在螯合劑存在下具有高穩定性的變體和包含變體的組合物的制作方法

專利名稱：在螯合劑存在下具有高穩定性的變體和包含變體的組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及與其親本酶相比針對螯合劑具有改善的穩定性的α -淀粉酶變體，包含所述變體的組合物，編碼所述變體的核酸，產生所述變體的方法，和使用所述變體的方法。
背景技術：
α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。·α -淀粉酶在例如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化，如在制備高果糖糖漿或作為從淀粉產生乙醇的一部分中，具有悠久的產業應用歷史。許多這些和其他的α-淀粉酶應用使用來源于微生物的α-淀粉酶，特別是細菌α-淀粉酶。首先使用的細菌α -淀粉酶中包括來自地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也稱作Termamyl,其已經得到廣泛表征并已經確定了該酶的晶體結構。堿性淀粉酶，如源自披露于WO 95/26397中的芽孢桿菌屬菌種的α -淀粉酶，形成了用于洗滌劑的特定的α-淀粉酶組。已經對很多這些已知的細菌淀粉酶進行了修飾，以改進它們在具體應用中的功能性。Termamyl和很多高效α -淀粉酶的活性都需要|丐。發現Termamyl的晶體結構中四個鈣原子通過帶負電荷的氨基酸殘基配位結合在α-淀粉酶結構中。在其他α-淀粉酶中，結合在結構中的鈣離子的量可能不同。對于鈣的需要在存在強螯合化合物的應用中，如在洗滌劑或從全谷物產生乙醇的過程中是缺點。如上所述，眾所周知多種酶依賴于鈣或其他金屬離子如酶或鋅以供其活性和穩定性，因此在包含螯合劑的組合物，例如含有螯合劑的洗滌劑或供用于產生生物燃料、其中植物材料或含淀粉材料具有天然螯合劑成分如例如植酸的組合物中開發既穩定又顯示良好性能的酶是一個挑戰。舉例而言，添加或摻入螯合劑以在洗滌過程中降低水硬度，保護可能還存在的漂白劑，且螯合劑亦對一些污跡的去除具有直接作用。鈣依存性酶在洗滌劑中的穩定性有時可通過將鈣添加至該洗滌劑而改善，但常常這樣做會隨即破壞污跡去除作用。此外，將鈣添加至液體洗滌劑可導致配制上的問題，即洗滌劑的物理穩定性。

發明內容
因此，提供如下α -淀粉酶的組合物和變體會是有利的，其對于螯合劑是穩定的，并優選與親本α-淀粉酶相比具有得到保持或提高的洗滌性能。因此，本發明的第一個方面涉及組合物，其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體在選自使用根據 SEQ ID Ν0:6 編號的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和243的一個或多個位置包含取代，并且還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時，所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。另一個方面涉及組合物，其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體在選自使用根據 SEQ ID Ν0:6 編號的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和 243 的一個或多個位置包含取代，并且還包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時，所述螯合劑能夠在低于O. 9倍能夠將鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的螯合劑濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至O. 10mM。本發明進一步涉及用于制備多肽的方法，包括(a)提供具有淀粉酶活性的親本多肽的氨基酸序列；(b)選擇占據對應于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的一個或多個位置的一個或多個氨基酸，并進一步選擇對應于位置116、 118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458的一個或多個位置；(c)通過取代或缺失選定的氨基酸殘基或鄰接選定的氨基酸殘基插入一個或多個氨基酸殘基來修飾所述序列；(d)產生具有修飾序列的變體多肽；(e)測試所述變體多肽的淀粉酶活性和穩定性；和(f)選擇在螯合劑存在下相對于親本多肽穩定性增加并具有淀粉酶活性的變體多肽，其中在21°C和pH 8. 0，所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM 減少至 O. IOmM0在一個優選的方面，本發明涉及親本α -淀粉酶的變體，所述變體在對應于選自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位置的一個或多個位置包含改變，并進一步在對應于選自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的位置的一個或多個位置包含改變，其中(a)所述各改變獨立地為(i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸，(ii)缺失占據該位置的氨基酸，和/或(iii)取代占據該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性；并且(c)每個位置對應于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。