用于將生物分子遞送入植物細胞中的植物肽gamma-玉米醇溶蛋白的制作方法

專利名稱：用于將生物分子遞送入植物細胞中的植物肽gamma-玉米醇溶蛋白的制作方法
用于將生物分子遞送入植物細胞中的植物肽GA圖A-玉米醇溶蛋白優先權要求本申請要求2010年3月31日提交的美國臨時專利申請流水號61/319，764的關于“PLANT PEPTIDE GAMMA-ZEIN FOR DELIVERY OF BIOMOLECULES INTO PLANT CELLS” 的提交日權益。
背景技術：
開發展現出特定性狀的新植物系的傳統植物育種策略是費時的且有時是 不可預測的。現有的策略，諸如土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導的轉化和顆粒轟擊很大程度上取決于組織和基因型。細胞穿透肽(CPP)是一類新的且快速增長的短肽，已知其在將一大批包含DNA、RNA和蛋白質的貨物復合物易位穿過哺乳動物和人細胞系的生物膜時發揮重要的作用(Schwartz 和 Zhang, 2000; Langel, 2002; Vives, 2002,)。雖然已經顯示了 CPP有助于哺乳動物細胞中的貨物遞送，但是在植物細胞中使用CPP以進行轉染的研究受限于許多因素。使此技術適合于植物的主要障礙在于，與動物細胞不同，植物細胞給CPP及其貨物的內在化呈現出雙重屏障系統(細胞壁和質膜)。因此，CPP必須克服這兩種屏障來將貨物分子有效移位入完整的植物細胞中。CPP已經在植物細胞中使用，但是依賴于使用透化劑以實現對完整的植物細胞遞送貨物分子。CPP介導的將小分子、核酸和蛋白質向完整的植物細胞中的遞送很大程度上仍然是未探索的，并且對于植物系統中的體外和體內遺傳和生物化學操作是有利的。納米顆粒具有的獨特性質已經被利用于將DNA遞送至細胞。金屬納米顆粒，諸如金(Au)納米顆粒由于其低細胞毒性和容易用各種有生物學意義的配體官能化而已經用于DNA遞送。在金屬納米顆粒外,還已經使用大小范圍3-5nm內的半導體納米顆粒(例如量子點)(“QD”)作為載體來將分子遞送到細胞中。DNA和蛋白質可以連接經由各種表面官能化附接于 QD 的配體(見例如 Patolsky, F.等，J. Am. Chem. Soc. 125，13918 (2003))。已經使用納米顆粒來將質粒DNA遞送到多種動物細胞。已經發現了，在將經DNA包被的納米顆粒與沒有細胞壁的細胞一起溫育時，細胞吸收納米顆粒，并開始表達DNA上編碼的任何基因。然而，由于植物細胞壁的存在，當前的植物基因遞送是挑戰性的，這導致對用于植物遺傳轉化的侵入性遞送手段的常見依賴。在期望對通常具有細胞壁的細胞進行納米顆粒介導的遞送的情況中，在將顆粒添加至植物原生質體前將細胞壁剝離(見Torney, F.等，Nature Nanotechnol. 2, (2007))。在植物細胞中，細胞壁給遞送外源施用的分子呈現難以克服的障礙。已經采用許多侵入性方法，如基因槍(生物射彈)、顯微注射、電穿孔、和土壤桿菌來實現向有壁的植物細胞中的基因和小分子遞送，但是僅僅通過顯微注射實現了蛋白質遞送。隨著來自植物基因組測序項目的信息日益增多，迫切需要用于一大批基因的功能基因組研究及用于開發表達重要的農藝學性狀的轉基因植物的在植物中的快速、通用的(不依賴組織/基因型的)方法。發明概述
以下結合系統、工具和方法來描述各實施方案，所述系統、工具和方法意為例示性和說明性，而非對范圍的限制。本發明的一個實施方案涉及一種將感興趣的分子導入具有細胞壁的植物細胞中的方法。該方法包括提供具有細胞壁的植物細胞，并將ga_a-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構。然后,將所述具有細胞壁的細胞和所述gamma-玉米醇溶蛋白連接結構置于彼此接觸中，并容許將gamma-玉米醇溶蛋白連接的感興趣的分子攝取入所述具有細胞壁的細胞中。本發明的另一個實施方案涉及一種表達基因的方法，該方法包括提供具有細胞壁的植物細胞，并將gamma-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的基因相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接基因結構。將具有細胞壁的植物細胞和ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構置于彼此接觸中，并容許將gamma-玉米醇溶蛋白和基因攝取入包含細胞壁的植物細胞中。然后，表達具有植物細胞的植物的后代中的基因。在本發明的又一個實施方案中，將分子物質轉移入植物細胞中。該方法包括將 gamma-玉米醇溶蛋白肽與質粒DNA相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構。在容許將gamma-玉米醇溶蛋白肽和來自質粒DNA的基因攝取入植物細胞中的條件下使所述gamma-玉米醇溶蛋白連接結構與攜帶完整壁的植物細胞置于接觸中。在上文所描述的例示性方面和實施方案外，其它方面和實施方案會因以下描述而變得顯而易見。附圖
簡述圖I顯示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合基因的質粒圖。圖2顯示了關于gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽純化的Ni螯合層析。圖3顯示了對gamma-玉米醇溶蛋白/YFP洗脫譜(Profile)的SDS-PAGE分析。圖4顯示了 gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的Maldi-TOF肽質譜。圖5顯示的共焦顯微鏡圖像顯示了融合肽的細胞攝取和內在化A.用Hoechst33342染色的胡蘿卜單細胞，其顯示細胞核；B.胡蘿卜單細胞，其顯示細胞核和胞質中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP熒光定位；C.用Hoechst33342染色的胡蘿卜JTNTI細胞，其顯示細胞核；D.煙草JTNTl細胞，其顯示細胞核和胞質中的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP熒光以及用Hoechst 33342的藍色核染色；E.共焦圖像，其展示靶向JTNTl細胞的質膜和細胞核兩者的ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽；及F和G，其分別顯示相應的明視野圖像和共焦/明視野圖像的重疊。圖6顯示了 pDAB3831的質粒圖。發明詳述在以下的描述和表中，使用了許多術語。為了提供對說明書和權利要求書(包括此類術語給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了以下定義回交。回交是育種人員將雜種后代往回與親本之一，例如第一代雜種F1與F1雜種的親本基因型之一重復雜交的方法。胚。胚可以是成熟的種子內含有的小植物。玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白指自玉米面筋粗粉(gluten meal)生成的玉米蛋白。它缺乏氨基酸賴氨酸和色氨酸，因此它不合適作為飲食蛋白的唯一來源。它在水和酒精中不可溶，但是在含水酒精、二醇和乙二醇醚中是可溶的。它發揮膜和涂層功能以為堅果和谷物產物提供水分屏障。它還發揮糖果和小塊商品(panned goods)糖楽;的涂層功能。納米微粒。一種具有至少I納米級尺寸，通常小于IOOnm的微觀顆粒。適合于用于本發明的納米微粒可以具有lnm-0. 4um的大小范圍。量子點可以具有Inm-IOnm,優選地2-4nm的中值直徑。納米顆粒可以選自金納米微粒、金包被的納米微粒、多孔性納米顆粒、中孔性納米顆粒、娃土納米顆粒、聚合物納米顆粒、鶴納米顆粒、明膠納米顆粒、納米殼(nanoshell)、納米核心(nanocore)、納米球(nanosphere)、納米棒(nanorod)、磁性納米微粒及其組合。量子點。量子點是限制導帶電子、價帶空穴、或激子(導帶電子和價帶空穴的束縛對(bound pair))在所有三個空間方面的運動的半導體納米結構。該限制可以由靜電勢(由外部電極、摻雜、應變雜質產生)、不同半導體材料間界面的存在(例如在核心-殼納米晶體系統中)、半導體表面的存在(例如半導體納米晶體)或這些的組合所致。量子點可以具有離散的量子化能譜。相應的波函數在空間上位于量子點內，但是延續晶格的多個周期。 量子點含有小的有限數目(1-100級)的導帶電子、價帶空穴、或激子(即，有限數目的基元電荷)。穩定化的或穩定的轉化體。穩定化的或穩定的轉化體指其基因組從一個世代可再現地(reproducibly)傳遞給下一世代的植物。攝取。攝取指顆粒，諸如gamma-玉米醇溶蛋白穿過細胞壁或細胞膜的易位,其中所述易位不僅僅由于除攝取顆粒的細胞外的某物對顆粒賦予的動量而發生。