展示抗體的方法
【專利摘要】本方面公開了載體設計、構建和構建展示抗體的抗體庫的方法，所述抗體例如全長免疫球蛋白、單鏈抗體(SCA)scFv、或Fab于寄主細胞表面的抗體。本發明也公開了為選擇性的抗體目標而從上述抗體庫中分離出想要的抗體結合者的篩選方法。
【專利說明】展示抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發明公開提供載體的設計，構建和構建展示抗體，比如全長免疫球蛋白類，單鏈抗體（SCA) scFv，或Fab于寄主細胞表面的抗體庫的方法。本發明也提供為選擇性的抗體目標從上述的抗體庫中分離想要的抗體結合者的篩選方法。
【背景技術】
[0002]抗體是有價值的，在各種分子生物學過程用作治療劑和一般試劑。現有生產多克隆和單克隆抗體的方法，如許多抗體。許多基本文獻描述標準的抗體生產過程，包括：Borrebaeck StJAntibody Engineering, 2nd Edition Freeman and Company, NY, 1995 ；McCaffertyAntibody Engineering, A Practical Approach IRL at OxfordPress, Oxford, England, 1996 矛口 Paul (1995) StJ Antibody Engineering Pro toco IsHumana Press, Towata, NJ, 1995 ；Paul (ed.)的 Fundamental Immunology, RavenPress, N. Y, 1993; Coligan (1991) 該]Current Pro toco Is in Immunology ffiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold SpringHarbor Press, NY; Stites 等人(eds. ) Basic and Clinical Immunology (4th ed.)Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.,并在此引用作為參考；CodingMonoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed. ) Academic Press, NewYork, NY, 1986，以及 Kohler and Milstein 艙iare 256: 495-497，1975。
[0003]自然產生的抗體，或免疫球蛋白（Igs)，包括四條基本的多肽鏈結構，所述多肽鏈結構包括兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，所述重鏈和輕鏈通過鏈內和鏈間的二硫鍵穩定和橫向連接。不同的抗體類型該四鏈結構的變異體，每條重鏈在其N端包括一個可變區域，其后有多個恒定區域。每條輕鏈在其N端具有一個可變區域并在其C端具有一個恒定區域。因為最大數量的序列變異集中在輕鏈和重鏈的N端區域；每個這些區域被稱為可變(V)區域(或“V區”）。恒定區域組成恒定區，恒定區包括剩下的分子并呈現相對小的序列變化。重鏈包括五種主要的類型,取決于抗體的類型,并由大約450-600氨基酸殘基組成。輕鏈有兩種主要的類型并具有大約230個氨基酸殘基。重鏈和輕鏈都折疊成區域，包括球狀多肽區。
[0004]抗體通常包括兩條大的重鏈和兩條小的輕鏈。有五種類型的哺乳動物免疫球蛋白重鏈。它們由希臘字母表示：α，δ, ε, Υ和μ。目前重鏈的類型定義抗體的種類-IgA, IgD, IgE, IgG和IgM。每條重鏈包括恒定區和可變區。有兩種類型的輕鏈-lambda(λ)和kappa (K)。每條輕鏈包括恒定區和可變區。所有相同的同種型抗體的恒定區是相同的。不同的B細胞產生的抗體的可變區不同，但單個B細胞產生的所有的抗體的可變區是相同的。
[0005] 抗體結合抗原的部分(抗原結合位點）包含在Fab (片段，抗原結合）區中。Fab區由（a)重鏈的恒定和可變區域，和（b)輕鏈恒定和可變區域組成，可變區域稱為FV區。輕鏈可變區域縮寫為VL。重鏈可變區域縮寫為VH。[0006]抗體調節免疫細胞活性的部分被稱為Fe (片段，結晶)區。Fe區由兩條重鏈的恒定區組成。
[0007]在抗體中，輕鏈的可變區域與重鏈的可變區域對齊；輕鏈的恒定區域與重鏈的第ー恒定區域對齊。每對輕鏈和重鏈的可變區域形成抗原結合位點，抗原結合位點使抗體結合至抗原的表位。輕鏈和重鏈的恒定區域不直接參與抗原結合。每個重鏈或輕鏈可變區域包括四個相對保守的骨架(FR)區(或骨架片段)，骨架區通過3個高變區或互補決定區(CDRs)分開和連接。互補決定區被認為使抗體接觸目標抗原并主要負責抗體與抗原的結
[0008]骨架區和CDRs 已經定義。(Kabat 等人，SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICALINTEREST, U.S.Dept.Health and Human Services, NationalInstitutes of Health, USA (5th ed.1991);和 Wu 等人，J.Ex0.Med.132:211-250(1970)，在此為了全部目的引用全文作為參考。對于可變區域的結構的其它討論，參見Poljak 等人，Proc.Natl.Acad Sc1.USA, 70:3305-3310，1973; Segal 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 71:4298-4302，1974;和Marquart 等人，J.Mol.Biol., 141，369-391，1980，在此為了全部目的引用全文作為參考。同一物種內，不同的輕鏈或重鏈的骨架區的序列相對保守。結合的抗體的重鏈和輕鏈骨架區為適當地結合抗原提供空間并對齊 CDRs。
[0009]可變區域的CD Rs的氨基酸最初基于序列多變性而定義，由人重鏈可變區域(VH)的氨基酸殘基31-35 (Hl)，50-65 (H2)以及95-102 (H3)和人輕鏈可變區域(VL)的氨基酸殘基24-34 (LI), 50-56 (L2)以及89-97 (L3)組成，抗體的氨基酸殘基使用Kabat編碼系統。(Kabat 等人，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, U.S.Dept.Health and Human Services, NIH, USA (5th ed.1991).Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917, 1987)展示了 CDRs的另ー種定義，該定義基于包含在可變區的三維結構環中的殘基，這些殘基在抗原結合活性方面是重要的。Chothia和Lesk定義⑶Rs為由人重鏈可變區域(VH)的氨基酸殘基26-32 (HI), 53-55 (H2)以及96-101 (H3)和人輕鏈可變區域(VL)的氨基酸殘基26-32 (LI), 50-52 (L2)以及91-96 (L3)組成。結合Kabat與Chothia和Lesk對Q)R的定義，基于Kabat編碼系統，Q)Rs由人VH的氨基酸殘基 26-35 (Hl), 50-65 (H2)和 95-102 (H3)和人 VL 的氨基酸殘基 24-34 (LI), 50-56(L2)和 89-97 (L3)組成。