在另一個方面，本發明涉及親本α-淀粉酶的變體，所述變體在181、182、183或184的氨基酸區中包含至少一個、至少兩個或至少三個缺失，并進一步在選自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的一個或多個位置包含改變，并進一步在選自116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的一個或多個位置包含改變，其中(a)所述各改變獨立地為(i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸，(ii)缺失占據該位置的氨基酸，和/或(iii)取代占據該位置的氨基酸，(b)該變體具有α -淀粉酶活性；并且
(c)每個位置對應于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。本發明進一步涉及編碼本發明的變體的分離的核苷酸序列和包含編碼本發明的變體的核苷酸序列的重組宿主細胞。發明詳述定義 α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一組酶組成，其催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。已知α -淀粉酶來源于廣泛選擇范圍的生物，包括細菌，如來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的種，例如地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),來自真菌的種，如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillusniger);來自植物如大麥和來自哺乳動物。野生型酶術語“野生型” α-淀粉酶指由天然存在的微生物，如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的α-淀粉酶。當親本酶并非變體酶時，術語“野生型酶”和“親本酶”可互換使用。變體酶術語“變體”在本文中定義為具有α -淀粉酶活性的多肽，其在親本或野生型α-淀粉酶的一個或多個(或一個或幾個)特定位置包含一個或多個(或一個或幾個)氨基酸殘基的改變，如取代、插入和/或缺失。優選少于50個修飾，更優選少于30個修飾。改變的α-淀粉酶藉由通過修飾親本α-淀粉酶的人為介入來獲得。親本酶術語“親本”α -淀粉酶如用于本文中意指這樣的α -淀粉酶，本發明的變體α-淀粉酶是對其進行修飾而產生的。該術語還指本發明的變體與之進行比較的多肽。所述親本可為天然存在(野生型)的多肽，或甚至可為其通過任何合適手段制備的變體。舉例而言，所述親本蛋白可為天然存在的多肽的變體，其氨基酸序列經修飾或改變。因此，所述親本α -淀粉酶可具有一個或多個(或一個或幾個)氨基酸取代、缺失和/或插入。因此所述親本α_淀粉酶可為親本α_淀粉酶的變體。親本亦可為等位變體，其為由任何占據相同染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式編碼的多肽。改善的特性術語“改善的特性”在本文中定義為與變體相關的特征，其相對于親本α-淀粉酶得到改善。此類改善的特性包括但不限于增加的淀粉分解活性，例如當如本文實施例部分中所述在EnzChek測定或PNP-G7測定中測量時，增加的洗滌性能，如污物性能，例如對含有淀粉的污物、污物去除、抗變灰色(anti-greying)的性能,穩定性例如熱穩定性、PH穩定性或助洗劑包括螯合劑存在下的穩定性，在粉末、液體或凝膠洗滌劑配制物或洗碟組合物中的穩定性，改變的溫度依存性性能和活性分布，PH活性，底物特異性，產物特異性和化學穩定性。洗滌性能和/或洗碟性能可如本申請中下文“材料和方法”中所述進行測量。優選本發明的變體包括改善的性質如改善的穩定性，改善的洗滌性能，改善的洗碟性能和/或改善的洗滌劑中的活性的組合。改善的穩定性包括在儲藏過程中在濃縮洗滌劑產物中的穩定性和在洗滌過程中在稀釋洗滌劑中的穩定性。改善的特性包括在低溫下改善的洗滌或洗碟性能。活性在本文語境中，術語“活性”為淀粉分解活性，其通過在特定條件下在含有三個或更多個1，4-α-連接的D-葡萄糖單元的多糖中如例如在淀粉中，每單位時間和每單位酶蛋白水解的1，4-a -D糖苷鍵的數量來測量，例如，在特定條件下每mL以g計的酶蛋白的酶樣品而獲得的活性。所述活性可在例如下文中在“材料和方法”中所述的EnzChek測定或PNP-G7測定中測量。在本申請中，術語“活性”可與“淀粉分解活性”互換使用。術語“比活性”常常用于描述每mL (或g)的酶蛋白獲得的最大活性。改善的化學穩定性術語“改善的化學穩定性”在本文中定義為變體酶在減少親本酶的酶活性的天然存在或合成的一種或多種化學物存在下溫育一段時間之后，呈現酶活性的保持。改善的化學穩定性亦可導致在此類化學物的存在下能夠更好地催化反應的變體。