藥理學誘導的轉基因消融系統的制作方法

專利名稱：藥理學誘導的轉基因消融系統的制作方法
藥理學誘導的轉基因消融系統I.介紹本發明涉及設計用于使用復制缺陷型病毒組合物遞送治療產物的基因治療系統，所述復制缺陷型病毒組合物用內建的安全機制工程改造，用于響應藥理學試劑-優選口服制劑如丸劑進行治療性基因產物的永久或暫時性消融。2.
背景技術：
基因治療涉及出于治療或治愈疾病的目的，將遺傳物質引入宿主細胞。許多疾病由導致必須蛋白不足的“缺陷型”基因引起。一種糾正不正確的基因表達的方式是在基因組內部非特異性位置插入正常的基因(轉基因)，用于取代非功能性的或“缺陷的”致病基因。基因治療還可作為遞送治療性蛋白質或RNA以進行多種疾病治療的平臺，從而治療產 物表達時間延長，減少重復給藥的需要。將轉基因遞送至病人的靶細胞必須使用稱為載體的運載體分子，最常見的載體是遺傳改造攜帶正常人類基因的病毒。病毒已經進化出以病理學的方式將其基因組包裝并遞送至人細胞的方式，因此可操縱病毒基因組插入治療性基因。將基于腺病毒或腺伴隨病毒(AAV)的載體體內遞送至非分裂細胞后可實現穩定的轉基因表達，或者通過使用例如基于逆轉錄病毒和慢病毒的整合型或非整合型載體離體轉導的干細胞的移植實現。使用AAV載體進行治療的原因之一是AAV是非病原性的，它不引起有害的免疫應答，并且AAV轉基因表達常常持續數年或動物模型的一生(參見Shyam等，Clin. Microbiol. Rev. 24(4) :583-593)。AAV是一種小的非包膜型人細小病毒，其中包裝
4.7kb的線性單鏈DNA基因組。AAV的生產性感染僅在出現輔助病毒時發生，如腺病毒或皰疹病毒。當沒有輔助病毒時，AAV以高頻率整合入宿主基因組的特定位點(19q 13-qter),從而使AAV成為唯一已知能夠定點整合的哺乳動物DNA病毒。參見Kotin等，1990，PNAS,87:2211-2215.然而，不包含任何病毒基因僅含有治療性基因的重組AAV不整合進入基因組。相反，重組病毒基因組通過末端反向重復在其末端進行融合形成環狀游離形式，預測這是長期基因表達的主要原因(參見Shyam等，Clin. Microbiol. Rev. 24(4) :583-593)。實際上，所有基因治療的臨床前和臨床應用都使用從組成型啟動子表達轉基因的載體，這意味著只要載體基因組存在，轉基因活化水平固定。然而，許多適用于基因治療的疾病需要進行轉基因表達的調節。已有對于多種系統的描述，這些系統基于的一般原則是將感興趣的基因置于藥物誘導性工程改造的轉錄因子的控制之下，從而正向誘導基因表達(Clackson 等，1997, Curr Opin Chern BioI, I (2) :210-8 ;Rossi 等，Curr OpinBiotechnol，1998. 9(5) :451-6頁)。可將不同的系統分為兩類。首先，誘導物如四環素、抗孕激素或蛻皮激素變構調節的DNA-結合域與反式激活結構域偶聯。加入(有些情況下是去除)藥物引起DNA結合，然后轉錄活化。其次，用多種誘導接近的常用機制替換變構控制。DNA結合和激活結構域作為分離的多肽表達，通過加入稱為二聚化化學誘導物或“二聚化因子”(dimerizer)的二價小分子使其重組為活化的轉錄因子。雖然這些系統在需要誘導轉基因表達的基因治療系統中有用，如果不再需要轉基因表達，或者由于長期給藥引起毒性，它們無法滿足關閉或永久消融轉基因表達的需要。