[0010]V基因編碼V區域N端大約95個氨基酸。每個基因座中V基因的數目在基因座和物種之間變化，但可能包括大約多達幾百個V基因。
[0011]抗體重鏈V區域包括V基因，D (多祥性)基因和J (結合)基因。抗體可變區域大的多祥性部分是源于V，D和J基因片段之間的重組。為了生產編碼重鏈可變區域的基因，任何ー個重鏈可變區域的基因與小數目的D和J基因中的任何一個重組以生產VDJ基因。除了由于輕鏈可變區域沒有D基因片段，V基因直接與J基因重組之外，輕鏈可變區域的重組過程是相似的。
[0012]就抗體庫而言，一般來說，這些庫已開始小鼠庫的初歩篩選以在其重鏈和輕鏈可變區內找到具有理想的結合親和力的小鼠抗體，也稱為Fab區。但是，這種小鼠抗體對人的治療沒有用，因為服用鼠源抗體會導致寄主的免疫反應或排斥反應。[0013]美國專利5，869，619公開了一種降低抗體可變區域的免疫原性，同時保留抗體的配體結合特性的可能的過程，在該過程中人殘基典型地代替小鼠可變區域殘基，該小鼠可變區域殘基被確定或預測為：（i)在與抗原的相互作用中，不具有重要的化學作用；以及
(ii)被定位為其側鏈伸向溶劑中。因此，遠離抗原結合位點的表面殘基是人源的，而內部殘基，抗原結合殘基以及形成可變區域之間的連接的殘基依然是小鼠的。這種方法的一個弊端是需要相當全面的實驗數據以確定殘基是否在抗原結合方面不具有重要的化學作用或在具體的三維抗體結構中位于溶劑中。
[0014]在美國專利5，225，539 (Winter I)中，被認為保守的小鼠可變區域肽序列的連續片段用人抗體的相應片段代替。在這個更常規的方法中，除了涉及抗原結合的非保守區外，可變區域殘基被人源化。為了確定合適的用于替代的連續的片段，使用Wu和Kabat(1970)之前開發的抗體可變區域序列的分類法。
[0015]使用Kabat分類法的Winter I人源化方法獲得嵌合抗體,嵌合抗體包括一個抗體的CDRs和另一個在種源，特異性，亞種或其它特性上不同的抗體的骨架區。但是，骨架區沒有具體的序列或特性，Winter I教導任何一組骨架能與任何一組⑶Rs結合。骨架序列此后被認為對賦予抗體可變區的三維結構是重要的，該三維結構對于為保持好的抗原結合是必須的。因此，Winter I描述的常規的人源化方法具有頻繁導致抗體滅活的弊端，因為這些參考文獻不提供需要在許多可能的人骨架序列中理性選擇的信息，那些人骨架序列很可能支撐來自非人源抗體的特定CDR區所需要的抗原結合 。
[0016]美國專利5,693,761 (Queen)公開了在Winter I基礎上對人源化抗體的改良，并基于把親和力降低歸于人源化骨架中結構基序的問題，該問題在小鼠抗體發現，是由于空間或其它化學不相容，干擾CDRs折疊成能結合的構象。為了解決這個問題,Queen教導使用人骨架序列在線性肽序列上與將要人源化的鼠抗體的骨架序列密切同源。因此，Queen的方法重點在于比較物種間的骨架序列。通常，所有現有的人可變區域序列都與具體的鼠序列比對，并計算相應的骨架殘基之間的百分比一致性。選擇具有最高百分比的人可變區為人源化項目提供骨架序列。Queen也教導保留人源骨架是重要的，來自鼠源骨架的某些氨基酸殘基對支撐CDRs能結合的構象是至關重要的。由分子模型評估潛在的重要性。保留的候選殘基一般是那些在線性序列中鄰近⑶R或物理上在任何⑶R殘基6 A內的。
[0017]U.S.專利5，821，337和5，859，205公開了另一個分辨骨架序列的氨基酸的重要性的實施例方法。這些參考文獻公開了骨架中具體的Kabate殘基的位置，該殘基在人源抗體中可能需要用相應的鼠源氨基酸代替以保持親和力。Queen改良的一個弊端及其它是比對需要非常大量的人源骨架序列，和/或保留重要的氨基酸殘基的準則不足以預測功能。因此，構建得到的，部分是人和部分是鼠的骨架依然頻繁呈現出人免疫原性或較低的抗原結合活性，從而需要骨架構建的大量重復從而獲得合適的骨架以作治療之用。
[0018]人源抗體一般通過用人對應物替換對抗原特異性不重要的鼠抗體區制備。得到的人源抗體具有殘留的鼠源序列，當人患者服用抗體時，殘留的鼠源序列通常在患者體內誘導免疫反應(人抗-鼠反應)。因此，制備沒有非人序列的全人抗體是受歡迎的。全人抗體已經有報道，通過如下方法獲得，例如：用噬菌體展示技術構建和篩選的人抗體；通過將來自免疫的人供體的淋巴細胞移植到重度聯合免疫缺陷（SCID)小鼠；或通過改造包含人免疫球基因的轉基因小鼠（van Dijk等，2001)。但是，已經獲得的這些全人庫的多樣性最多大約101°個。因此，本領域對達到更高多祥性的全人抗體展示庫有強烈的要求。
[0019]針對病原體的全人抗體也已經通過大范圍的臍帶血篩選分離出來,全人抗體包含天然聚活性IgM譜(美國專利6，391，635)。但是，這些方法生產的抗體具有低的親和力，或根據人供體具有預期的免疫反應。
[0020]已經開發各種不依賴于抗原注入動物內的抗體制備的重組技術。例如，可能在噬菌體或相似的載體中生成并選擇重組抗體的庫(Winter等人."Making Antibodies byPhage Display Technology" Ann.Rev.Tmmuno/.12:433-55，1994)。卩遼菌體抗體庫也已經產生，通過鏈置換制備高親和カ的人抗體(Marks等人，Biotechniques 10:779-782,1992)。
[0021]一般而言，庫包括V基因譜(例如，從淋巴細胞群中獲得或在體外組裝)，克隆的V基因用于將相關的重鏈和輕鏈可變區域展示于絲狀噬菌體的表面。通過結合至抗原選擇噬菌體。感染細菌的噬菌體表達可溶的抗體并且該抗體能被改進，比如,通過誘變。
[0022]雖然已經建立了通過制備，篩選和純化抗體生產抗體的方法，但是全面形成具有較高多祥性的人抗體庫是受人歡迎的。
[0023]抗體通常包括兩條大的重鏈和兩條小的輕鏈。有五種類型的哺乳動物免疫球蛋白重鏈。它們由希臘字母表示:a，6, e, Y和y。目前重鏈的類型定義抗體的種類-1gA, IgD, IgE, IgG和IgM。每條重鏈包括恒定區和可變區。有兩種類型的輕鏈-lambda(A)和kappa (K)。每條輕鏈包括恒定區和可變區。所有相同的同種型抗體的恒定區是相同的。不同的B細胞產生的抗體的可變區不同，但單個B細胞產生的所有的抗體的可變區是相同的。
[0024]抗體結合抗原的部分(抗原結合位點)包含在Fab (片段，抗原結合)區中。Fab區由(a)重鏈的恒定和可變區域，和(b)輕鏈恒定和可變區域組成，可變區域稱為FV區。輕鏈可變區域縮寫為VL。重鏈可變.區域縮寫為VH。
[0025]抗體調節免疫細胞活性的部分被稱為Fe (片段，結晶)區。Fe區由兩條重鏈的恒定區組成。
【發明內容】