在本發明的一個具體方面，所述改善的化學穩定性是在洗滌劑中，特別是在液體洗滌劑中改善的穩定性。所述改善的洗滌劑穩定性具體而言是當本發明的α-淀粉酶變體混合入包含螯合劑的液體洗滌劑配制物中時，改善的α -淀粉酶活性的穩定性，其中所述液體亦包括凝膠或糊劑。所述液體洗滌劑配制物可指在洗衣或自動洗碟過程中添加的濃縮的洗滌齊U，或稀釋的洗滌劑如洗滌溶液，即添加了所述濃縮洗滌劑的水溶液。在本發明中，液體洗滌劑具體而言可用作液體洗衣洗滌劑。穩定性術語“穩定性”包括儲藏穩定性和使用過程中，例如洗滌工藝過程或其他工業工藝中的穩定性，且淀粉酶的穩定性反映為時間的函數，例如，當將淀粉酶保持在溶 液，特別是在洗滌劑溶液中，保留了多少活性。舉例而言，所述α-淀粉酶變體可在31°C下18小時之后，具有超過70%的剩余活性，即保留活性的量。所述穩定性受許多因素影響，例如PH，溫度，洗滌劑組成例如助洗劑、表面活性劑等的量和類型。淀粉酶穩定性使用“材料和方法”中所述的EnzCheck測定或PNP-G7測定來進行測量。改善的穩定性術語“改善的穩定性”在本文中定義為變體酶呈現增加的穩定性，所述穩定性比親本ct -淀粉酶的穩定性更高,例如，當在“材料和方法”中所述的EnzCheck測定中測量時，在31°C在1.5%(w/v)DTPA的存在下在pH 8下18小時之后，相對于親本具有超過70%的剩余活性,或具有至少IOpp剩余活性的改善。變體相對于親本在剩余活性上的百分點(PP)改善計算為“材料和方法”中所述的變體的剩余活性和親本的剩余活性之間的差異。助洗劑助洗劑可通過M. K. Nagarajan 等,JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September1984)，pp. 1475-1478描述的測試進行分類以確定在溶液中在pH 8將水硬度從2. OmM(按CaCO3)降至O. IOmM所需的最低助洗劑水平。所述助洗劑可具體而言為螯合劑，其與例如鈣和鎂離子形成水溶性絡合物。螯合劑為與某些金屬離子形成分子，使所述離子失活從而使其無法與其他元素反應的化學物，因此為通過形成螯合物抑制化學活性的結合劑。螯合作用是配體和單個中心原子之間的兩個或更多個單獨結合的存在或形成。所述配體可為任何有機化合物、硅酸根或磷酸根。在本文語境下，術語“螯合劑”包括與金屬離子如鈣和鎂形成水溶性絡合物的螯合劑、絡合劑或掩蔽劑。螯合作用描述螯合配體對金屬離子的親和力相對于類似的一組非螯合配體對相同金屬的親和力的增強。螯合劑具有與金屬離子特別是鈣(Ca2+)離子的結合能力，并廣泛應用于洗滌劑，和一般用于洗滌如洗衣或洗碟的組合物。然而，螯合劑自身呈現出抑制酶活性。在本申請中，術語螯合劑與“絡合劑”或“螯合劑”可互換使用。由于大多數α -淀粉酶具有鈣敏感性，螯合劑的存在可影響酶活性。α -淀粉酶的鈣敏感性可通過將給定α-淀粉酶在強螯合劑的存在下溫育，并分析該溫育對所述α-淀粉酶的活性的影響來確定。鈣敏感性α-淀粉酶會在溫育過程中喪失其活性的主要部分或全部。
表征性螯合劑如上所述，螯合作用描述螯合配體對金屬離子的親和力相對于一組類似的非螯合配體對相同金屬的親和力的增強。然而，該螯合作用的強度可通過多種類型的測定或測量方法決定，由此根據其螯合作用(或強度)對螯合劑進行區分和排位。在一個優選的測定中，螯合劑可表征為其在pH 8. O將游離鈣離子(Ca2+)濃度從2. OmM減少至O. IOmM或更低的能力，例如通過以M. K. Nagarajan等，JAOCS, Vol. 61，no. 9 (September 1984)，pp. 1475-1478 所述的方法為基礎的測試進行。使用基于Nagarajan等的方法對螯合劑進行表征的實例描述于實施例2a。優選地，本發明的螯合劑涵蓋當在21°C在pH 8. O下測量時，能夠在低于10mM，優選低于9. 5mM，優選低于9mM,優選低于8. 5mM,優選低于8mM，優選低于7. 5mM,優選低于7mM，優選低于6. 5mM,優選低于6mM,優選低于5. 5mM,優選地,優選低于5mM,優選低于4. 5mM,低于4mM,優選低于3. 5mM,優選低于3mM，優選低于2. 5mM，優選低于2mM，優選低于I. 5mM或優選低于ImM的濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. ImM或更低的螯合劑。優選地，本發明的螯合劑涵蓋當在21 °C在pH 8，在80mM氯化鉀和49mM EPPS((4-(2-羥乙基)哌嗪-I-丙磺酸))中測量時，能夠在低于10mM，優選低于9. 5mM，優選低于9mM，優選低于8. 5mM,優選低于8mM，優選低于7. 5mM,優選低于7mM，優選低于6. 5mM,優選低于6mM,優選低于5. 5mM,優選地,優選低于5mM,優選低于4. 5mM,低于4mM,優選低于
3.5mM，優選低于3mM，優選低于2. 5mM，優選低于2mM，優選低于I. 5mM或優選低于ImM的濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. ImM的螯合劑。在一個具體的優選實施方案中，所述螯合劑當在pH 8和21°C，在80mM氯化鉀和49mM EPPS中測量，并如“材料和方法”中所述使用鈣離子選擇性電極確定游離鈣濃度時，能夠將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至O. ImM。因此優選地，所述螯合劑涵蓋當如“材料和方法”中所述在PH 8. O和21°C測試時，能夠在低于10mM，優選低于9. 5mM,優選低于9. OmM,優選低于8. 5mM,優選低于8. OmM,優選低于