3.發明概述本發明涉及設計用于使用復制缺陷型病毒組合物遞送治療產物的基因治療系統，所述復制缺陷型病毒組合物用內建的安全機制工程改造，響應藥理學試劑-優選口服制劑如丸劑產生進行治療性基因產物的永久或暫時性消融。、本發明部分基于申請人開發的整合方案，本文稱為“PITA”(藥理學誘導的轉基因消融)，用于轉基因消融或者負向調節轉基因表達。該方案中，使用復制缺陷型病毒遞送編碼治療產物(RNA或者蛋白質)的轉基因使其在對象中表達，但是可以通過給予藥理學試劑可逆或不可逆的將其關閉。相對于藥理學試劑正向調節轉基因表達的系統，本發明具有很多優勢。在這些情況下，如果需要轉基因以持續時間表達，接受者必須服用藥物-持續的時間可能很長并伴隨其自身的毒性。 在一個方面，本發明提供了適合用于人對象的復制缺陷型病毒組合物，其中對病毒基因組進行工程改造使其包含(a)編碼治療產物的第一個轉錄單元，其與控制轉錄的啟動子可操作性連接，所述單元包含至少一個消融識別位點；和(b)編碼對于至少一個消融識別位點特異的消融因子的第二轉錄單元，其與啟動子可操作性連接，其中轉錄和/或消融活性受到藥理學試劑如二聚化因子的控制。例如，一種合適的藥學試劑可以是雷帕霉素或雷帕霉素類似物。所述病毒組合物可包含兩個或多個不同的病毒原種。在一個方面，本發明提供適用于人對象的復制缺陷型病毒組合物，其中病毒基因組包含(a)編碼治療產物的第一個轉錄單元，其與控制轉錄的啟動子可操作性連接，所述第一轉錄單元包含至少一個消融識別位點；以及編碼對于至少一個消融識別位點特異的消融因子的第二轉錄單元，其與啟動子可操作性連接，其中轉錄和/或消融活性受到藥理學試劑的控制。所述第一個轉錄單元可包含多于一個消融識別位點。當基因組包含多于一個消融識別位點時，所述多于一個消融識別位點包含第一個消融識別位點和不同于第一個消融識別位點的第二個消融識別位點，所述病毒還包含對于第一個消融識別位點特異的第一個消融因子，以及對于第二個識別位點特異的第二個消融因子。在一個實施方式中，通過調節型系統控制消融因子的轉錄、生物活性和/或DNA結合特異性。所述調節型系統可選自tet-on/off系統、tetR-KRAB系統、米非司酮(RU486)調節型系統、他莫昔芬-依賴性調節型系統、雷帕霉素-調節型系統或基于蛻皮激素的調節型系統。在一個實施方式中，所述消融因子由下述組成與第一轉錄單元的消融識別位點結合并且剪切或消融DNA的內切核酸酶、重組酶、大范圍核酸酶或鋅指內切核酸酶，以及消融第一轉錄單元RNA轉錄物或抑制第一轉錄單元RNA轉錄物翻譯的干擾RNA、核酶或反義物。在一個具體實施方式
中，所述消融因子是Cre，所述消融識別位點是ΙοχΡ，或者所述消融因子是FLP且所述消融識別位點是FRT。在一個實施方式中，所述消融因子是嵌合的經工程改造的內切核酸酶，其中所述病毒組合物包括(i)含與第一藥理學試劑結合域融合的內切核酸酶DNA結合域的第一序列；并且其中所述病毒組合物還包括(ii)編碼與第一藥理學試劑結合域融合的內切核酸酶的核酸酶切割結構域的第二序列，其中所述第一序列(i)和第二序列(ii)各與至少一個控制其表達的啟動子可操作性連接。嵌合的經工程改造的內切核酸酶可包含于第二轉錄單元的單個雙順反子開放閱讀框內，所述轉錄單元還包括α)和(ii)之間的接頭。序列(ii)任選具有誘導性啟動子。在另一實施方式中，嵌合的經工程改造的內切核酸酶的融合搭檔/片段包含于分離的開放閱讀框內。在一個實施方式中，所述第一序列和所述第二序列各在組成型啟動子的控制之下，并且消融因子被第一種藥理學試劑生物活化。消融因子的編碼序列還包含位于消融編碼序列5’或3’端的核定位信號。在一個實施方式中，DNA結合域由下組組成鋅指、螺旋-轉角-螺旋、HMG-盒、Stat蛋白、B3、螺旋-環-螺旋、翼狀螺·旋-轉角-螺旋、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、POU結構域和同源結構域。在另一實施方式中，內切核酸酶由下組組成11型限制性內切核酸酶、內含子內切核酸酶和絲氨酸或酪氨酸重組酶。在一個具體的實施方式中，所述消融因子是嵌合FokI酶。在又一實施方式中，在本發明的復制缺陷型病毒組合物中，病毒基因組還包含第三和第四轉錄單元，各編碼調節融合因子的誘導型啟動子的轉錄因子的可二聚化結構域，其中(C)第三種轉錄單元編碼與第一啟動子可操作性連接的藥理學試劑結合域融合的轉錄因子DNA結合域；以及(d)第四種轉錄單元編碼與第二啟動子可操作性連接的藥理學試劑結合域融合的轉錄因子活化結構域。