[0026]本發明提供ー種分離特異性結合抗原的免疫球蛋白功能部分的方法，包括(a)用編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列轉化多個細胞；(b)分離用核酸序列轉化的細胞以生成寄主細胞群；(c)用抗原接觸寄主細胞群；(d)選擇特異性結合抗原的寄主細胞；和(e)分離編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列。在一些實施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白的輕鏈，免疫球蛋白的重鏈，Fab區域，Fv區域，或它們的組合。在一些實施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白輕鏈的可變部分，免疫球蛋白輕鏈的恒定部分，免疫球蛋白重鏈的可變部分，免疫球蛋白重鏈的恒定部分或它們的組合。在一些實施例中，編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列進ー步包括跨膜區域序列。在一些實施例中，編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列包含在質粒內。在一些實施例中，該質粒進ー步包括哺乳動物附加體型復制起點，啟動子，耐抗生素基因或它們的組合。在一些實施例中，寄主細胞是細菌細胞，酵母細胞，或哺乳動物細胞。在一些實施例中，抗原用熒光分子，接頭分子或磁顆粒標記。在一些實施例中，通過進行磁分離或流式細胞分選選擇與抗原相互作用的寄主細胞。[0027]在此，一些實施例公開了一種分離特異性結合抗原的免疫球蛋白的方法，包括（a)用用選自以下的核酸序列轉化多個細胞，（i)編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列；（ii)編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列；或（iii)編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列和編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列；（b)分離用核酸序列轉化的細胞以生成寄主細胞群；（c)用抗原接觸寄主細胞群；（d)選擇能特異性結合抗原的寄主細胞；（e)分離核酸序列。在一些實施例中，編碼重鏈，輕鏈或兩者的核酸序列進一步包括跨膜區域序列。在一些實施例中，編碼重鏈的核酸序列和編碼輕鏈的核酸序列包含在質粒內。在一些實施例中，編碼重鏈的核酸序列包含在第一個質粒內，而編碼輕鏈的核酸序列包含在第二個質粒內。在一些實施例中，質粒進一步包括哺乳動物附加體型復制起點，啟動子，耐抗生素基因或它們的組合。在一些實施例中，寄主細胞是細菌細胞，酵母細胞，或哺乳動物細胞。在一些實施例中，抗原用熒光分子，接頭分子或磁顆粒標記。在一些實施例中，通過進行磁分離或流式細胞分選選擇與抗原相互作用的寄主細胞。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖I展示了 PlgH載體；
圖2展示了 plgL載體；
圖3展示了 plgH&L載體；
圖4展示了 pscFv載體；
圖5展示了 pFab載體；
圖6展示了 plgHFab載體。
具體實施例
[0029]在此，一些實施例公開了一種分離免疫球蛋白功能部分的方法，包括（a)用編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列轉化細胞以生成寄主細胞；（b)用抗原接觸寄主細胞；（C)選擇與抗原相互作用的寄主細胞；和（(1)分離編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列。在一些實施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白的輕鏈，免疫球蛋白的重鏈，或它們的組合。在一些實施例中，免疫球蛋白功能部分是免疫球蛋白輕鏈的可變部分，免疫球蛋白輕鏈的恒定部分，免疫球蛋白重鏈的可變部分，免疫球蛋白重鏈的恒定部分或它們的組合。
[0030]在此，某些實施例公開了一種分離抗體的方法，包括（a)用（i)編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列jP(ii)編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列轉化細胞以生成寄主細胞；（b)用抗原接觸寄主細胞；（c)選擇與抗原相互作用的寄主細胞；（d)分離編碼重鏈和輕鏈的核酸序列。
[0031]在此，某些實施例進一步公開新的載體設計，構建和構建展示抗體，比如全長免疫球蛋白類，單鏈抗體（SCA), scFv,或Fab于寄主細胞表面的抗體庫的方法。
[0032]定義
當涉及結合分子（即試劑，例如肽或模擬肽）和蛋白或多肽或表位之間的相互作用時，短語“特異性結合”通常指結合分子識別并可檢測地以高親和力特異性結合至感興趣的目標。優選地，在指定的或生理條件下，特定的抗體或結合分子結合至特定的多肽，蛋白或表位，但不以重要的或不想要的數量結合至存在于樣品中的其它分子。換句話說特定的抗體或結合分子不會不受歡迎地與非目標抗原和/或表位交叉反應。使用各種免疫測定方式以選擇與特定的多肽免疫反應并具有想要的特異性的抗體或其它結合分子。例如。使用固相ELISA免疫測定，BIAcore，流式細胞儀和放射性免疫測定以選擇具有想要的免疫反應性和特異性的單克隆抗體。參見 Harlow, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Publications, New York (下文為 “Harlow”)，該文描述了用于確定或估計免疫反應性和特異性的免疫測定方式或條件。
[0033]“選擇性結合” “選擇性”及類似詞匯是指相比另ー個分子，試劑優選與ー個分子相互作用。優選地，在此公開的試劑和蛋白之間的相互作用都是特異的和有選擇性的。注意，在一些實施例中，試劑設計成“特異性結合”和“選擇性結合”兩種區別，但其結合相似的目標而沒有結合其它不想要的目標。
[0034]術語“多肽”，“肽”和“蛋白”在此可交換地使用，是指氨基酸殘基的聚合物。該術語適用于天然生成的氨基酸聚合物以及其中一個或多個氨基酸殘基是非天然生成的氨基酸的氨基酸聚合物(例如氨基酸類似物)。該術語包含任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白(即抗原)，其中，氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。
[0035]術語“基序”或“區域”可交換使用。在此使用該術語表示折疊不依賴于剩下的多肽并具有它自己的功能的，離散的、連續或不連續的多肽部分。
[0036]術語“破壞”(disruption)表示干擾功能。例如，破壞基序或區域表示干擾基序/區域的功能。