7.5mM,優選低于7. OmM,優選低于6. 5mM,優選低于6. OmM,優選低于5. 5mM,優選地，優選低于5. OmM,優選低于4. 5mM,低于4. OmM,優選低于3. 5mM,優選低于3. OmM,優選低于2. 5mM,優選低于2. OmM,優選低于I. 5mM或優選低于I. OmM的濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至0. IOmM的螯合劑。在一個特別優選的實施方案中，所述螯合劑當在pH 8和21°C在80mM氯化鉀和49mM EPPS中測量時，能夠以9mM至0. 5mM,優選9mM至ImM，優選8mM至ImM，優選7mM至ImM,優選6mM至ImM,優選5mM至ImM,優選4mM至ImM,優選3mM至ImM,優選2mM至ImM,優選 9. OmM 至 I. 5mM,優選 8. OmM 至 I. 5mM,優選 7. OmM 至 I. 5mM,優選 6. OmM 至 I. 5mM,優選
5.OmM 至 I. 5mM,優選 4. OmM 至 I. 5mM,優選 3. O 至 I. 5mM,優選 2. 5mM 至 I. OmM,優選 2. OmM至I. ImM，優選I. 85mM至I. OmM的濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至0. 10mM。游離鈣離子濃度從2. OmM Ca2+減少至0. IOmM,對應于將水硬度從200ppm(按CaCO3，在酸性CO2存在下為Ca(HCO3)2的形式)減少至lOppm。最低助洗劑水平從螯合劑的鈉鹽計算，并基于100%干螯合劑。螯合劑的螯合作用亦可相對于檸檬酸鹽(citrate)測量。將能夠將游離鈣離子濃度的量從2. OmM減少至0. IOmM的檸檬酸鹽的濃度的值指定為1，并將螯合劑的結果與該值相比較。根據本發明優選的螯合劑當在PH 8. O和21°C測量時，能夠以與檸檬酸鹽的濃度相比低至低于0. 9，如低于0. 8，如低于0. 7，如低于0. 6，如低于0. 5，如低于0. 4，如低于0. 3，如低于O. 2，如低于O. I倍的濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。根據本發明優選的螯合劑當使用鈣離子選擇性電極確定游離鈣濃度時，當在21°C和pH 8. O在80mM氯化鉀和49mM EPPS中測量時，能夠以與檸檬酸鹽的濃度相比低至低于O. 9，如低于O. 8，如低于O. 7，如低于O. 6，如低于O. 5，如低于O. 4，如低于O. 3，如低于O. 2，如低于O. I倍的濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。在一個特別優選的實施方案中，當在pH 8. O和21°C測量時，所述螯合劑能夠以與下述檸檬酸鹽濃度相比低至低于I. O至O. I，如低于O. 9至O. I，如低于O. 8至O. 1，如低于O. 7至O. 1，如低于O. 6至O. 1，如低于O. 5至O. 1，如低于O. 4至O. 1，如低于O. 35至O. 1，如低于O. 3至O. I倍的螯合劑濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM，所述檸檬酸鹽的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。因此本發明的一個優選實施方案涉及組合物，其包含親本α-淀粉酶的變體，其
中所述變體使用根據SEQ ID Ν0:6的編號在193至213范圍的一個或多個位置包含取代，且進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8測量時，所述螯合劑能夠在低于下述檸檬酸鹽濃度的O. 9倍的螯合劑濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至O. 10mM，所述檸檬酸鹽的濃度能夠將將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至0. 10mM。本發明的一個進一步的實施方案涉及組合物,其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體α-淀粉酶使用根據SEQ ID Ν0:6的編號在選自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的一個或多個位置包含取代，且進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時，所述螯合劑能夠在低于IOmM的濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至 0. 10mM。