出于比較的目的，僅由于對顆粒賦予的動量而引起顆粒穿過細胞壁或細胞膜的易位的裝置或方法的例子是生物射彈、基因槍、顯微注射、和/或刺穿感染(impalefection)技術。在一個具體的實施方案中，本發明涉及gamma-玉米醇溶蛋白作為CPP將有效負載有效遞送入完整的植物細胞中在植物系統中在小分子遞送、生物分子遞送、基因遞送、成像和各種生物技術診斷學和感測功能方面的用途。在本發明的其它實施方案中，可以將“添加”或“訪客”分子與gamma-玉米醇溶蛋白分子偶聯。此特性可以例如在細胞內的分子位點的特異性靶向和編輯中采用，用于諸如生物模擬物、靶向遞送等領域，用于非遺傳修飾生物體選項，及在性狀和疾病抗性應用方面在多種樹、蔬菜和中耕作物中的瞬時轉化選項。也可以采用本發明的實施方案來開發植物中合適的生物傳感器。依照本發明的實施方案，可以提供一種將感興趣的分子導入包含細胞壁的植物細胞中的方法，該方法包括將含有感興趣的分子的ga_a-玉米醇溶蛋白置于與植物細胞的接觸中，并容許穿過植物細胞壁攝取gamma-玉米醇溶蛋白。在本發明的具體方面中，gamma-玉米醇溶蛋白可以可逆地或不可逆地含有感興趣的分子，可以與感興趣的分子相互作用，或者以其它方式結合和/或攜帶感興趣的分子。依照本發明的實施方案，具有細胞壁的植物細胞可以是包含完整且全部細胞壁的任何植物細胞。具有細胞壁的細胞的例子包括但不限于藻類、煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽、棉花、棕櫚、花生、大豆、甘鹿、稻屬物種(Oryza sp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsis sp.)、和蓖麻屬物種(Ricinus sp.),優選地煙草、胡蘿卜、玉米、棉花、蕓苔、大豆和甘蔗；更優選地煙草和胡蘿卜。本發明的實施方案可以包括來自任何組織或它們存在的任何地方的包含細胞壁的細胞，包括但不限于在胚、分生細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果、莖、組織培養物和懸浮液完整的單植物細胞中。在本發明的實施方案中，感興趣的分子可以是可以遞送到依照本發明的植物細胞的任何分子。感興趣的分子或感興趣分子的組分可以包含但不限于任何小分子、核酸、DNA、RNA、RNAi、miRNA分子、基因、質粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導肽、抗體、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、和/或其組合。本發明的實施方案包括用于預防或治療疾病的方法。非限制性的例示性實施方案包括使用本發明的方法對有此需要的細胞遞送殺真菌劑、抗生素、和/或其它藥物。 在本發明的方面，ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構可以被攝取入多種植物細胞細胞器中。可以攝取ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構的位置的例子包括但不限于胞質溶膠、細胞核、液泡形成體、質體、黃化質體、色質體、白色體、油質體、蛋白質體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。在本發明的其它實施方案中，可以經由共質體或質外體途徑發生包含細胞壁的細胞對ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構的攝取。本發明的其它實施方案包括經遺傳修飾的植物細胞及其生成方法，其中植物細胞具有經由本發明的方法導入其中的一種或多種核酸。在實施方案的一個例子中，可以經由依照本發明的ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構將包含感興趣的基因和選擇標志的質粒導入具有細胞壁的植物細胞中。在其它實施方案中，可以選擇已經穩定地整合了感興趣的基因和/或選擇標志的穩定轉化體。在備選的實施方案中，可以增殖現在包含感興趣的基因的植物細胞以生成包含感興趣的分子的其它細胞。在其它實施方案中，現在包含感興趣的分子的植物細胞可以是可再生細胞，其可以用于再生包含感興趣的分子的全植物。在另一方面，本發明提供了創建在組織培養中使用的包含感興趣分子的可再生植物細胞的方法。優選地，組織培養將能夠再生與所述可再生細胞具有基本上相同的基因型的植物。此類組織培養物中的可再生細胞可以是胚、原生質體、分生細胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果或莖。更進一步，本發明的實施方案提供了自本發明的組織培養物再生的植物。或者，本發明提供了將期望的性狀導入具有細胞壁的植物細胞中的方法，其中該方法包括將能夠提供期望性狀的感興趣的ga_a-玉米醇溶蛋白基因放入具有細胞壁的植物細胞中，并允許感興趣的ga_a-玉米醇溶蛋白連接基因被攝取穿過細胞壁。期望性狀的例子包括但不限于選自下組的性狀雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、對細菌性、真菌性、和/或病毒性疾病的抗性、和對最終用戶賦予益處的性狀，諸如改善的油譜(profile)、改變的淀粉和纖維含量、提升的維生素和氨基酸含量等。本發明的其它方面提供了生成包含期望的分子或感興趣的基因的穩定植物系的方法，其中可以首先通過ga_a-玉米醇溶蛋白介導的易位穿過植物細胞壁來導入期望的分子或感興趣的基因。穩定化遺傳或以其它方式改變的植物系的方法是本領域普通技術人員公知的，并且包括如下的技術，諸如但不限于自交、回交、雜種生成、與穩定群體雜交等。包含首先通過穿過細胞壁的ga_a-玉米醇溶蛋白介導的轉移來導入植物細胞(或其祖先)中的期望分子或感興趣基因的所有植物和植物細胞在本發明范圍內。有利地，包含首先通過穿過細胞壁的gamma-玉米醇溶蛋白介導的轉移來導入植物或細胞(或其祖先)中的感興趣分子或基因的植物細胞可以用于與其它不同植物育種雜交以生成具有卓越特征和表型的第一代(F1)雜種細胞、種子、和/或植物。在感興趣的分子包含一種或多種基因的實施方案中，基因可以是顯性或隱性等位基因。舉例而言，所述基因會賦予的性狀諸如除草劑抗性、抗蟲性、細菌抗性、真菌抗性、病毒疾病抗性、雄性能育、雄性不育、提高的營養質量、和工業用途。隨著使分離和表征編碼特定蛋白質或RNA產物(例如RNAi)的基因成為可能的分子生物學技術的出現，植物生物學領域的科學家對以下方面形成了強烈的興趣，即工程化改造細胞的基因組以含有和表達外來基因，或者另外的或經修飾型式的天然或內源基因(可能由不同啟動子驅動)，以便以特定的方式改變細胞的性狀。此類外來的另外的和/或經修飾的基因在本文中統稱為“轉基因”。在過去15至20年里，已經開發了數種用于產生轉基因植物細胞的方法，并且在具體的實施方案中，本發明涉及轉化形式的細胞及其生成方法，其通過經由穿過植物細胞壁和膜攝取ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構將轉基因導入 具有細胞壁的植物細胞來進行。在本發明的實施方案中，轉基因可以包含在表達載體中。細胞轉化可以牽涉構建編碼會在特定細胞中發揮功能的構建體的表達載體。此類載體可以包含包括在調節元件(例如啟動子)控制下的或者與調節元件(例如啟動子)可操作連接的基因的DNA。表達載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調節元件組合。載體可以是質粒形式，而且可以單獨或者與其它質粒聯合使用，以如下文所描述的那樣使用轉化方法生成經轉化的細胞，從而將轉基因摻入包含細胞壁的植物細胞的遺傳物質中。經由gamma-玉米醇溶蛋白攝取的表達載體標志物或報告物基因表達載體可以包括至少一種與調節元件(例如啟動子)可操作連接的遺傳標志，其容許通過負選擇(即抑制不含該選擇標志基因的細胞生長)或者通過正選擇(即篩選由該遺傳標志編碼的產物)回收含有所述標志的經轉化細胞。許多用于轉化的選擇標志基因是轉化領域中公知的，包括例如編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性化學劑解毒的酶的基因，或者編碼可對抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。幾種正選擇方法也是本領域中已知的。一種通常適合于植物轉化的選擇標志基因可以包括在植物調節信號控制下的新霉素磷酸轉移酶II (nptll)基因，其賦予對卡那霉素的抗性。參見例如Fraley等，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 80:4803 (1983)。另一種常用的選擇標志基因可以是潮霉素磷酸轉移酶基因，其賦予對抗生素潮霉素的抗性。參見例如Vanden Elzen等，Plant Mol.Biol. ,5:299(1985)。賦予對抗生素抗性的細菌起源的另外的選擇標志基因包括慶大霉素乙酰轉移酶、鏈霉素磷酸轉移酶、氨基糖苷-3’ -腺苷酰轉移酶(adenyl transferase)和博來霉素抗性決定子。參見 Hayford 等,Plant Physiol. 86:1216 (1988)，Jones 等,Mol. Gen.Genet. , 210:86(1987) ;Svab 等，Plant Mol. Biol. 14:197 (1990)，Hille 等，Plant Mol.Biol. 7:171 (1986)。其它選擇標志基因賦予對除草劑諸如草甘膦、草銨膦(glufosinate)或溴苯臆(bromoxynil)的抗性。參見 Comai 等，Nature 317:741-744 (1985),Gordon Kamm等，Plant Cell 2:603-618(1990);和 Stalker 等，Science 242:419-423(1988)。賦予對除草劑的耐受性的選擇標志包括膦絲菌素乙酰基轉移酶(PAT)。