[0037]術語“抗原”是指能誘導抗體產生的物質。在一些實施例中，抗原是能特異性結合至抗體可變區的物質。
[0038]術語“抗體”是指單克隆抗體，多克隆抗體，雙特異性抗體，多特異性抗體，移植抗體，人抗體，人源抗體，合成 抗體，嵌合抗體，駱騎化的抗體，單鏈Fvs (scFv),單鏈抗體,Fab片段，F(ab/ )片段,二硫連接Fvs (sdFv),細胞內抗體,和抗獨特型(ant1-1d)抗體以及上述任何抗原結合片段。具體地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原結合位點的分子。根據其重鏈的恒定基序/區域的氨基酸序列，免疫球蛋白類可分為不同的類。與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定基序/區域(Fe)分別被稱為a，6 , e , Y和ii。不同類的免疫球蛋白的二級結構和三維構象是已知的。免疫球蛋白分子分為任何型(例如IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY)，類(例如IgG1, IgG2, IgG3,IgG4, IgA1和IgA2)或亞類。廣義上，術語“抗體”和“免疫球蛋白”可交換使用。在ー些實施例中，抗體是大分子的一部分，通過抗體與一個或多個其它蛋白或肽的共價或非共價結合而形成。
[0039]載體，細胞和庫
在一個實施例中，載體命名為PlgH (圖1)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點(比如SV40 ori)，用于抗生素(例如新霉素基因NeoR)選擇的耐抗生素標記和質粒復制起點。PlgH也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子(例如CMV啟動子)，該啟動子啟動下游全長免疫球蛋白重鏈基因的表達。PlgH包括重鏈恒定區(CH)序列，在該序列的C末端，跨膜(TM)序列(例如TOGFR beta跨膜結構區域)構建于該表達載體內，跨膜(TM)序列固定表達的免疫球蛋白重鏈于哺乳動物寄主細胞表面。免疫球蛋白基因的重鏈可變區域序列(VH)或VH基因庫插入片段能重組地插入到plgH載體設定的插入位點。所述載體可選擇地包括酶切位點（比如凝血酶位點)，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基(或“消耗培養基”，spent media)中。
[0040]在另一個實施例中，載體命名為plgL (圖2)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點（比如SV40 ori)，用于抗生素(例如新霉素基因NeoR)選擇的耐抗生素標記和質粒復制起點。PlgL也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子（例如CMV啟動子），該啟動子啟動下游全長免疫球蛋白重鏈基因的表達。PlgL包括輕鏈可變區域和恒定區（CL)序列。
[0041]在一個實施例中，重鏈的可變區域庫（VH庫）插入到圖一的plgH載體中以生成FL免疫球蛋白重鏈庫（IgH庫）。
[0042]在另一個實施例中，選定的重鏈的單條可變區域序列（sVH)插入到圖一的plgH載體以生成單個FL免疫球蛋白重鏈（slgH)。
[0043]在一個實施例中，FL輕鏈庫插入到圖二的PI gL載體以生成FL免疫球蛋白輕鏈庫(IgL 庫)ο
[0044]在另一個實施例中，單條選定的FL輕鏈插入到圖二的plgH載體以生成單條FL免疫球蛋白輕鏈（SlgL)。
[0045]在優選的實施例中，FL IgH庫和FL IgL庫共同轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且FL IgH和FL IgL基因在單獨的共同轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可表達成百（102)到數十萬（105)通過TM區域固定于細胞表面的全組合FL免疫球蛋白。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在地表達和展示IO8到IO15個全長組合FL免疫球蛋白于細胞表面。
[0046]在另一個優選的實施例中，FL IgH庫和FL IgL庫共轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且FL IgH和FL IgL基因在單獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可能表達成百到數十萬全組合FL免疫球蛋白，全組合FL免疫球蛋白通過TM區域固定于細胞表面。每個哺乳動物細胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括單條普通的FL輕鏈（SlgL)和不同的FL IgH鏈，FL輕鏈（slgL)和FL IgH鏈在表面固定全組合免疫球蛋白。每個單獨的細胞可表達成百到數十萬全組合FL免疫球蛋白，全組合FL免疫球蛋白包括單條普通的slgL的FL輕鏈和不同的FL IgH，通過TM區域固定于細胞表面的。IO6到101°個細胞的細胞培養物潛在表達和展示IO8到IO15全組合FL免疫球蛋白于細胞表面，所有的FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0047]在另一個優選的實施例中，FL SlgH庫和FL IgL庫共轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且FL slgH和FL IgL基因在單獨的共同轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可表達成百到數十萬通過TM區域錨定于細胞表面的全組合FL免疫球蛋白。每個哺乳動物細胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括單個普通的FL重鏈（slgH)和不同的FL IgL鏈，FL重鏈（slgH)和FL IgL鏈在表面固定全組合免疫球蛋白。每個單獨的細胞能表達成百（102)到數十萬（105)個全組合FL免疫球蛋白，全組合FL免疫球蛋白包括單條普通的slgH的FL重鏈和不同的FL IgL，通過TM區域固定在細胞表面。IO6到101°個細胞的細胞培養物潛在表達和展示IO8到IO15個全長組合FL免疫球蛋白于細胞表面，所有的FL免疫球蛋白都包括slgH。
[0048]在一個優選的實施例中，單個FL重鏈免疫球蛋白（slgH)或FL重鏈免疫球蛋白庫(IgH庫)轉染到哺乳動物細胞。當新霉素抗性基因表達時，通過抗生素選擇(例如G418藥物選擇)，使轉染的哺乳動物細胞變得穩定。表達ー個或多個IgH的穩定的哺乳動物細胞在此稱為IgH表達系。
[0049]在另ー個優選的實施例中，單個FL輕鏈免疫球蛋白(SlgL)或FL輕鏈免疫球蛋白庫(IgL庫)轉染到哺乳動物細胞。當新霉素抗性基因表達時，通過抗生素選擇(例如G418藥物選擇)使轉染的哺乳動物細胞變得穩定。表達一條或多條IgL的穩定的哺乳動物細胞在此稱為IgL表達系。