(c)的所述第一啟動子和(d)的所述第二啟動子獨立地選自組成型啟動子和誘導型啟動子。在另一實施方式中，所述第一和第二啟動子均為組成型啟動子，并且藥理學試劑是使轉錄因子結構域二聚化的二聚化因子。在另一實施方式中，所述第一和第二啟動子之一是誘導型啟動子。所述第三和第四轉錄單元可以是包含IRES和弗林蛋白酶(furin) -2A的雙順反子單元。在一個實施方式中，所述藥理學試劑是雷帕霉素或雷帕霉素衍生物。在一個實施方式中，所述病毒是AAV。該AAC選自如AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和rhlO。其它病毒可用于產生本發明的DNA構建體和復制缺陷型病毒，包括如腺病毒、單純皰疫病毒等。在一個實施方式中，治療產物是中和HIV感染的抗體或抗體片段、可溶性血管內皮生長因子受體-l(sFlt-l)、VIII因子、IX因子、胰島素樣生長因子(IGF)、肝細胞生長因子(HGF)、血紅素加氧酶-I (H0-1)或神經生長因子(NGF)。在復制缺陷型病毒組合物的一個實施方式中，第一轉錄單元和第二轉錄單元是組合物中的不同病毒原種。任選第一轉錄單元和第二轉錄單元在第一病毒原種中，且第二病毒原種包含第二消融因子。在一個實施方式中，重組DNA構建體包含與病毒基因組包裝信號側接的第一和第二轉錄單元，其中(a)編碼治療產物的第一個轉錄單元，其與控制轉錄的啟動子可操作性連接，所述單元包含至少一個消融識別位點；和(b)編碼對于至少一個消融識別位點特異的消融因子的第二轉錄單元，其與響應藥理學試劑誘導轉錄的啟動子可操作性連接。與轉錄單元側接的包裝信號可以是AAV 5’末端反向重復(ITR)和AAV 3’ ITR0任選AAV ITR為AAV2、或者AAVl、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或rhlOITR。在一個實施方式中，所述第一轉錄單元與AAV ITR側接，并且第二、三、四種轉錄單元與AAV ITR側接。所述轉錄單元任選包含于兩種或更多DNA構建體中。在一個實施方式中，治療產物是中和HIV感染的抗體或抗體片段、可溶性血管內皮生長因子受體-l(sFlt-l)、VIII因子、IX因子、胰島素樣生長因子(IGF)、肝細胞生長因子(HGF)、血紅素加氧酶-I (HO-I)或神經生長因子(NGF)。在一個實施方式中，控制治療產物轉錄的啟動子是組成型啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子、誘導型啟動子或響應生理線索的啟動子。描述一種用于治療人對象中年齡相關黃斑變性的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是VEGF拮抗劑。提供一種用于治療人對象中血友病A的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是VIII因子。提供一種用于治療人對象中血友病B的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是IX因子。 提供一種用于治療人對象中心力衰竭的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是胰島素樣生長因子或肝細胞生長因子。提供一種用于治療人對象中中樞神經系統紊亂的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是神經生長因子。提供一種用于治療人對象中HIV感染的方法，包括給予有效量的本文所述復制缺陷型病毒組合物，其中治療產物是針對HIV的中和抗體。本文提供用于控制轉基因產物遞送的復制缺陷型病毒。所述產物可由下組組成VEGF拮抗劑、IX因子、VIII因子、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子、神經生長因子和針對HIV的中和抗體。