本發明的一個進一步的實施方案涉及組合物,其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體α-淀粉酶使用根據SEQ ID Ν0:6的編號在選自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的一個或多個位置包含取代，且進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時，所述螯合劑能夠在低于IOmM的濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至0. IOmM,且任選地包含清洗助劑(cleaning adjunct)。本發明的一個進一步的實施方案涉及組合物,其包含親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體α -淀粉酶包含與SEQ ID NO:6至少70%相同的氨基酸序列，并進一步使用根據 SEQ ID Ν0:6 的編號在選自 193、195、197、198、200、203、206、210、212 和 213 的一個或多個位置包含取代，且進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時，所述螯合劑能夠在低于IOmM的濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至0. 10mM。因此，本發明的螯合劑能夠在低于下述檸檬酸鹽的濃度的濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至0. IOmM,所述檸檬酸鹽的濃度是在相同條件下將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至0. IOmM所必需的。或者，由螯合劑和金屬離子如鈣和/或鎂之間形成的絡合物的強度表示為log K值(平衡或結合或解離或穩定常數)。該常數可在給定PH，在給定溫度和在給定離子強度測量。如上所述，由螯合劑和金屬離子如鈣和/或鎂之間形成的絡合物的強度可表示為log K值(平衡或結合或解離或穩定常數)，所述常數可如A. Nielsen等，Anal. Biochem.Vol. 314, (2003)，pp 227-234 中所述從 K 值通過等溫滴定量熱法(isothermal titrationcalorimetry, ITC)來測量,所述log K可計算為K值的對數(以10為底)。通過該方法測得的log K值會取決于溫度、pH、離子強度，因此當比較log K值時，重要的是它們是在類似地，優選相同的條件下確定的。此外，通過導入標樣如檸檬酸鹽作為參照，可減少實驗中差異導致的影響。優選地，log K是如本申請“材料和方法”中所述確定的，因此在本發明的一個實施方案中，當log K在pH 10和19°C如“材料和方法”中所述測量時，根據本發明的組合物中的螯合劑具有至少3，如至少4，如至少5，如至少6，如至少7，如至少8，如至少9，如至少10，如至少11的log K。根據本發明的組合物中的螯合劑的log K值亦可在3-11，如3-10，如 3-9，如 3-8，如 4-11，如 5-11 如 6-11，如 4-10，如 5-10，如 4-9，如 5-9，如 4-8，特別是5-8的范圍。優選地，根據本發明的組合物中的螯合劑的log K是如在“材料和方法”中所述確定的檸檬酸鹽的log K的至少1，如至少I. 33，如至少I. 67，如至少2，如至少2. 33，如至少2. 67，如至少3，如至少3. 33，如至少3. 67倍。根據本發明的組合物中的螯合劑亦可為如在“材料和方法”中所述確定的檸檬酸鹽的log K的1-3. 67，如1-3. 33，如1-3. 00，如 1-2. 67，如 I. 33 - 3. 67，如 I. 33-3. 33，如 I. 33-3. 00，如 I. 33-2. 67，如 I. 67-3. 67，如1.67-3. 33，如 I. 67-3，特別是 1.67-2. 67 倍的范圍。
可用的螯合劑可為，但不限于下述N-(1，2-二羧基-乙基)-D，L_天冬氨酸(IDS)，N- (2-羥乙基)亞胺二乙酸(EDG)，天冬氨酸-N- —乙酸(ASMA)，天冬氨酸-N，N- 二乙酸(ASDA)，天冬氨酸-N-—丙酸(ASMP)，亞胺二琥珀酸(IDA)，N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS), N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)，N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)，N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)，N-甲基亞胺基二乙酸(MIDA)，α -丙氨酸-N，N- 二乙酸(a -ALDA)，絲氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)，異絲氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)，苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)，鄰氨基苯甲酸-N，N- 二乙酸(ANDA)，對氨基苯磺酸-N，N- 二乙酸(SLDA)，牛磺酸-N，N- 二乙酸(TUDA)，磺甲基-N，N-二乙酸(SMDA)，N-(羥乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)，二乙醇甘氨酸(DEG)，氨基三(亞甲基膦酸)(ATMP)。