[0050]在一個優選的實施例中，IgH庫轉染到IgL表達系，使得IgL表達系的轉染細胞在轉染的IgL表達系細胞中表達全組合免疫球蛋白，每個全組合免疫球蛋白包括成百(102)至數十萬(105) IgHs和單條IgL。IO6到101°個細胞的細胞培養物可在細胞表面產生IO8到IO15不同的全組合FL免疫球蛋白，這些轉染細胞進行進一歩的抗原生物淘選和結合選擇。
[0051]在另ー個優選的實施例中，IgL庫轉染到IgH表達系，使得IgH表達系的轉染細胞在轉染后的IgH表達系細胞中表達全組合免疫球蛋白，每個全組合免疫球蛋白包括成百
(102)至數十萬(105) IgLs和單條IgH。IO6到101°個細胞的細胞培養物可在細胞表面產生IO8到IO15個不同的全組合FL免疫球蛋白，這些轉染細胞進行進一歩的抗原生物淘選和結合選擇。
[0052]在一個實施例中，不同骨架的(例如其包括不同耐抗生素基因)PlgH和plgL載體用于構建全長重鏈和輕鏈免疫球蛋白庫兩者。通過將PlgH和plgL結構轉化到原核細胞中，和以質粒的形式包括免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因的分離的載體，初步構建重鏈和輕鏈免疫球蛋白庫。PlgH和plgL共轉染到哺乳動物細胞以在每個單獨的哺乳動物細胞中共表達多個不同型的重鏈和輕鏈。篩選并選擇表達多個恰當構建并組合免疫球蛋白的細胞從而適當地結合選定的目標抗原，從細胞中游離地或胞質地回收選擇的表達免疫球蛋白的載體的亞群，用于進一歩的分析和選擇.過程。如果PlgH和plgL使用兩種不同的抗生素藥物抗性選擇標記基因，通過不同的抗生素選擇能簡單地分離PlgH和plgL質粒。
[0053]在一個實施例中，載體命名為plgH&L (圖3)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點(比如SV40 ori)，用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如新霉素基因NeoR)和質粒復制起點。plgH&L也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子(例如CMV啟動子)，該啟動子啟動下游全長免疫球蛋白重鏈基因的共表達。通過在FL H和L鏈之間連接的內部核糖體進入位點(IRES)實現重鏈和輕鏈的共表達。FL H鏈在其c末端包括TM序列，用于固定FL免疫球蛋白H鏈于哺乳動物細胞表面。所述載體可選擇地包括酶切位點(比如凝血酶位點)，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基中。
[0054]在一個優選的實施例中，重鏈可變區域序列的庫插入到plgH&L的VH插入位點形成IgH庫，而單條普通的FL輕鏈插入到載體plgH&L中，轉染到哺乳動物細胞培養物后在單獨的轉染的哺乳動物細胞中共表達FL IgH庫和單個普通的FL SlgL基因并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可表達成百(102)到數十萬(105)通過TM區域固定于細胞表面的全組合FL免疫球蛋白。每個哺乳動物細胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括單條普通的FL輕鏈(slgL)和不同的FL IgH鏈，FL輕鏈(SlgL)和FL IgH在表面固定全組合免疫球蛋白。IO6到101°個細胞的細胞培養物潛在表達并展示IO8到IO15個全組合FL免疫球蛋白于細胞表面，所有的全組合FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0055]在另一個優選的實施例中,FL輕鏈庫插入到plgH&L的輕鏈插入位點形成IgL庫，而單條普通的FL重鏈插入載體plgH&L中，轉染到哺乳動物細胞培養物后在單個轉染的哺乳動物細胞中共表達FL IgL庫和單條普通的FL slgH基因并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可表達成百（102)到數十萬（105)通過TM區域固定于細胞表面的全組合FL免疫球蛋白。每個哺乳動物細胞中所有的FL免疫球蛋白可能包括單條普通的FL重鏈（slgH)和不同的FL IgL鏈，FL重鏈（slgH)和FL IgL鏈在表面固定全組合免疫球蛋白。IO6到101°個細胞的細胞培養物潛在表達和展示IO8到1015個全組合FL免疫球蛋白于細胞表面，所有的全組合FL免疫球蛋白都包括slgL。
[0056]在一個實施例中，載體命名為pscFv (圖4)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點（比如SV40 ori)，用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如新霉素基因NeoR)和質粒復制起點。PscFv也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子（例如CMV啟動子），該啟動子啟動下游單鏈抗體（SCA)以scFv的形式表達,scFv通過重鏈可變區域（VH)和輕鏈可變區域以肽鍵連接形成。scFv序列在其c末端包括TM序列,用于將scFv固定到哺乳動物細胞表面。所述載體可選擇地包括酶切位點（比如凝血酶位點）或標簽肽（例如c-myctag)，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基，該標簽肽用于標簽肽檢測。在一個實施例中，VH插入片段為VH區域序列庫（VH庫)，而VL插入片段為單條VL序列（sVL)，包括VH庫和sVL的庫轉染細胞培養物以表達scFv庫并通過TM固定展示于細胞表面。包括成百（102)至數億（108)的VH插入片段的VH庫和普通的sVL的庫轉染細胞培養物，每個單獨的細胞表達并展示成百（102)至數十萬（105)不同的scFv，scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段為VL區域序列庫（VL庫)，而VH插入片段為單條VH序列（sVH)，包括VL庫和sVH的庫轉染細胞培養物以表達scFv庫并通過TM固定展示于細胞表面。包括成百（102)至數億（IO8)VL插入片段的VL庫和普通的sVH的庫轉染細胞培養物，每個單獨的細胞表達并展示成百（102)至數十萬（105)不同的scFv，scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0057]在一個實施例中，pscFv載體為噬菌體展示載體，其包括用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如氨節青霉素基因AmpR),質粒復制起點。