其它適合于植物轉化的選擇標志基因不是細菌起源的。這些基因包括例如小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酸乳酸合酶。參見Eichholtz 等,Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987)，Shah 等,Science233:478 (1986)，Charest 等，Plant Cell Rep. 8:643 (1990)。另一類適合于植物轉化的標志基因需要篩選據推測經轉化的植物細胞，而不對經轉化的細胞直接遺傳選擇對毒性物質諸如抗生素的抗性。這些基因特別可用于量化或顯現基因在特定組織中表達的空間樣式，并且通常稱為報告基因，因為它們可以與基因或基因調節序列融合以調查基因表達。通常用于篩選經轉化的細胞的基因包括葡糖醛酸糖苷酶(OTS)、β -半乳糖苷酶、螢光素酶和氯霉素乙酰轉移酶。參見R. A.，Jefferson, PlantMol. Biol. Rep. 5:387 (1987)，Teeri 等，EMBO J. 8:343 (1989)，Koncz 等，Proc. Natl. Acad.SciU. S. A. 84:131(1987)，DeBlock 等，EMBO J.3:1681(1984)。最近，已經可獲得用于顯現⑶S活性的體內方法，其不需要破壞植物組織。Molecular Probes publication 2908, Imagene, GreenTM,第 I 頁-第 4 頁(1993)；和 Naleway等，J. Cell Biol. 115:151a(1991)。然而，還沒有證明這些用于顯現⑶S活性的體內方法對于回收經轉化的細胞是有用的，這是由于低靈敏度、高熒光背景和與使用螢光素酶基因作為選擇標志有關的限制。新近，已經利用編碼熒光蛋白(例如，GFP、EGFP, EBFP, ECFPjP YFP)的基因作為原核和真核細胞中基因表達的標志物。參見Chalfie等，Science 263:802(1994)。熒光蛋白和熒光蛋白突變體可以作為可篩選標志物使用。經由gamma-玉米醇溶蛋白攝取的表達載體啟動子表達載體中包含的基因必須由包含調節元件(例如啟動子)的核苷酸序列驅動。數種類型的啟動子現在是轉化領域中公知的，可以單獨使用或者與啟動子聯合使用的其它調節元件也是如此。如本文中所使用的，“啟動子”包括提及如下的DNA區域，其可以在轉錄起始的上游，而且可以牽涉識別和結合RNA聚合酶和其它蛋白質以啟動轉錄。“植物啟動子”可以是能夠在植物細胞中啟動轉錄的啟動子。在發育控制下的啟動子的例子包括優先在某些組織諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織中啟動轉錄的啟動子。此類啟動子稱為“組織優選性的”。僅在某些組織中啟動轉錄的啟動子稱為“組織特異性的”。“細胞類型”特異性啟動子主要在一種或多種器官中的某些細胞類型(例如根或葉中的維管細胞)中驅動表達。“誘導型”啟動子可以是可在環境控制下的啟動子。可招致誘導型啟動子轉錄的環境條件的例子包括缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優選性的、細胞類型特異性的、和誘導型啟動子構成“非組成性”啟動子類。“組成性”啟動子可以是可在大多數環境條件下有活性的啟動子。A.誘導型啟動子可以將誘導型啟動子與細胞中表達的基因可操作連接。任選地，可以將誘導型啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可以與用于在細胞中表達的基因可操作連接。通過誘導型啟動子，轉錄速率響應誘導劑而升高。可以在本發明中使用任何誘導型啟動子。參見Ward等，Plant Mol.Biol. 22:361-366(1993)。例示性誘導型啟動子包括但不限于:那些響應銅的ACEI系統的啟動子(Mett等，PNAS 90:4567-4571(1993));響應苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的 In2 基因(Hershey 等，Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)；和 Gatz 等，Mol. Gen.Genetics 243:32-38 (1994));和來自 TnlO 的 Tet 阻抑物(Gatz 等，Mol. Gen. Genetics227:229-237(1991))。特別有用的誘導型啟動子可以是響應植物正常不響應的誘導劑的啟動子。例示性誘導型啟動子可以是來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄活性可以受糖皮質激素誘導。Schena 等,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:0421 (1991)。B.組成性啟動子 將組成性啟動子與細胞中表達的基因可操作連接，或者可以將組成性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細胞中表達的基因可操作連接。可以在本發明中利用不同的組成性啟動子。例示性的組成性啟動子包括但不限于來自植物病毒的啟動子，諸如來自CaMV的35S啟動子(Odell等，Nature313:810-812(1985))和木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子(見例如美國專利7，053，205和6，664，384);來自稻肌動蛋白基因的啟動子(McElroy 等，Plant Cell 2:163-171(1990))；來自泛素的啟動子(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)，和 Christensen等，Plant Mol. Biol. 18:675-689(1992));來自 pEMU 的啟動子(Last 等，Theor. Appl.Genet. 81:581-588(1991));來自 MAS 的啟動子(Velten 等，EMBO J. 3:2723-2730 (1984))；和來自玉米 H3 組蛋白的啟動子(Lepetit 等，Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992)，和Atanassova 等，Plant Journal 2 (3) : 291-300 (1992))。ALS 啟動子，即歐洲油菜(Brassicanapus) ALS3結構基因5’的Xbal/Ncol片段(或與所述Xbal/Ncol片段相似的核苷酸序列)代表一種特別有用的組成性啟動子。參見PCT申請WO 96/30530。C.組織特異性或組織優選性啟動子可以將組織特異性啟動子與用于在細胞中表達的基因可操作連接。任選地，可以將組織特異性啟動子與編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號序列的核苷酸序列可以與用于在細胞中表達的基因可操作連接。用與組織特異性啟動子可操作連接的感興趣基因轉化的植物可以專門或優先在特定組織中生成轉基因的蛋白質產物。可以在本發明中利用任何組織特異性或組織優選性啟動子。