優選的螯合劑可含有氨基基團，并可為例如氨基聚羧酸或膦酸鹽。其可為含有一個、兩個或三個氨基基團的單體分子(通常為仲胺或叔胺基團)，且其可含有兩個、三個、四個或五個羧基基團或甚至更多的羧基基團。所述螯合劑可含磷或不含磷。有許多方式將螯合劑歸類，一種方式可如下所述螯合劑可為羧酸鹽，或可基于羧酸基團，如EDTA (乙二胺四乙酸)、NTA(2，2’，2〃-氮三乙酸)、檸檬酸鹽、2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸)、MGDA(甲基甘氨酸二乙酸或N，N’ - 二(羧甲基)丙氨酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、EDDS (乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸)、GLDA (L-谷氨酸-N，N- 二乙酸)、聚羧酸如PAA [聚丙烯酸]、PAA/PMA (丙烯酸/馬來酸共聚物)。含磷的螯合劑可為多磷酸鹽或膦酸鹽，如三磷酸鈉(STP)、HEDP(I-羥基亞乙基-1，I-二膦酸)、EDTMP[二(膦酰甲基)氨基]甲基膦酸]或(乙二胺四(亞甲基膦酸))、EDTMPA (乙二胺四亞甲基四膦酸)、DTPMP (二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸))、DTMPA (二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸))。所述螯合劑可含氮，如EDTA、NTA、DTPA, PDTA, GLDA, MGDA,EDDS, EDTMP, EDTMPA,以及 DTPMP 或 ASMA、ASDA, ASMP, IDA、SMAS, SEAS、SMGL, SEGL, MIDA、a -ALDA、SEDA、ISDA、PHDA, ANDA, SLDA, TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP,或其混合物。因此，優選的螯合劑可為，但不限于下述乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五亞甲基膦酸(DTMPA，DTPMP)、羥基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N，N’ - 二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(TOTA)、2_羥基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N，N- 二乙酸(N，N- 二羧甲基谷氨酸四鈉鹽)(GLDA)和氮三乙酸(NTA)或其混合物。所述螯合劑可以其酸形式或鹽存在，優選所述螯合劑可作為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽存在。其他螯合劑可為來源于植物材料的螯合劑，如例如下文詳述的含淀粉材料。此類天然螯合劑的實例為，但不限于植酸(亦稱作肌醇六磷酸(IP6)，或植酸(phytin)，或當鹽形式時稱作植酸鹽)、肌醇二磷酸、肌醇三磷酸或肌醇五磷酸。螯合劑可以以O. 000Iwt %至20wt%嘛優選O. 01至IOwt %,更優選O. I至5wt%的量存在于組合物中。親本α -淀粉酶親本α -淀粉酶可理論上為任何α -淀粉酶，對其期望制備在儲藏過程中或在使用中，例如在洗滌過程中或在淀粉水解工藝中具有改善的穩定性的變體。因此，所述改善的穩定性可觀察為在儲藏過程中淀粉分解活性喪失的減少或在使用過程中 活性和性能的增加。已知的α-淀粉酶來源于廣泛的生物選擇范圍，包括細菌，如來自芽孢桿菌屬(Bacillus)的種,例如地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis);來自真菌的種，如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus niger);來自植物如大麥，和來自哺乳動物。親本α-淀粉酶理論上可為任何此種α-淀粉酶而不論其來源。眾所周知許多由芽孢桿菌屬的種產生的α -淀粉酶在氨基酸水平高度類似。因為見于這些α-淀粉酶之間的高度同一丨!■生(substantial identity),它們被認為屬于同一類α -淀粉酶，即“ Termamyl樣α -淀粉酶”類。相應地，在本文語境中，術語“Termamyl樣” α -淀粉酶旨在表示下述α -淀粉酶，特別是芽孢桿菌α -淀粉酶，所述α -淀粉酶在氨基酸水平與具有本文SEQID NO:20中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(Termamyl )呈現高度同一性，即至少60%同一性。Termamyl 樣 α _ 淀粉酶許多已知的芽孢桿菌屬α -淀粉酶的同一性可見于下表I :表I
權利要求
1.一種包含親本α-淀粉酶的變體的組合物，其中使用根據SEQ ID Ν0:6的編號，所述變體在一個或多個選自195，193，197，198，200，203，206，210，212，213和243的位置包含取代，并進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21°C和pH 8. O測量時所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