pscFv也包括用于在疋co7i細胞中啟動基因表達的啟動子，該啟動子驅動下游scFv基因的表達，VH-肽接頭-VL的scFv與噬菌體外殼蛋白比如pIII，pVII，pVIII，或pIX有效地連接，從而通過將外殼蛋白連接至噬菌體顆粒表面實現scFv展示。包括成百（102)至數億（IO8)VH插入片段的VH庫和普通的sVL的庫轉化到萬.co7i細胞培養物,每個單獨的萬.co7i細胞表達并展示單條scFv, scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段為VL區域序列庫（VL庫)，而VH插入片段為單條VH序列（sVH)，包括VL庫和sVH的庫轉化到E. coli細胞培養物中以表達scFv庫并通過融合噬菌體外殼蛋白展示于噬菌體顆粒上。包括成百（102)至數億（IO8)VL插入片段的VL庫和普通的sVH的庫轉化到E. coli細胞培養物中，每個單獨的E. coli細胞表達并展示單條scFv, scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0058]在另一個實施例中，pscFv載體為酵母展示載體，該載體包括用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如氨節青霉素基因AmpR),質粒復制起點。pscFv也包括用于在疋coli細胞中啟動基因表達的啟動子，該啟動子啟動下游scFv基因的表達，VH-肽接頭-VL的scFv與酵母表面蛋白有效地連接，從而通過將酵母表面蛋白連接至酵母細胞表面實現scFv展示。包括成百(102)至成數億(IO8)VH插入片段的VH庫和普通的sVL的庫轉化到酵母細胞培養物中，姆個單獨的酵母細胞表達并展示單條scFv, scFv包括不同的VH和普通的sVL。反之，VL插入片段為VL區域序列庫(VL庫)，而VH插入片段為單條VH序列(sVH)，包括VL庫和sVH的庫轉化到酵母細胞培養物中以表達scFv庫并通過融合酵母表面蛋白展示于酵母表面。包括成百(102)至數億(IO8)VL插入片段的VL庫和普通的sVH的庫轉化到酵母細胞培養物中，姆個單獨的酵母細胞表達并展示單條scFv, scFv包括不同的VL和普通的sVH。
[0059]在一個實施例中，載體命名為pFab (圖5)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點(比如SV40 ori)，用于抗生素選擇的耐抗生素標記和質粒復制起點(例如新霉素基因NeoR)。pFab也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子(例如CMV啟動子)，該啟動子啟動下游Fab基因的表達，VL-CL的Fab，VH-CHl和FL輕鏈通過VH-CHl和VL-CL之間連接的內部核糖體進入位點實現共表達。VH-CHl鏈或VL-CL輕鏈在其相應的c末端包括TM序列，用于將Fab固定于哺乳動物細胞表面。所述pFab載體可選擇地包括酶切位點(比如凝血酶位點)或蛋白標簽位點，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基中，蛋白標簽位點用于蛋白標簽的檢測。
[0060]在一個優選的實施例中，VH-CHl插入片段庫和VL-CL插入片段庫插入到pFab載體中并轉染到哺乳動物細胞培養物中。VH-CHl和VL-CL基因在単獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達，并且Fab在細胞表面組裝和展示。每個單獨的細胞可能表達成百(102)至數十萬(105)全組合Fab，全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。IO6到101°個細胞的細胞培養物潛在表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面。
[0061 ] 在另ー個實施例中，VH-CHl插入片段庫和單條VL-CL插入片段插入到pFab載體并轉染到哺乳動物細胞培養物中。VH-CHl基因和單條VL-CL基因在単獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達，并且Fab在細胞表面組裝和展示。每個單獨的細胞可能表達成百(102)至數十萬(105)全組合Fab,姆條全組合Fab包括不同的VH-CHl和普通的VL-CL插入片段,全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在地表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面，每個全組合Fab包括不同的VH-CHl和普通的VL-CL。
[0062]在另ー個優選的實施例中，單條VH-CHl插入片段和VL-CL插入片段庫插入到pFab載體并轉染到哺乳動物細胞培養物。單個普通的VH-CHl基因和VL-CL基因在単獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達，并且Fab在細胞表面組裝和展示。每個單獨的細胞可能表達成百(102)至數十萬(105)全組合Fab，每條全組合Fab包括單條普通的VH-CHl片段和不同的VL-CL插入片段，全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在地表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面，每個全組合Fab包括普通的VH-CHl和不同的VL-CL片段。
[0063] 在另ー個實施例中，圖5的pFab載體為卩遼菌體展不載體,該載體包括用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如氨芐青霉素基因AmpR)，質粒復制起點。pscFv也包括用于在E.coli細胞中啟動基因表達的啟動子，該啟動子啟動下游Fab基因的表達，VL-CL的Fab，VH-CHl和FL輕鏈通過VH-CHl和VL-CL之間連接的內部核糖體進入位點(IRES)實現共表達。VH-CHl和VL-CL的Fab與噬菌體外殼蛋白比如pIII，pVII，pVIII，或pIX有效地連接，從而通過將外殼蛋白連接至噬菌體顆粒表面實現Fab的展示。包括成百(102)至數億(108)的VH-CHl插入片段的VH-CHl庫和單條普通的FL輕鏈sVL_CL的庫轉化疋coli細胞培養物，每個單獨的疋coli細胞表達并展示單條Fab，Fab包括不同的VH-CHl和普通的sVL-CL。反之，FL VL-CL插入片段為FL VL-CL輕鏈序列庫（VL庫)，而VH插入片段為單條VH-CHl序列（sVH-CHl)，包括VL-CL庫和sVH_CHl的庫轉化疋coli細胞培養物從而表達Fab庫，并通過融合噬菌體外殼蛋白在噬菌體顆粒上展示。包括成百（102)至成數億（108)VL-CL插入片段的VL-CL庫和普通的sVH-CHl的庫轉化疋coli細胞培養基，每個單獨的E. coli細胞表達并展示單條Fab，Fab包括不同的VL-CL和普通的sVH-CHl。