例示性組織特異性或組織優選性啟動子包括但不限于根優選性啟動子，諸如來自菜豆蛋白基因的啟動子(Murai 等,Science 23:476-482 (1983)，和 Sengupta Gopalan 等,Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 82:3320-3324 (1985))；葉特異性和光誘導型啟動子，諸如來自cab或1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(rubisco)的啟動子(Simpson 等，EMBO J. 4 (11) : 2723-2729 (1985)，和Timko等，Nature 318:579-582(1985));花藥特異性啟動子，諸如來自LAT52的啟動子(Twell 等，Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989));花粉特異性啟動子，諸如來自 Zml3 的啟動子(Guerrero等，Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993))或小孢子優選性啟動子，諸如來自 apg 的啟動子(Twell 等，Sex. Plant Reprod. 6:217-224(1993))。可以通過將編碼信號序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質的基因的5’和/或3’區域的手段來實現由轉基因生成的蛋白質向亞細胞區室諸如葉綠體、液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環體、細胞壁或線粒體的轉運或者分泌入質外體中。可以在蛋白質合成和加工過程中測定在結構基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中編碼的蛋白質最后可以被區室化(compartmentalized)。或者,可以將此類亞細胞區室祀向性蛋白質與gamma-玉米醇溶蛋白直接連接以將用感興趣的分子引導至期望的亞細胞區室。信號序列的存在將多肽引導至胞內細胞器或亞細胞區室，或者分泌至質外體。許多信號序列是本領域中已知的。參見例如Becker等，PlantMol. Biol. 20:49 (1992), Close, P. S. , Masterj s Thesis, Iowa StateUniversity (1993), Knox,C.等,“Structure and Organization of Two DivergentAlpha-Amylase Genes from Barley，，，Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987), Lerner等,Plant Physiol. 91 : 124-129 (1989) , Fontes 等,Plant Cell3:483-496 (1991), Matsuoka 等,Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991), Gould 等,J. Cell.Biol.108:1657 (1989)，Creissen 等，Plant J.2:129 (1991)，Kalderon 等，A short aminoacid sequence able to specify nuclear location, Cell 39:499-509(1984)，Steifel等，Expression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene inearly leaf and root vascular differentiation, Plant Cell 2:785-793(1990)。外來蛋白質基因和農藝學基因 通過根據本發明的轉基因植物，可以以商業量生產外來蛋白質。如此，用于選擇和繁殖經轉化植物的技術(它們是本領域中充分了解的)產生多種轉基因植物，它們以常規方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來蛋白質。可以通過由例如Heney和Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)所討論的已知方法來實現從植物生物量的蛋白質提取。在本發明的各方面，為商業生產外來蛋白質提供的轉基因植物可以是細胞或植物。在其它方面，感興趣的生物量可以是種子。對于相對少數的顯示較高表達水平的轉基因植物，可以主要經由常規的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合DNA分子的近似染色體位置)來產生遺傳圖譜。關于這方面的例示性方法,參見Glick和Thompson, Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton 269:284(1993)。關于染色體位置的圖譜信息對于主題轉基因植物的所有權保護可以是有用的。如果可以進行未經授權的繁殖和與其它種質進行雜交，則可以將整合區域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進行比較以確定后者是否與主題植物具有共同親本(parentage)。圖譜比較會牽涉雜交、RFLP, PCR、SSR和測序，它們都是常規技術。同樣地，可以在經轉化的細胞或其后代中表達農藝學基因。更具體地，可以經由本發明的方法對植物進行遺傳工程化改造以表達農藝學感興趣的各種表型。可以在這方面使用的例示性基因包括但不限于下文進行歸類的基因。I.賦予對害蟲或疾病的抗性并編碼下列各項的基因A)植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)產物與病原體中相應無毒力(Avr)基因產物之間的特異性相互作用激活。可以用克隆的抗性基因轉化植物品種以工程化改造對特定病原體株有抗性的植物。參見例如Jones等，Science266:789(1994)(克隆對黃枝孢霉(Cladosporium fulvum)有抗性的番茄Cf_9基因)；Martin 等,Science 262:1432 (1993)(對丁香假單胞菌番爺致病變種(Pseudomonassyringae pv. tomato)有抗性的番爺Pto基因編碼蛋白質激酶)；Mindrinos等，Cell78:1089 (1994)(對丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)有抗性的擬南芥(Arabidops)RSP2基因)。B)賦予對害蟲諸如大豆胞囊線蟲有抗性的基因。參見例如PCT申請W096/30517 ；PCT 申請 WO 93/19181。C)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、其衍生物或以其為模型的合成多肽。參見例如Geiser等，Gene 48:109 (1986)，其披露了 Bt δ-內毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼S-內毒素基因的DNA分子可以購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection) ,Manassas,Va.,例如以ATCC保藏號40098、670136、31995 和 31998 購得。D)凝集素。參見例如 Van Damme 等，Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)的公開內容，其披露了數種君子蘭(Clivia miniata)甘露糖結合凝集素基因的核苷酸序列。E)維生素結合蛋白諸如抗生物素蛋白。參見PCT申請US93/06487。該申請教導了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對蟲害的殺幼蟲劑的用途。 F)酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe等，J. Biol. Chem. 262:16793 (1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列)，Huub等，Plant Molec. Biol. 21:985(1993)(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)，Sumitani 等,Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993)(硝抱鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus) alpha-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國專利號5，494，813 (Hepher和Atkinson, 1996 年 2 月 27 日公開)。G)昆蟲特異性激素或信息素，諸如蛻皮類固醇或保幼激素，其變體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或激動劑。參見例如Hammock等，Nature344:458 (1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達的內容。