提供遺傳工程改造的細胞，其中包含本文所述的復制缺陷型病毒或DNA構建體。遺傳工程改造的細胞可選自植物、細菌或非人哺乳動物細胞。提供確定何時給予用于消融對象中的治療產物的藥理學試劑的方法，所述對象接受了如本文所提供的包含治療產物和消融因子的復制缺陷型病毒，所述方法包括(a)檢測獲自病人組織樣品中治療產物的表達，和(b)檢測所述對象中與治療產物存在相關的副作用，其中檢測所述對象中與治療產物存在相關的副作用表明需要給予誘導消融因子表達的藥理學試劑。提供確定何時給予用于消融對象中的治療產物的藥理學試劑的方法，所述對象接受了如本文所提供的編碼治療產物和消融因子的復制缺陷型病毒組合物，所述方法包括檢測來自所述對象的組織樣品中與治療產物存在相關的毒性生化標記物的水平，其中反應毒性的標記物水平表明需要給予誘導消融因子表達的藥理學試劑。這些方法還包含測定來自后續給予誘導消融因子表達的藥理學試劑的對象的組織樣品中編碼治療性基因產物DNA、其RNA轉錄物或其編碼蛋白質的存在，其中存在編碼治療性基因產物DNA、其RNA轉錄物或其編碼蛋白質表明需要重復給予誘導消融因子表達的藥理學試劑。本發明還提供用于控制入轉基因產物遞送的本文所述復制缺陷型病毒。在另一實施方式中，本發明提供了遺傳工程改造的細胞，包含如本文所述復制缺陷型病毒或DNA構建體。該細胞可以是植物、酵母、真菌、昆蟲、細菌、非人哺乳動物細胞或人細胞。在另一實施方式中，本發明提供確定何時給予用于消融對象中治療產物的藥理學試劑的方法，所述對象接受了如本文所提供的編碼治療產物和消融因子的復制缺陷型病毒，所述方法包括(a)檢測獲自病人組織樣品中治療產物的表達，和(b)檢測所述對象中與治療產物存在相關的副作用，其中檢測所述對象中與治療產物存在相關的副作用表明需要給予誘導消融因子表達的藥理學試劑。在另一實施方式中，本發明提供確定何時給予用于消融對象中的治療產物的藥理學試劑的方法，所述對象接受了如本文所提供的編碼治療產物和消融因子的復制缺陷型病毒組合物，所述方法包括檢測來自所述對象的組織樣品中與治療產物存在相關的毒性生化標記物的水平，其中反應毒性的標記物水平表明需要給予誘導消融因子表達的藥理學試劑。從下述發明詳述很容易了解本發明的其他方面和優點。如本文中所用，以下術語具有所示含義
“單元”指轉錄單元。“轉基因單元“指包含如下的DNA(I)編碼轉基因的DNA序列；(2)包含于轉基因內或者與轉基因側接的消融識別位點(ARS);以及(3)調節轉基因表達的啟動子序列。“消融識別位點”或“ARS”所指DNA序列(I)能被來自轉基因單元的消融或剪切轉基因的消融因子識別；或⑵編碼消融識別RNA序列(ARRS)。“消融識別RNA序列”或“ARRS”指被消融因子識別的RNA序列，所述消融因子消融轉基因的轉錄產物或其mRNA的翻譯。“消融因子”指任何基因產物，如翻譯或轉錄產物，特異性識別/結合(a)轉基因單元的ARS，并切割或剪切轉基因；或(b)轉錄轉基因單元的ARRS，并切割或阻礙mRNA轉錄物的翻譯。“消融單元”所指DNA包含(I)編碼消融因子的DNA序列；和⑵控制所述消融因子表達的啟動子序列。“可二聚化的轉錄因子(TF)結構域單元”指(I)編碼與啟動子控制下的二聚化因子結合域融合的TF DNA結合域(DNA結合域融合蛋白)的DNA序列；和(2)編碼與啟動子控制下的二聚化因子結合域融合的TF活化結構域(活化結構域融合蛋白)的DNA序列。在一個實施方式中，可二聚化結構域的各單元受到組成型啟動子的控制，并且該單元用于控制消融因子的啟動子。或者，一種或多種啟動子可以是誘導型啟動子。“可二聚化的融合蛋白單元”指(I)編碼與二聚化因子結合域融合的蛋白質或酶(如消融因子)的單元、亞單元或片段的第一 DNA序列，以及(2)編碼蛋白質或酶的單元、亞單元或片段的第二 DNA序列，當表達和激活(若需要)時組合形成融合蛋白。該“可二聚化的融合蛋白”可用于多種目的，包括活化消融因子的啟動子、提供DNA特異性、將結合域和催化結構域靠近以活化嵌合消融因子、或產生所需的轉基因。