[0064]在另一個實施例中，pFab載體為酵母展示載體，該載體包括用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如氨芐青霉素基因AmpR)，質粒復制起點。pFab也包括用于在酵母細胞中啟動基因表達的啟動子，該啟動子啟動下游Fab基因的表達，VH-CHl和VL-CL的Fab通過VH-CHl或VL-CL與酵母表面蛋白有效地連接，從而通過將酵母表面蛋白連接至酵母細胞表面實現Fab展示。包括成百（102)至數億（108) VH-CHl插入片段的VH-CHl庫和普通的sVL-CL的庫轉化到酵母細胞培養物中，每個單獨的酵母細胞表達并展示單個Fab，Fab包括不同的VH-CHl和普通的sVL-CL。反之，VL-CL插入片段為FL VL-CL輕鏈序列庫（VL-CL庫)，而VH插入片段為單條VH-CHl序列（sVH-CHl),包括VL-CL庫和sVH-CHl的庫轉化到酵母細胞培養物中以表達Fab庫并通過融合酵母表面蛋白展示于酵母表面。包括成百（102)至數億（108) VL-CL插入片段的VL庫和普通的sVH-CHl的庫轉化到酵母細胞培養物中，每個單獨的酵母細胞表達并展示單條Fab，Fab包括不同的VL-C和普通的sVH_CHl。
[0065]在一個實施例中，載體命名為pVH-CHl (圖6)，該載體包括哺乳動物附加型復制起點（比如SV40 ori),用于抗生素選擇的耐抗生素標記(例如新霉素基因NeoR)和質粒復制起點。PVH-CHl也包括用于在哺乳動物細胞中啟動基因表達的啟動子（例如CMV啟動子），該啟動子啟動下游VH-CHl基因的表達。VH-CHl在其相應的c末端可能選擇性地包括TM序列，用于固定VH-CHl至哺乳動物細胞表面。所述pVH-CHl載體可選擇地包括酶切位點(比如凝血酶位點）或蛋白標簽位點，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基中，蛋白標簽位點用于蛋白標簽的檢測。
[0066]在另一個實施例中，命名為圖2的plgL的載體包括VL-CL插入片段，該插入片段可能在其c末端可選擇地包括TM序列，用于固定FL VL-CL至哺乳動物細胞表面。所述PVL-CL載體可選擇地包括酶切位點（比如凝血酶位點）或蛋白標簽位點，該酶切位點用于蛋白酶剪切以釋放固定的抗體至廢棄培養基中，蛋白標簽位點用于蛋白標簽的檢測。
[0067]在一個實施例中，VH-CHl插入片段庫插入到圖6的pVH_CHl載體中以生成pVH-CHl 庫（pVH-CHl 庫)。
[0068]在另一個實施例中，單條VH-CHl (sVH-CHl)插入片段插入到圖6的pVH-CHI載體以生成單條普通的pVH-CHl (sVH-CHl)。
[0069]在一個優選的實施例中，pVH-CHl庫和FL IgL庫共轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且VH-CHl和FL IgL基因在單獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可能表達成百（102)至數十萬（105)全組合Fab，全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在地表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面。
[0070]在另一個優選的實施例中，pVH-CHl庫和FL slgL轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且VH-CHl和FL slgL基因在單獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可能表達成百至數十萬全組合Fab，全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。每個哺乳動物細胞中所有的Fab可能包括單條普通的FL輕鏈（slgL)和不同的VH-CH1，FL輕鏈（slgL)和VH-CHl固定全組合Fab于表面上。每個單獨的細胞可能表達成百(102)至數十萬（105)全組合Fab，Fab包括單條普通的slgL的FL輕鏈和不同的VH-CHl重鏈片段，通過TM區域固定在細胞表面。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面，所有的全組合Fab包括slgL。
[0071]在另一個優選的實施例中，單條普通的sVH-CHl和FL IgL庫轉染到哺乳動物細胞培養物中，并且sVH-CHl片段和FL IgL基因在單獨的共轉染的哺乳動物細胞中共表達并展示于細胞表面。每個單獨的細胞可能表達成百至數十萬全組合Fab，全組合Fab通過TM區域固定在細胞表面。每個哺乳動物細胞中所有的Fab可能包括單條普通的VH-CHl (sVH-CHl)和不同的FL IgL鏈，VH-CHl (sVH-CHl)和FL IgL鏈固定全組合Fab在表面上。每個單獨的細胞可能表達成百（102)至數十萬（105)全組合Fab，Fab包括單個普通的VH-CHl和不同的FL IgL，通過TM區域固定在細胞表面。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物潛在地表達并展示IO8到IO15全組合Fab于細胞表面，所有的全組合Fab包括sVH_CHl。
[0072]在一個優選的實施例中，單條sVH-CHl或pVH-CHl庫（pVH-CHI庫）轉染到哺乳動物細胞中。當新霉素抗性基因表達時，通過抗生素選擇(例如G418藥物選擇)使轉染的哺乳動物細胞變得穩定。表達一個或多個VH-CHl的穩定的哺乳動物細胞在此被稱為VH-CHl表達系。
[0073]在一個優選的實施例中，pVH-CHl庫轉染到IgL表達系中，使得IgL表達系的轉染細胞表達全組合Fab轉染IgL表達系細胞，每個全組合Fab轉染IgL表達系細胞包括成百
(102)至數十萬（105) VH-CHl插入片段和單條IgL。IO6到101°個細胞的細胞培養物可在細胞表面產生IO8到IO15不同 的全組合Fab，針這些轉染細胞進行進一步的抗原生物淘選和結合選擇為預定的抗原選擇Fab。
[0074]在另一個優選的實施例中，IgL庫轉染到VH-CHl表達系中，使得VH-CHl表達系的轉染細胞表達全組合Fab轉染VH-CHl表達系細胞，每個全組合Fab轉染VH-CHl表達系細胞包括成百（102)至數十萬（105) IgLs和單條VH-CHl片段。IO6到IOltl個細胞的細胞培養物可在細胞表面產生IO8到IO15不同的全組合Fab，這些轉染細胞進行進一步的抗原生物淘選和結合選擇為預定的抗原選擇Fab。