H)昆蟲特異性肽或神經肽，其在表達后破壞受到影響的害蟲的生理學。例如參見Regan, J. Biol. Chem. 269:9(1994)(表達克隆產生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)，和Pratt等,Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989)(可以在太平洋折翅爐(Diplopterapuntata)中鑒定出咽側體抑制素(allostatin))的公開內容。還可參見Tomalski等的美國專利號5，266，317，其披露了編碼昆蟲特異性、麻痹性神經毒素的基因。I)在自然界由蛇、黃蜂(wasp)或任何其它生物體生成的昆蟲特異性毒液。例如參見Pang等，Gene 116:165 (1992)，是關于編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達的公開內容。J)酶，其負責超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物或另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質分子。K)牽涉對生物學活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環化酶、轉氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、殼多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見以Scott等名義的PCT申請W093/02197，其披露了 callase基因的核苷酸序列。含有殼多糖酶編碼序列的DNA分子可以例如從ATCC以保藏號39637和67152獲得。還可參見Kramer等,Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)(其教導了編碼煙草天蛾殼多糖酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等，Plant Molec. Biol. 21:673(1993)(其提供了歐芹ubi4_2多聚泛素基因的核苷酸序列)。
L)刺激信號轉導的分子。例如參見Botella等，Plant Molec.Biol. 24:757 (1994)(關于綠豆I丐調蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPysiol. 104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內容。M)疏水矩妝(hydrophobic moment peptide)。參見 PCT 申請 WO 95/16776(抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公開內容)和PCT申請WO95/18855(教導了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N)膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等，PlantSci. 89:43 (1993)公開的殺菌肽-β 溶胞肽類似物(cecropin-β lytic peptide analog)的異源表達以使轉基因煙草植物對青枯假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性。0)病毒侵入蛋白或自其衍生的復合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經轉化植物細胞中的積累賦予對由可衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見Beachy等，Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)。已經對經轉化的植 物賦予了針對苜蓿花葉病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導的抗性。同上。P)昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體會使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見Taylor等，摘要號497，Seventh Int’ ISymposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland)(1994)(經由生成單鏈抗體片段進行的轉基因煙草中的酶促失活)。Q)病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等，Nature 366:469 (1993),其顯示了表達重組抗體基因的轉基因植物受到保護免于病毒攻擊。R)在自然界由病原體或寄生物生成的發育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。例如，真菌內a -I, 4_D_多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細胞壁同-a-1，4-D-半乳糖醒酸酶(galacturonase)來促進真菌定殖(colonization)和植物營養物釋放。參見Lamb等，Bio/Technology 10:1436(1992)。編碼豆內多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征可以由Toubart等，Plant J. 2:367(1992)描述。S)在自然界由植物生成的發育阻滯蛋白。例如Logemann等，Bio/Technology10:305(1992)顯示了表達大麥核糖體失活基因的轉基因植物對真菌疾病具有升高的抗性。2.賦予對除草劑的抗性的基因A)抑制生長點或分生組織的除草劑，諸如咪唑啉酮或磺酰脲。在這類中的例示性基因編碼突變的ALS和AHAS酶，如分另Ij由例如Lee等，EMBO J. 7:1241 (1988)和Miki等,Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)所描述的。B)草甘膦(分別由例如突變體5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSP)基因(經由導入重組核酸和/或天然EPSP基因的體內誘變的各種形式)、aroA基因和草甘膦乙酰基轉移酶(GAT)基因賦予的抗性)、其它膦酰基化合物諸如草銨膦(glufosinate)(來自鏈霉菌屬物種(Streptomycesspecies),包括吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和綠色產色鏈霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的草銨膦乙酰基轉移酶(PAT)基因)、和卩比唳氧基或苯氧基丙酸和環己酮(ACC酶抑制劑編碼基因)，見例如Shah等的美國專利No. 4，940, 835和Barry等的美國專利6，248，876，其披露了可以對植物賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變體aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏號39256獲得，并且突變體基因的核苷酸序列可以在Comai的美國專利No. 4，769，061中披露。Kumada等的歐洲專利申請No. O 333 033和Goodman等的美國專利No. 4，975，374披露了對除草劑諸如L-膦絲菌素(L-phophinothricin)賦予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以參見Leemans等的歐洲申請No. O 242 246, DeGreef等，Bio/Technology7:61(1989)描述了生成表達編碼PAT活性的嵌合bar基因的轉基因植物。賦予對苯氧基丙酸和環己酮，諸如稀禾定(sethoxydim)和卩比氟氯禾靈(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括 Marshall 等，Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)描述的 AcclSl、AcclS2 和 AcclS3 基因。