單元(I)和(2)可在單一啟動子控制下由合適的接頭分離的單一開放閱讀框內(如IRES或2A自身切割蛋白質)，或者在獨立啟動子的控制下位于分離的開放閱讀框內。通過下文的詳述，顯而易見，組成型或誘導型的多種組合可用于該單元的兩個組分，取決于該融合蛋白單元的用途(如，用于表達消融因子)。在一個實施方式中，二聚化的融合蛋白單元包含DNA結合域，如鋅指基序、同源結構域基序、HMG-盒結構域、STAT蛋白質、B3、螺旋-環-螺旋、翼狀螺旋-轉角-螺旋、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、POU結構域、抑制子的DNA結合域、癌基因的DNA結合域以及自然產生的能夠識別>6個堿基對的序列特異性DNA結合蛋白。
“二聚化因子”指能與TF結構域融合蛋白或可二聚化融合蛋白的可異二聚化結合域結合并誘導所述融合蛋白的二聚化或寡聚化的化合物或其它部分。通常，二聚化因子作為藥物組合物給予對象。“副作用”指通過給予本發明的復制缺陷型病毒組合物遞送給病人的轉基因產物在患者中除了產生需要的治療效果外，還產生的不想要的第二效應。“復制缺陷型病毒”或“病毒載體”指在復制缺陷型病毒顆粒中包裝的含感興趣基因的合成或人工基因組；即能夠感染靶細胞但無法產生后代病毒顆粒的顆粒。病毒載體的人工基因組不包括編碼復制所需酶的基因(可將基因組工程改造為“無膽的”(gutless)-僅包含與人工基因組擴增和包裝所需信號側接的感興趣的轉基因)。除非存在復制所需的病毒酶，否則后代病毒顆粒的復制和感染無法發生，因此在基因治療中使用被認為是安全的。 “病毒原種”或“復制缺陷型病毒原種”指在包裝相同人工/合成基因組的病毒載體(換言之，同源或克隆性群)。當編碼與結合域融合的內切核酸酶消融因子的催化結構域的序列和編碼與結合域融合的內切核酸酶的DNA結合域的序列共表達時，產生“嵌合的經工程改造的消融因子”或“嵌合酶”。所述嵌合的經工程改造的酶是二聚體，所述DNA結合域選自如鋅指和其它同源結構域基序、HMG-盒結構域、STAT蛋白質、B3、螺旋-環-螺旋、翼狀螺旋-轉角-螺旋、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、POU結構域、抑制子的DNA結合域、癌基因的DNA結合域以及自然產生的能夠識別>6個堿基對的序列特異性DNA結合蛋白。[1995年7月25日授權的US5，436，150]。當形成異二聚體時，結合域對于誘導二聚化的藥理學試劑具有特異性，以提供所需的消融因子的酶生物活性、DNA結合特異性和/或轉錄。通常，選擇具有雙結構域的酶，即易于區分的催化結構域和DNA結合域。在一個實施方式中，選擇II型限制性內切核酸酶。在一個實施方式中，基于具有兩個功能性結構域的內切核酸酶設計嵌合內切核酸酶，而不依賴于ATP水解。有用的核酸酶包括II型S內切核酸酶，如FokI，或內切核酸酶如NaeI。另一合適的內切核酸酶可選自內含子內切核酸酶，如I-TevI。其它合適的核酸酶包括如整合酶(催化整合)，絲氨酸重組酶(催化重組)，酪氨酸重組酶，反轉酶(如Gin)(催化反轉(inversion))，解離酶(如Tn3)和催化易位、解離、插入、刪除、降解或交換的核酸酶。然而，也可選擇其它合適的核酸酶。4.附圖簡述

圖1A-1D。就rAAV7產量和釋放入培養基比較轉染試劑。圖1A-1B :將HEK293細胞種于六孔板中，并使用磷酸鈣(圖1A)或聚氮丙啶(PEI)(圖1B)作為轉染試劑轉染三種質粒(分別攜帶載體基因組，AAV2rep/AAV7cap基因和腺病毒輔助功能)。細胞裂解物中出現DNA酶抗性載體基因組拷貝(GC)，并用qPCR對轉染后72小時的產物培養基進行定量。圖IC和ID :用磷酸鈣(圖1C)或PEI (圖1D)法對含HEK293細胞的十層康寧(Corning)細胞堆疊進行三次轉染，并于120小時后測定培養物上清和細胞中的載體GC。圖2。500nM鹽存在與否的條件下，PEI轉染后不同血清型的產量和釋放。用包含所示5種不同AAV衣殼基因中一種的PEI和DNA混合物三次轉染15cm板中的HEK 293細胞。轉染后5天，在接觸O. 5M鹽與否的條件下收集培養基和細胞，對DNA酶抗性載體基因組的拷貝(GC)進行定量。每個細胞產生的GC表示為各柱上所示上清中發現載體的百分比。