2.前述任一項權利要求的組合物，其中當在21°C和pH 8. O在80mM氯化鉀和49mMEPPS中測量時所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
3.前述任一項權利要求的組合物，其中當在“材料和方法”中描述的測定法中測量時所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
4.前述任一項權利要求的組合物，其中所述螯合劑能夠在低于8mM，優選低于7mM，優選低于6mM，優選低于5mM，優選低于4mM的螯合劑濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至 O. IOmM0
5.包含親本α-淀粉酶的變體的組合物，其中使用根據SEQID Ν0:6的編號，所述變體在一個或多個選自195，193，197，198，200，203，206，210，212，213和243的位置包含取代，并進一步包含至少一種螯合劑，其中當在21 °C和pH 8測量時所述螯合劑能夠在低于O. 9倍能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的螯合劑濃度將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
6.前述任一項權利要求的組合物，其中所述螯合劑能夠在低于O.7倍，如低于O. 5倍，如低于O. 3倍能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. IOmM的檸檬酸鹽濃度的螯合劑濃度將游離鈣離子濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
7.前述任一項權利要求的組合物，其中所述變體在一個或多個對應于SEQID N0:6的成熟多肽的位置195，193，197，198，200，203，206，210，212，213或243的位置包含至少兩個取代。
8.前述任一項權利要求的組合物，其中所述親本α-淀粉酶序列通過至少一個下述取代修飾位置193是[G，Α，S，T或Μ];位置195是[F，W, Y，L，I或V];位置197是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 198 是[Q 或 N];位置 200 是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 203 是[F，W, Y，L，I 或V];位置 206 是[F，W，Y，N，L，I, V, H，Q，D 或 E];位置 210 是[F,ff,Y,L, I 或 V];位置 212 是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 213 是[G，A，S，T 或 M]或位置 243 是[F，W, Y，L，I 或 V]。
9.前述任一項權利要求的組合物，其中所述親本α-淀粉酶序列通過至少一個下述取代修飾位置193是T ;位置195是F或Y ;位置197是F或L ;位置198是N ;位置200是F ;位置203是F ;位置206是Y ;位置210是Y ;位置212是V，位置213是A或位置243是F。
10.前述任一項權利要求的組合物，其中使用SEQID Ν0:6用于編號，所述變體在181，182，183或184的氨基酸區中進一步包含至少一個、至少兩個、或至少三個缺失。
11.前述任一項權利要求的組合物，其中所述變體在一個或多個對應于SEQID Ν0:6的成熟多肽的位置195，193，197，198，200，203，206，210，212，213或243的位置包含取代并在一個或多個對應于位置 116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186,235,244，303，320，339，359，418，431，434，447 或 458 的位置包含取代。
12.前述任一項權利要求的組合物，其中所述變體在螯合劑存在下在pH8和31°C18小時之后具有至少60%剩余活性，其中所述螯合劑在21°C和pH 8. O在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
13.前述任一項權利要求的組合物，其中所述變體在螯合劑存在下在pH8和31°C18小時之后具有至少70%剩余活性，其中所述螯合劑在21°C和pH 8. O在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM，且其中所述剩余活性如“材料和方法”中所述測量。
14.前述任一項權利要求的組合物，其中當如“材料和方法”中所述在AMSA中測量時，所述變體相對于親本α-淀粉酶具有改善的洗滌性能。
15.權利要求I至14任一項所述的組合物，其中所述螯合劑選自下組EDTA，MGDA,EGTA，DTPA，DTPMP 和 HEDP。