[0075]在一個實施例中，不同骨架(例如其包括不同的耐抗生素基因）的pVH-CHl和plgL載體用于構建VH-CHl重鏈片段和FL輕鏈免疫球蛋白庫兩者。通過將pVH-CHl和plgL結構轉化到原核細胞中，和以質粒的形式包括重鏈片段或全長輕鏈免疫球蛋白基因的分離的載體，初步構建VH-CHl和輕鏈免疫球蛋白庫。pVH-CHl和plgL共轉染到哺乳動物細胞以在每個單獨的哺乳動物細胞中共表達多條不同型的VH-CHl重鏈片段和FL輕鏈。篩選并選擇表達多個適合地構建和組裝Fab的細胞從而適當地結合選定的目標抗原。從細胞中游離地或胞質地回收選定的表達Fab的載體的亞群,用于進一步的分析和選擇過程。如果pVH-CHl和PlgL使用兩種不同的抗生素藥物抗性選擇標記基因，通過不同的抗生素選擇能簡單地分離pVH-CHl和plgL質粒。
[0076]通過在寄主細胞中抗體和預定抗原的特異性結合選擇能實現上述針對預定抗原的不同型的抗體庫(FL IgGl, scFv或Fab庫)的生物淘選。
[0077]在一個實施例中，寄主細胞為萬.cWi，其中抗體庫在噬菌體展示載體中。選擇表達結合者抗體(FL IgGl, scFv或Fab抗體)的萬.cWi細胞并回收包含在寄主萬.coli細胞內的噬菌體顆粒。該生物淘選過程可重復，從而進ー步豐富表達想要的結合者抗體的噬菌體顆粒。
[0078]在另ー個優選的實施例中，寄主細胞為酵母細胞，其中抗體庫中的抗體展示于酵母細胞表面。預定的抗原通過熒光標記并與包括表達抗體庫的酵母細胞一起培養。通過流式細胞分選(FACS)選擇與熒光標記的抗原結合的酵母細胞。細胞分選選擇過程可重復，從而在酵母抗體庫中進一步豐富包含想要的結合者抗體的酵母細胞。
[0079]在另ー個優選的實施例中，寄主細胞為哺乳動物細胞，其中抗體庫中的抗體展示于乳動物細胞表面。預定的抗原通過熒光標記并與包括表達抗體庫的哺乳動物細胞一起培養。通過流式細胞分選(FACS)選擇與突光標記的原結合的哺乳動物細胞。細胞分選選擇過程可重復，從而從哺乳動物抗體庫中進一步豐富包含想要的結合者抗體的哺乳動物細胞。
[0080]在一個實施例中。預定的抗原共價連接磁顆粒。連接預定抗原的磁顆粒與寄主細胞一起培養，比如表達抗體庫的^: cWi，酵母或哺乳動物細胞。包括結合者抗體的細胞與包括非結合者抗體的細胞分離，并且想要的抗體和它們相應的基因序列分離。采用磁顆粒的生物淘選過程能重復，從而進 ー步豐富包含想要的結合者抗體的寄主細胞。
【權利要求】
1.一種分離特異性結合至抗原的免疫球蛋白功能部分的方法，包括： Ca)用編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列轉化細胞； (b)分離用編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列轉化的細胞，從而生成寄主細胞群； (c)用抗原接觸寄主細胞； Cd)選擇特異性結合抗原的寄主細胞；并且 (e)分離編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白功能部分為免疫球蛋白的輕鏈，免疫球蛋白的重鏈，Fab區域，Fv區域或它們的組合。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白功能部分為免疫球蛋白輕鏈的可變部分，免疫球蛋白輕鏈的恒定部分，免疫球蛋白重鏈的可變部分，免疫球蛋白重鏈的恒定部分或它們的組合。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列進一步包括跨膜區域序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼免疫球蛋白功能部分的核酸序列包含在質粒內。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述質粒進一步包括哺乳動物附加型復制起點，啟動子，耐抗生素基因，或它們的組合。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞為細菌細胞，酵母細胞或哺乳動物細胞。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原用熒光分子，接頭分子或磁顆粒T 己 O
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過磁分離或流式細胞分選選擇與抗原相互作用的寄主細胞。
10.一種分離特異性結合至抗原的免疫球蛋白的方法，包括： (a)用選自以下的核酸序列轉化多個細胞： i.編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列； ?.編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列；或 iii.編碼免疫球蛋白重鏈的核酸序列和編碼免疫球蛋白輕鏈的核酸序列； (b)分離用核酸序列轉化的細胞，從而生成寄主細胞群； (c)用抗原接觸寄主細胞群； (d)選擇特異性結合抗原的寄主細胞；并且 (e)分離核酸序列。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白為功能性抗體。
12.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白為單鏈抗體（SCA)。
13.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白為scFv。
14.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述編碼重鏈，輕鏈或兩者的核酸序列進一步包括跨膜區域序列。
15.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述編碼重鏈的核酸序列和編碼輕鏈的核酸序列包含在質粒內。
16.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述編碼重鏈的核酸序列包含在第一個質粒內，而所述編碼輕鏈的核酸序列包含在第二個質粒內。
17.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述質粒進ー步包括哺乳動物附加型復制起點、啟動子、耐抗生素基因、或它們的組合。
18.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述寄主細胞為細菌細胞、酵母細胞或哺乳動物細胞。
19.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗原用熒光分子、接頭分子或磁顆粒標記。
20.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，通過磁分離或流式細胞分選選擇與抗原相互作用的 寄主細胞。
【文檔編號】C12P21/00GK103476941SQ201180018943
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年4月12日 優先權日:2010年4月12日
【發明者】亨利·吉, 周和悅, 張彥良, 查爾斯·羅迪 申請人:索倫托治療有限公司