能夠賦予草甘膦抗性的GAT基因記載于Castle等的WO 2005012515。賦予對2，4-D、苯氧基丙酸和卩比唳基氧基生長素除草劑的抗性的基因記載于歸于Dow AgroSciencesLLC的WO 2005107437。C)抑制光合作用的除草劑，諸如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3:169(1991)描述了用編碼突變的psbA基因的質粒轉化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國專利號4,810, 648，并且含有這些基因的DNA分子可以以ATCC保藏號53435、67441、和67442獲得。 編碼谷胱甘肽S-轉移酶的DNA的克隆和表達可以由Hayes等，Biochem. J. 285:173(1992)描述。3.賦予或促成增值(value-added)性狀的基因,諸如A)經修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉化植物以提高植物的硬脂酸含量。參見Knultzon等，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 89:2624(1992)。B)降低的肌醇六磷酸鹽含量——I)肌醇六磷酸酶編碼基因的導入會增強肌醇六磷酸鹽的分解，向經轉化的植物添加更多游離的磷酸鹽。例如，參見Van Hartingsveldt等，Gene 127:87 (1993),關于黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內容。2)可以導入降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。例如在玉米中，這可以如下實現，即克隆與單一等位基因有關的DNA，然后再次導入，所述單一等位基因可以負責特征為低水平肌醇六磷酸的玉米突變體。參見Raboy等，Maydica 35:383(1990)。C)例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉化植物來實現的經修飾的碳水化合物組成。參見 Shiroza 等，J. Bacteol. 170:810 (1988)(鏈球菌(Streptococcus)突變體果糖基轉移酶基因的核苷酸序列),Steinmetz等，Mol. Gen. Genet. 20:220(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的核苷酸序列可以是果聚糖鹿糖酶(Ievansucrase)基因)，Pen 等，Bio/Technology 10:292 (1992)(表達地衣芽胞桿菌(Bacillus lichenifonn)α-淀粉酶的轉基因植物的生成)，Elliot等，Plant Molec. Biol. 21:515 (1993)(番茄轉化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等，J. Biol. Chem. 268:22480 (1993)(定點誘變可以是大麥α-淀粉酶基因的)，和Fisher等，Plant Physiol. 102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶 II)。在本發明的具體實施方案中，可以將gamma玉米醇溶蛋白與納米顆粒融合。可以將納米顆粒的表面官能化，其可以例如容許靶向攝取或者容許將其它物質可逆或不可逆結合至納米顆粒表面。作為非限制性例子，可以用例如烷烴硫醇鹽(alkanethiolate)的自身裝配單層官能化納米顆粒(例如，金納米顆粒或量子點)的表面，所述烷烴硫醇鹽可以進一步官能化或衍生物。在又一個非限制性例子中，可以用接頭衍生化納米顆粒的表面，所述接頭自身可以進一步官能化或衍生物。在一個實施方案中，可以將納米顆粒進行PEG化。在其它實施方案中，納米顆粒可以包含下列一種或多種，或者可以用下列一種或多種多官能化核心(活性或無活性)、空間外層(steric coat)(活性或惰性)、可切割連接和/或祀向分子或配體。納米顆粒可以選自金納米顆粒、金包被的納米顆粒、多孔性納米顆粒、中孔性納米顆粒、娃土納米顆粒、聚合物納米顆粒、鶴納米顆粒、明膠納米顆粒、納米殼(nanoshell)、納米核心(nanocore)、納米球(nanosphere)、納米棒(nanorod)、磁性納米顆粒及其組合。同樣地，在本發明的具體實施方案中，可以將ga_a玉米醇溶蛋白與量子點融合。在本發明的各方面中，可以將g amma玉米醇溶蛋白和納米顆粒攝取入細胞的各個部分中。可以攝取納米顆粒的位置的例子包括但不限于胞質溶膠、細胞核、液泡形成體、質體、黃化質體、色質體、白色體、油質體、蛋白質體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。在本發明的其它實施方案中，攝取入包含細胞壁的細胞中的納米顆粒可以經由共質體或質外體途徑發生。在本發明的其它方面中，可以將ga_aS米醇溶蛋白和量子點攝取入細胞的前述各部分中。
實施例本發明在以下實施例中進一步描述，所述實施例作為例示提供，而并不意圖以任何方式限制本發明。實施例Igamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白的構建將編碼蛋白質gamma-玉米醇溶蛋白(GenBank登錄號#AAL16977. 1，GI: 16305109)的修飾的玉蜀黍N-端區的DNA序列與Philadium黃色突光蛋白(YFP) (Evrogen, Moscow,Russia)的N端融合。修飾6個氨基酸的gamma-玉米醇溶蛋白基序,其中將第二個殘基從組氨酸改變成精氨酸。進行此修飾以將融合序列引導至細胞核。已經顯示了精氨酸改善蛋白質易位入細胞的胞質溶膠和細胞核中的效率。(Mitchell，等，(2000)，The Journal ofPeptide Research, 56(5) : 318-325)。將gamma-玉米醇溶蛋白的N-端區的經修飾的6個氨基酸(VRLPPP)的三聚體與YFP融合。另外，將6x-His標簽在gamma-玉米醇溶蛋白三聚體和YFP編碼序列間放置。添加6x-His基序以便于蛋白質純化。此融合蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO: I呈現。融合基因序列(SEQ ID NO:2)經由自動化DNA合成儀使用亞磷酰胺化學以化學方式合成。此序列的化學合成外包給DNA2. O(Menlc) Park，CA)。使用DNA2. O專有算法將序列進行密碼子優化以在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達，從而生成“大腸桿菌優化的”核苷酸序列。該算法鑒定在期望的宿主生物體內不頻繁使用的密碼子，并用更頻繁使用的密碼子替換這些密碼子。另外，該算法除去順式調節序列(例如RNA酶位點、RNA 二級結構、轉錄終止位點)和過多的限制酶。將額外的序列添加至ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合基因的末端以便于克隆和表達。將 Shine-Dalgarno 序列(Shine J, Dalgarno L (1975). Nature254(5495) :34 - 8.)和獨特的SpeI限制酶位點添加至基因序列的5，端。將獨特的XhoI限制酶位點添加至基因序列的3’端。將所得的載體標記為pJ201:18056(圖I)。
I. IpET表達載體的構建經由標準克隆技術將gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合序列克隆入大腸桿菌表達載體 pET280 中。pET280 是 pET28 質粒的一種改良型式(Novagen, Gibbstown, NJ)。自 pET28除去多克隆位點和核糖體結合位點，由此創建PET280。將含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP編碼序列的SpeI-XhoI片段自pJ201:18056載體切出，并連接入pET280表達載體的相應限制位點中。經由限制酶消化和測序確認所得的質粒。將質粒轉化入BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。將單菌落分離并以甘油儲液忙存，直至進一步使用。I. 2Gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白的表達和分離使用以下條件誘導gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白將含有pET280/gamma-玉米醇溶蛋白/YFP表達構建體的培養物在2升(L) Luria-Bertani培養基和50 μ g/ml卡那霉素中于25° (培養至0.0.6(|(|為0.6。在達到期望的0.0.6(|(|后，用0.1禮IPTG(異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷)于25° C將培養物誘導16小時。 分離并純化表達的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白。將2L細胞培養物以24，OOOxg離心10分鐘，并棄去上清液。將5g含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的細胞漿在PBS中的IOOml冷提取溶液(O. 5M NaCl,5%甘油和O. 5mlSigma蛋白酶抑制劑混合物(產品目錄編號# 8849)中重懸)。使用超聲處理(Branson Sonifier 450型)在冰上破壞細胞達15分鐘。將樣品于4° C以24，OOOx g離心20分鐘，并將上清液過濾通過