16.—種用于制備多肽的方法,包括 (a)提供具有淀粉酶活性的親本多肽的氨基酸序列； (b)選擇占據對應于SEQID NO: 6的成熟多肽的位置195，197，198，200，203，206，210，212，213或243的一個或多個位置的一個或多個氨基酸，并進一步選擇對應于位置116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447或458的一個或多個位置； (c)通過取代或缺失選定的氨基酸殘基或鄰接選定的氨基酸殘基插入一個或多個氨基酸殘基來修飾所述序列； (d)產生具有修飾序列的變體多肽； (e)測試所述變體多肽的淀粉酶活性和穩定性；和 (f)選擇在螯合劑存在下相對于親本多肽穩定性增加并具有淀粉酶活性的變體多肽，其中在21°C和pH 8. 0，所述螯合劑在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
17.一種親本α-淀粉酶的變體，所述變體在對應于選自195，197，198，200，203，206，210,212,213,243的位置的一個或多個位置包含改變，并進一步在對應于選自116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447和458的位置的一個或多個位置包含改變，其中 (a)所述各改變獨立地為 (i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸， ( )缺失占據該位置的氨基酸，和/或 (iii)取代占據該位置的氨基酸， (b)所述變體具有α-淀粉酶活性；并且 (c)每個位置對應于具有SEQID Ν0:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
18.一種親本α-淀粉酶的變體，所述變體在181，182，183或184的氨基酸區中包含至少一個，至少兩個或至少三個缺失，并進一步在選自195，197，198，200, 203，206，210，212，213和243的一個或多個位置包含改變，并進一步在選自116，118，129，133，142，146，147，·149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447 和 458 的一個或多個位置包含改變，其中 (a)所述各改變獨立地 (i)緊接著該位置下游并鄰接該位置插入氨基酸，( )缺失占據該位置的氨基酸，和/或 (iii)取代占據該位置的氨基酸， (b)所述變體具有α-淀粉酶活性；并且 (c)每個位置對應于具有SEQID Ν0:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
19.權利要求17或18的變體，所述變體在包含螯合劑的組合物中相對于親本α-淀粉酶或相對于SEQ ID Ν0:6具有改善的穩定性，其中所述螯合劑在21°C和pH 8. O在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM。
20.權利要求17至19任一項所述的變體，其中所述變體在螯合劑存在下在pH818小時之后具有至少60%剩余活性，其中所述螯合劑在21°C和pH8. O在低于IOmM的濃度能夠將游離鈣離子的濃度從2. OmM減少至O. 10mM，其中所述剩余活性如“材料和方法”中所述測量。
21.權利要求17至20任一項所述的變體，其中當如“材料和方法”中所述在AMSA中測量時，所述變體相對于親本α -淀粉酶具有改善的洗滌性能。
22.權利要求17至21任一項所述的變體，其中具有淀粉分解活性的變體具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQ ID Ν0:6,8,10，12，18或20的成熟多肽具有優選至少60%，更優選至少65%，更優選至少70%，更優選至少75%，更優選至少80%，更優選至少85%，甚至更優選至少90%，并且最優選至少95%同一性。
23.權利要求17至22任一項所述的變體，其中具有淀粉分解酶活性的親本多肽由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優選至少低嚴格條件下，更優選至少中等嚴格條件下，甚至更優選至少中-高嚴格條件下，并且最優選至少高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ IDNO: 5，7，9或11，17，19的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQ ID NO: 5，7，9，11，17，19的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)⑴或(ii)的全長互補鏈。
24.一種分離的核苷酸序列，其編碼權利要求17至23任一項的變體。
25.一種重組宿主細胞，其包含SEQ ID N0:24的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及相對于其親本酶具有改善的針對螯合劑的穩定性的α-淀粉酶變體，包含所述變體的組合物，編碼所述變體的核酸，產生所述變體的方法和使用所述變體的方法。
文檔編號C12N9/28GK102869759SQ201180018387
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者A.斯文森, A.H.約翰森, M.E.比約恩瓦德, F.W.拉斯馬森, M.斯科約特, S.E.拉森, J.奧布羅, S.卡斯嘉德, L.貝耶爾 申請人:諾維信公司