包括光學測量。
29.根據權利要求28所述的方法，其中步驟(b)包括通過選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述裝置為光度計。
31.根據權利要求28所述的方法，其中所述內控探針、所述第一分析物探針和所述第二分析物探針各自進行可檢測地標記。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。
34.根據權利要求32所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。
35.根據權利要求25所述的方法，其中在步驟(a)中制備的所述反應混合物不含所述第二分析物探針，其中步驟(b)包括在恒定溫度下測量，并且其中通過計算機自動進行步驟(c)。
36.根據權利要求35所述的方法，其中步驟(b)包括光學測量。
37.根據權利要求36所述的方法，其中步驟(b)包括通過選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。
38.根據權利要求37所述的方法，其中所述裝置為光度計。
39.根據權利要求36所述的方法，其中所述內控探針、所述第一分析物探針和所述第二分析物探針各自進行可檢測地標記。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。
41.根據權利要求40所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。
42.根據權利要求40所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。
43.根據權利要求25所述的方法，其中在步驟(a)中制備的所述反應混合物包含所述第二分析物探針。
44.根據權利要求43所述的方法，其中在步驟(b)中測量所述第二分析物信號，其中在步驟(b)中測量的所述第二分析物信號的幅度小于第二分析物截止值，其中在步驟(b)中測量的所述組合信號的幅度大于有效性截止值，從而確定所述樣品不含所述第二分析物。
45.根據權利要求25所述的方法，其中在步驟(a)中制備的所述反應混合物不含所述第二分析物探針。
46.根據權利要求45所述的方法，其中在步驟(b)中測量的所述組合信號的幅度小于所述第一分析物截止值但大于所述有效性截止值，并且其中在步驟(c)中確定所述樣品不含所述第一分析物。
47.根據權利要求25所述的方法，其中所述第一分析物、所述內控和所述第二分析物各自都包含核酸。
48.根據權利要求25所述的方法，其中所述內控探針、所述第一分析物探針和所述第二分析物探針各自進行可檢測地標記。
49.根據權利要求48所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的可檢測標記物進行可檢測地標記。
50.根據權利要求49所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的化學發光標記物進行可檢測地標記。
51.根據權利要求49所述的方法，其中所述內控探針和所述第一分析物探針各自用相同的吖啶酯進行可檢測地標記。
52.根據權利要求25所述的方法，其中所述內控探針、所述第一分析物探針和所述第二分析物探針各自包含化學發光標記物。
53.根據權利要求25所述的方法，其中步驟(b)包括光學測量。
54.根據權利要求53所述的方法，其中步驟(b)包括通過選自光度計和熒光計的裝置進行光學測量。
55.根據權利要求54所述的方法，其中所述裝置為光度計。
56.根據權利要求25所述的方法，其中步驟(c)包括通過含有軟件查表的計算機進行確定。
57.根據權利要求25所述的方法，其中每個所述探針都包含核酸。
全文摘要
本發明公開了用于檢測含內控的反應混合物中的分析物的設備和方法。使用核酸的擴增和檢測闡述了本發明，其中擴增反應包含外源性內控。檢測信號的幅度用作鑒定無效試驗、鑒定分析物陰性的有效試驗以及鑒定分析物陽性的試驗的變量。對表明探針雜交的信號進行檢測可用于在只使用單個可檢測標記物的驗證反應中指定分析物核酸的存在與否，并且不用區分由內控探針結合和分析物探針結合所貢獻的信號的比例。
文檔編號C12Q1/68GK102985566SQ201180032676
公開日2013年3月20日 申請日期2011年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者S.A.朱, J.M.多克特 申請人:簡.探針公司