圖3A-3B.從濃縮培養產物上清中大規模碘克沙醇梯度純化rAAV7載體。圖3A 在碘克沙醇梯度上濃縮和分離來自細胞堆疊培養基的rAAV7載體，并從試管底部收集組分(組分I)。在340nm監控碘克沙醇密度，并通過qPCR獲得各組分中基因組的拷貝數。圖3B :用SDS-PAGE分析每一組分中的Ix IOwGC,并用sypro ruby染色顯示蛋白質。V=驗證批次；M=分子量標記物。標明AAV衣殼蛋白質VP1、VP2和VP3。SDS-PAGE膠上的白框表示純AAV載體峰。圖4。大規模rAAV產物批次的純度。將Ix IO10GC大規模AAV8和AAV9載體制備物上樣于SDS-PAGE膠,并用sypro ruby染色顯示蛋白質。對所有蛋白質條帶進行定量,計算衣殼的百分比純度(VP1、VP2和VP3蛋白質，表示為相對總蛋白質)，并在膠下方標注。將大規模批次的純度與小規模CsCl梯度純化的AAV9載體比較。圖5A-G。測定大規模rAAV8和rAAV9產生批次中空/滿顆粒比。用醋酸雙氧鈾負 染大規模rAAV8和rAAV9載體制備物，并用透射電鏡檢測。圖5A測試運行I。圖5B是測試運行8。圖5C是測試運行9。圖是測試運行10。圖5E是測試運行11。圖5F是測試運行12。基于電子密度中心區分空顆粒，并用箭頭表示。圖下顯示空/滿顆粒比例以及空顆粒的百分比。圖5G是包括在此比較分析中的小規模AAV8載體制備。圖6A-6G。rAAV8、rAAV9和rAAV6載體體外相對轉導。圖6A-F:在腺病毒存在的條件下，以MOI of Ix IO4GC/細胞，使用大規模和小規模工藝產生的rAAV-eGFP載體批次一式三份轉染HEK 293細胞。在48小時PI對GFP轉基因表達照相。圖6G:通過測定產物亮度水平和像素相對于背景水平，直接從數字圖像中定量eGFP的熒光強度。圖7A-7G。rAAV8和rAAV9大規模生產批次的肝臟轉導。圖7A-7F:將小規模和大規模工藝產生的Ix IO11GC rAAV8-eGFP和rAAV9-eGFP載體i. V.注射C57BL/6小鼠。圖7A是AAV9的測試運行1，圖7B是AAV9的測試運行9，圖7C是AAV9的CsCl (小規模)。圖7D是AAV8的測試運行10。圖7E是AAV8的測試運行12，圖7F是AAV8的CsCl (小規模)。注射后9天比較肝臟切片中的eGFP熒光。圖7G :通過測定產物亮度水平和像素相對于背景水平，直接從數字圖像中定量eGFP的熒光強度。各柱代表兩只動物的肝臟樣品的平均強度值。圖8A和8B。包含可二聚化轉錄因子結構域和消融單元的PITA DNA構建體。圖8A是DNA構建體圖譜，包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元pAAV. CMV.TF. FRB-IRES-lxFKBP. Cre0圖8B是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. I部分對于不同載體結構域進行了描述。圖9A和9B。包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元的PITA DNA構建體。圖9A是DNA構建體的圖譜，包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元pAAV.CMV. TF. FRB-T2A-2xFKBP. Cre0圖9B是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. I部分對于不同載體結構域進行了描述。