O.45 μ m]V1inipore''〈過濾裝置。將咪唑以終濃度IOmM添加至樣品。使用Akt Explorer100系統(GE’ Pharmacia)將含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP的溶胞物以5ml/分鐘加載到串聯的2x 5mlHisTrap 柱(GE/Pharmacia，產品目錄編號#17-5248-02)上。用緩沖液A (PBS中的IOmM咪唑，O. 5M NaCl)清洗柱，直至A280的吸光度達到基線。然后，用10%和20%緩沖液B(緩沖液A中的O. 2M咪唑)以約4x柱體積(CV)的體積序貫清洗柱。在10-15個CV里用20-100%緩沖液B洗脫樣品，并收集4ml級分(圖2)。L3SDS-PAGE 分析將蛋白質凝膠運行以顯現分級的蛋白質。使用XCellSureLock Mini-Cell (Invitrogen,產品目錄編號#EI0001)將10-20 μ I每份樣品加載到預制的10%Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(Invitrogen,產品目錄編號#NP0302B0X)上以進行電泳。將樣品以200V在MES-SDS運行緩沖液(Invitrogen,產品目錄編號#NP0002)中運行35分鐘。用考馬斯藍R-250 (Bio-Rad,產品目錄編號#161-0436)染色凝膠，如圖3中顯示的。將含有gamma-玉米醇溶蛋白/YFP樣品的級分合并，并轉移入具有IOkDa MWCO的Millipore旋轉柱中，并使用臺上式Eppendorf離心機(5810R型)以4，OOOrpm于4° C離心20分鐘。離心后，將無菌PBS溶液添加多至15ml以進行緩沖液更換。將此旋轉和滲濾方法重復三次。將合并的gamma-玉米醇溶蛋白/YFP樣品轉移入具有IOkDa MWCO的SnakeSkin 打褶式(pleated)透析管道(Thermo Scientific,產品目錄編號#68100)中，并于4° C針對2LPBS透析過夜以除去咪唑殘留。使用Bradford測定法(Bio-Rad,產品目錄編號#500-0006)用牛血清清蛋白(BSA)標準品測定蛋白質濃度(圖3)。I. 4Maldi-TPF肽質量指紋法將來自SDS-PAGE凝膠的Iyg蛋白質條帶(約I Ug)切出，并在Speed-Vac中在具有12. 5mM碳酸氫銨的25%乙腈中干燥。在過夜溫育期間于37° C通過胰蛋白酶(12. 5ng/μ I)消化蛋白質。使用C18Zip Tip(Millipore,產品目錄編號#2TC18S096)循環制造商的用法說明書純化肽。使用Voyager活組織分光度測量術(PerSeptive Biosystems, DESTR型)實施質譜分析，并以陽離子反射器模式收集質譜(圖4)。將數據輸入分析程序PAWS (Proteometrics Inc.)中以搜索妝身份。實施例2單細胞植物材料的制備2. IJTNTl 細胞JTNTl細胞是自煙草分離的光合自養細胞。轉化前3至4天，通過將2mlJTNl細胞 轉移入250ml燒瓶中含有50nM DAS-PMTI-I (微管抑制劑)和O. 5-0. l%(v/v) DMSO的40mlNTlB或LSBY2培養基中將懸浮培養物傳代培養至新鮮培養基。在微管抑制劑處理后第4天或第7天時收集單細胞(如記載于例如WO 2008/083233的)。將細胞在極限培養基和5%二氧化碳中維持。通過轉移Iml O. D. _3. O的懸浮液將細胞每14天傳代培養一次。使用這些細胞類型作為祀細胞以遞送并定位ga_a-玉米醇溶蛋白/YFP融合肽。2. 2胡蘿卜細胞將可再生的胡蘿卜冷藏系(D2-40-018)融化，并在Linsmeier-Skoog(LS)培養基(記載于 Nagata, T.，Nemoto, Y.和 Hasezawa, S. (1992) Int. Rev. Cyto 132,1-30)中培養。培養基鹽購自PhytoTechnology Laboratories,產品目錄編碼#L689。將活躍生長的懸浮系在一周內建立，并通過將2ml PCV(壓緊細胞體積)轉移至58ml LSBY2懸浮20培養基于28。C在軌道搖動器(Innova-3300)上以125rpm在漫射光下按7天培養周期傳代培養維持系。對于單細胞生成，將ImlPCV的穩定期的胡蘿卜懸浮液添加入30ml具有ImM秋水仙素(Sigma，產品目錄編號#C3915)的LS懸浮培養基中，并培養7天。自3_7天培養物生成單細胞，并將其準備好進行轉化實驗。可以通過添加60ml新鮮的LS BY2液體培養基通過在第14天時稀釋培養物將胡蘿卜的單細胞于穩定期維持多至28天。實施例3用gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白處理細胞用15yg Hoechst于37° C將細胞預先染色10分鐘。在溫育期后，除去過量的染料。將細胞以4000rpm離心5分鐘，并棄去上清液。用含有3%蔗糖的ImlPBS溶液將細胞
清洗二次。將gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白以50 μ M濃度添加至eppendorf管內的Iml胡蘿卜單細胞或JTNTl細胞。將管以IOOrpm于25。C放置于搖動器上達60分鐘。實施例4植物細胞內gamma-玉米醇溶蛋白/YFP融合蛋白積累在10分鐘、30分鐘和60分鐘時取出100 μ I融合蛋白/細胞混合物的等分試樣以進行成像。將細胞以5，OOOrpm離心5分鐘，并用PBS清洗三次。最后，將細胞在100 μ IPBS中重懸。監測融合肽內在化并定位入植物細胞和組織的亞細胞區室中的效率。將細胞在LSM-Leica TCS SP2/UV或Zeiss LSM上成像。使用高數值孔徑(I. 2-1. 3)水浸物鏡(63x)和來自氬離子以激發YFP的488nm或514nm激光線。
分別使用405nm和488nm激光用430_480nm和LP560nm濾光器捕捉共焦和微分干涉相差(DIC)圖像。顯示gamma-玉米醇溶蛋白黃色熒光信號在10分鐘后定位于胡蘿卜和JTNTl單細胞兩者的核仁和胞質(在圖5中顯示)。實施例5在植物中，通過浸花法(floral dip)用肽和質粒DNA轉化擬南芥(Arabidopsis)將純化的gamma-玉米醇溶蛋白肽與質粒DNA pDAB3831 (在圖6中顯示)混合。將
O.25mg gamma-玉米醇溶蛋白肽添加至.5mg質粒DNA,并在水中溫育30分鐘以形成肽/DNA復合物。PDAB3831含有由擬南芥泛素10啟動子(AtUbilO)驅動的PAT選擇標志基因和由木薯葉脈花葉病毒啟動子(CsVMV)驅動的Philadium黃色熒光蛋白基因(PhiYFP)。對擬南芥哥倫比亞栽培種(Arabidopsis thaliana cv Columbia)的4周齡花芽施用gamma-玉米醇溶蛋白肽/pDAB3831復合物和僅pDAB3831質粒DNA的不同對照實驗。將20mL肽/DNA復合物和20ml DNA對照在玻璃槽中與滲透培養基(5%蔗糖和O. 04%Silwet-77)混合30秒。使用改良的Clough和Bent方案使用含有肽/DNA溶液的滲透培養基來轉化擬南芥植物(Clough SJ和Bent AF, 1998. Plant J16:735-43) 在浸潰后，將滲透復合物于4° C貯存，隨后在兩天后使用相同方案用于浸潰相同植物。完成重復轉化步驟以提高轉化頻率。通過塑料罩覆蓋植物以維持濕度達24小時。在24小時后，將罩除去，并將植物在ConvilOn (CMP4030 和 CMP3244 型，Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada)中在長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)下以120-150 μ mol/m2/sec的光強度在恒定的溫度(22° C)和濕度(40-50%)下正常培養，并容許成熟并生成種子。