圖IOA和10B。包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元PITA DNA構建體。圖IOA是DNA構建體的圖譜，包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元pAAV.CMV173. TF. FRB-T2A-3xFKBP. Cre。圖IOB是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. I部分對于不同載體結構域進行了描述。圖IlA和11B。包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元PITA DNA構建體。圖IlA是DNA構建體的圖譜，包含可二聚化的轉錄因子結構域單元和消融單元pAAV.CMV. TF. FRB-T2A-2xFKBP. ISce-I。圖IlB是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. I部分對于不同載體結構域進行了描述。圖12A和12B。含有轉基因單元的PITA DNA構建體。圖12A是DNA構建體的圖譜，其包含轉基因單元pENN. CMV. PLloxP. Luc. SV40。圖12B是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. 2部分對于不同載體結構域進行了描述。圖13A和13B。含有轉基因單元的PITA DNA構建體。圖13A是DNA構建體的圖譜，其包含轉基因單元pENN. CMV. PISceI. UC. SV40。圖13B是插入質粒主鏈的轉錄單元的動畫圖。本文8. 2部分對于不同載體結構域進行了描述。圖14。包含可二聚化轉錄因子結構域和轉基因單元的PITA DNA構建體。圖14是·包含轉基因單元和可二聚化轉錄因子結構域的載體的圖譜。本文8. I和8. 2部分對于不同載體結構域進行了描述。圖15A-B。雷帕霉素處理后體外誘導熒光素酶。圖15A的柱狀圖顯示雷帕霉素處理與否48小時后的所示DNA構建體(DNA構建體1_6)轉染的細胞中的相對熒光素酶活性。圖15B的柱狀圖顯示雷帕霉素處理與否72小時后所示DNA構建體(DNA構建體1_6)轉染的細胞中的相對熒光素酶活性。圖16A-D。在二聚化因子誘導系統的體內模型中，四組小鼠接受含有下列DNA構建體的AAV載體的IV注射。圖16A是編碼泛素組成型CMV啟動子控制下的GFP熒光素酶的DNA構建體的示意圖，將其通過AAV載體遞送給第I組小鼠。圖16B的圖顯示編碼下述的DNA構建體(I) CMV啟動子驅動的可二聚化轉錄因子結構域單元(FRB與p65激活結構域融合，DNA結合域ZFHD與三拷貝的FKBP融合)；和(2)表達二聚化TF誘導的啟動子所驅動的GFP-熒光素酶的AAV載體，將所述DNA構建體通過AAV載體遞送給第2組小鼠。圖16C的圖顯示編碼肝臟組成型啟動子TBG控制下的GFP-熒光素酶的DNA構建體，將其通過AAV載體遞送給第3組小鼠。圖16D的圖顯示編碼下述的DNA構建體(I)表達TBG啟動子驅動的二聚化轉錄因子結構域的AAV載體；和(2)表達二聚化TF誘導的啟動子驅動下的GFP-熒光素酶的AAV載體，將所述DNA構建體通過AAV載體遞送給第4組小鼠。圖17A-D。接受含有不同DNA構建體的3xlOnAAV病毒顆粒的4組小鼠注射熒光素酶底物熒光素30分鐘后的照片。圖17A顯示給予雷帕霉素前(前)后(后)的第I組小鼠不同組織中的熒光素酶表達，主要位于肺、肝臟和肌肉中。圖17B顯示第2組小鼠給予雷帕霉素前(前)后(后)的熒光素酶表達，主要位于肝臟和肌肉中。圖17C顯示給予雷帕霉素(后)第3組小鼠的熒光素酶表達，主要位于肝臟和肌肉中，在給予雷帕霉素之前(前)沒有熒光素酶的表達。