將TO種子收集并滅菌。另外，將種子于4° C春化2天。為了選擇陽性轉化體，將種子在含·有 10 μ g/ml BASTA 的 MS 培養基(0. 43%Murashige 和 Skoog 鹽混合物、2. 5mM 2-[N-嗎啉代]乙磺酸、IxGamborg氏維生素溶液、0. 9%細菌用瓊脂，pH 5.7-5.9)上分配，并在培養箱(22° C，100 μ mole量子m-2s_l)中培養7_10天。將推定的轉化體鑒定，并轉移至土壤，并培養至成熟。實施例6轉基因PAT和YFP的分子分析使用植物DNAZOL試劑盒(Invitrogen Inc)自6周齡植物的葉材料提取來自擬南芥轉基因植物的gDNA和來自擬南芥生態型哥倫比亞野生型對照的gDNA。僅自轉基因植物PCR擴增PAT和YFP基因片段。50 μ L PCR反應混合物含有IOOng模板DNA、Ix ExTaq反應緩沖液(TaKaRa Bio)、0· 2mM dNTP、IOpmol 每種引物和 0. 025 個單位 / μ L ExTaq0 YFP引物以 SEQ ID Ν0:3 和 SEQ ID Ν0:4 顯示。PAT 引物以 SEQ ID Ν0:5 和 SEQ ID Ν0:6 顯示。使用下列PCR循環條件于96° C持續5分鐘的I個循環，下列PCR程序的31個循環94° C，15秒；65° C，30秒；72° C，I分鐘，并于72° C實施最終延長達7分鐘以完成產物合成。使用QIAquick 凝膠提取試劑盒(Qiagen Inc)凝固純化擴增的片斷。使用PAT正向引物(SEQ ID NO:5)和YFP正向引物(SEQ ID NO:3)使用先進的Sanger測序技術(MWGBiotechnologies, Inc)使用 PAT 正向引物(SEQ ID NO:5)和 YFP 正向引物(SEQ ID NO:3)測序PCR片段，并使用Sequencher 軟件分析序列。實施例7鑒定同源基序和誘變Gamma-玉米醇溶蛋白序列以實現改善的蛋白質易位效率
將與gamma-玉米醇溶蛋白域同源的其它基序鑒定，并測試胞內蛋白質易位。自目前的公共數據庫，諸如NCBI (國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information))鑒定這些序列。使用gamma-玉米醇溶蛋白序列作為輸入以進行 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul 等，1997)算法。使用缺省設置，針對存放的NCBI蛋白質序列比較所述序列。搜索返回幾種同源蛋白質序列。將鑒定的gamma-玉米醇溶蛋白基序修飾為增強胞內蛋白質易位的效率。經由定點誘變方案改變VRLPPP序列的多個殘基。使用上文所描述的方案，使用經修飾的gamma-玉米醇溶蛋白序列將蛋白質和DNA遞送入植物細胞中。 實施例8使用嵌合Ga_a-玉米醇溶蛋白序列靶向細胞細胞器進行其他實驗以測試經由嵌合gamma-玉米醇溶蛋白/細胞細胞器靶向基序對細胞細胞器進行肽靶向。在一個具體的例子中，將ga_a-玉米醇溶蛋白和葉綠體靶向序列與熒光蛋白，諸如YFP的N端融合。經由熒光顯微術成像YFP蛋白質對葉綠體的靶向。將本領域中已知的各種其它細胞細胞器(例如，線粒體、內質網、細胞核等)的其它靶向序列與gamma-玉米醇溶蛋白序列一起融合，并用于靶向特定的細胞細胞器。將蛋白質或DNA靶向至鑒定的細胞細胞器。雖然本發明已經在某些實施方案中進行了描述，但是可以在本公開內容的精神和范圍內進一步修飾本發明。因此，本申請意圖覆蓋本發明使用其一般原理的任何變型、用途、或改編。此外，本申請意圖覆蓋諸如在本發明所屬領域中的已知或習慣實踐內和落入所附權利要求書及其等同方案的限定內的本公開內容的偏離。
權利要求
1.一種將感興趣的分子導入具有細胞壁的植物細胞中的方法，該方法包括 提供具有細胞壁的植物細胞； 將gamma-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構； 將所述具有細胞壁的細胞和所述ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構置于彼此接觸中；并 容許將所述ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構攝取入所述具有細胞壁的細胞中。
2.依照權利要求I的方法，其中將gamma-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的分子相互作用包括將所述感興趣的分子與所述gamma-玉米醇溶蛋白肽融合。
3.依照權利要求I的方法，其進一步包括容許將所述gamma-玉米醇溶蛋白連接結構攝取入包含細胞壁的植物細胞的區室中。
4.依照權利要求3的方法，其中所述區室選自下組胞質溶膠、細胞核、液泡形成體、質體、黃化質體、色質體、白色體、油質體、蛋白質體、造粉體、葉綠體、和雙層膜的腔。
5.依照權利要求I的方法，其中所述包含細胞壁的植物細胞選自下組煙草、胡蘿卜、玉米、蕓苔(canola)、油菜籽(rapeseed)、棉花、棕櫚、花生、大豆、稻屬物種(Oryza sp.)、擬南芥屬物種(Arabidopsis sp.)、蓖麻屬物種(Ricinus sp.)、和甘鹿細胞。
6.依照權利要求I的方法，其中所述植物細胞來自選自下組的組織胚、分生組織、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果和莖。
7.依照權利要求I的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
8.依照權利要求I的方法，其中所述感興趣的分子包括選自下組的組分核酸、DNA、RNA、RNAi分子、基因、質粒、粘粒、YAC、BAC、多肽、酶、激素、糖肽、糖、脂肪、信號傳導肽、抗體、維生素、信使、第二信使、氨基酸、cAMP、藥物、除草劑、殺真菌劑、抗生素、及其組合。
9.依照權利要求8的方法，其中所述感興趣的分子包含基因。
10.依照權利要求9的方法，其中所述基因是外來蛋白質基因、農學基因、或標志物基因。
11.依照權利要求9的方法，其進一步包括選擇已經穩定整合所述基因的細胞。
12.依照權利要求11的方法，其中選擇的細胞是可再生細胞。
13.依照權利要求12的方法，其進一步包括自所述可再生細胞再生能育植物。
14.一種表達基因的方法,該方法包括 提供具有細胞壁的植物細胞； 將gamma-玉米醇溶蛋白肽與基因相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構； 將所述具有細胞壁的植物細胞和所述ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構置于彼此接觸中； 容許將所述gamma-玉米醇溶蛋白肽和所述基因攝取入所述包含細胞壁的植物細胞中；并 在具有所述植物細胞的植物的后代中表達所述基因。
15.依照權利要求14的方法，其中所述基因在葉綠體中表達。
16.依照權利要求14的方法，其進一步包括選擇穩定表達所述基因的細胞。
17.依照權利要求14的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
18.一種用于將分子物質轉移入植物細胞中的方法，包括將gamma-玉米醇溶蛋白肽與質粒DNA相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構；并 在容許將所述gamma-玉米醇溶蛋白肽和來自所述質粒DNA的基因攝取入所述植物細胞中的條件下使所述ga_a-玉米醇溶蛋白連接結構與攜帶完整壁的植物細胞接觸。
19.權利要求18的方法，其進一步包括在具有所述植物細胞的植物的后代中穩定表達所述基因。
20.依照權利要求18的方法，其中所述gamma-玉米醇溶蛋白肽包含SEQID NO I。
全文摘要
一種將感興趣的分子導入具有細胞壁的植物細胞中的方法包括將gamma-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接結構。然后，將gamma玉米醇溶蛋白連接結構置于與具有細胞壁的植物細胞的接觸中，并容許將gamma玉米醇溶蛋白連接結構攝取入植物細胞中。或者，可以在具有完整細胞壁的植物細胞中表達感興趣的基因，其通過將gamma-玉米醇溶蛋白肽與感興趣的分子相互作用以形成gamma-玉米醇溶蛋白連接基因結構，容許將gamma玉米醇溶蛋白連接基因結構攝取入植物細胞中，并在植物細胞及其后代中表達感興趣的基因。
文檔編號C12N15/29GK102933073SQ201180027026
公開日2013年2月13日 申請日期2011年3月8日 優先權日2010年3月31日
發明者N.C.薩姆伯朱, J.P.薩繆爾, G.林, S.R.韋布, F.G.伯勞格斯 申請人:陶氏益農公司