圖17D顯示給予雷帕霉素后(后)熒光素酶的表達限制于肝臟中，在給予雷帕霉素之前(前)沒有熒光素酶的表達。圖18A-D。接受含有不同DNA構建體的IxIO11AAV病毒顆粒的4組小鼠注射熒光素酶底物熒光素30分鐘后的照片。圖18A顯示給予雷帕霉素前(前)后(后)第I組小鼠的不同組織中的熒光素酶表達，主要位于肺、肝臟和肌肉中。圖18B顯示給予雷帕霉素前(前)后(后)第2組小鼠的熒光素酶的表達，主要位于肝臟和肌肉中。圖18C顯示給予雷帕霉素后(后)第3組小鼠的熒光素酶表達主要位于肝臟和肌肉中，在給予雷帕霉素之前(前)沒有熒光素酶的表達。圖18D顯示給予雷帕霉素后(后)熒光素酶的表達限制于肝臟中，在給予雷帕霉素之前(前)沒有熒光素酶的表達。圖19A-C。治療AMD的PITA DNA構建體。圖19A顯示包含編碼可溶性VEGF受體sFlt-Ι的轉基因單元的DNA構建體。圖19B顯示包含受IRES調節的安維汀(Avastin)IgG重鏈(安維汀H)和輕鏈(安維汀L)的雙順反子DNA構建體。圖19C顯示包含被T2A序列分開的安維汀IgG重鏈(安維汀H)和輕鏈(安維汀L)的雙順反子DNA構建體。
圖20A-B。用于治療肝臟代謝疾病的PITA DNA構建體。圖20A顯示用于治療血友病A和/或B的PITA DNA構建體，包括含IX因子的轉基因單元。圖20B顯示用于靶向HCV的IRES遞送shRNA的DNA構建體。圖21A-B。用于治療心臟疾病的PITA DNA構建體。圖21A顯示用于治療充血性心臟衰竭的PITA DNA構建體，包括含胰島素樣生長因子(IGFl)的轉基因單元。圖21B顯示用于治療充血性心臟衰竭的PITA DNA構建體，包括含肝細胞生長因子(HGF)的轉基因單

圖22。用于治療CNS疾病的PITA DNA構建體。圖22顯示用于治療阿耳茨海默病的PITA DNA構建體，包括含神經生長因子(NGF)的轉基因單元。圖23。用于治療HIV的PITA系統。圖23顯示包括含HIV抗體重鏈和輕鏈的轉基因單元的PITA DNA構建體，以及包含消融單元和可二聚化TF結構域單元的PITA DNA構建體。圖23還顯示雷帕霉素類似物(rapalog)能夠誘導消融因子ere的表達，以消融含有轉基因單元的PITA DNA構建體產生的轉基因(HIV抗體的重鏈和輕鏈)。圖24. PITA系統一個實施方式的示意圖。圖24顯示了編碼與組成型啟動子可操作性連接的治療性抗體的轉基因單元，編碼與轉錄因子誘導型啟動子可操作性連接的內切核酸酶的消融單元，以及可二聚化的TF結構域單元，各轉錄因子結構域的融合序列可操作性連接組成型啟動子。在給予雷帕霉素或其衍生物之前治療性抗體和兩種轉錄因子結構域融合蛋白基線表達。給予雷帕霉素后，二聚化的轉錄因子誘導內切核酸酶的表達，其切割轉基因單元內的內切核酸酶識別結構域，從而消融轉基因表達。圖25A-25B的柱狀圖顯示，當將包括含FokI消融位點的轉基因的DNA質粒和編碼FokI酶的質粒共轉染入靶細胞時，野生型FokI有效消融轉基因的表達。圖25A，柱I表示50ng pCMV 熒光素酶，圖 2 表示 50ng pCMV 熒光素酶+200ngpCMV. FokI，柱 3 表示 50ng pCMV熒光素酶+轉染FokI蛋白質，柱4表示單獨轉染FokI蛋白質；柱5表示未轉染對照。圖25B，柱I表示單獨50ng pCMV. Luc，后續的柱代表與pCMV熒光素酶共轉染的ZFHD-FokI表達質粒(6. 25,12. 5, 25, 50和IOOng)的濃度升高。實施例IlA對該研究進行了描述。圖26A-B的柱狀圖顯示了通過鋅指同源異型結構域連接非同源識別位點的嵌合的經工程改造的酶有效消融轉基因的表達。圖26A比較了與pCMV熒光素酶共轉染的編碼非連接FokI (6. 25ng、12. 5ng、25ng、50ng和IOOng)的表達質粒的升高的濃度。第一根柱提供了單獨50ng pCMV. Luc的陽性對照。圖26B比較了與pCMV熒光素酶共轉染的編碼通過融合鋅指同源異型結構域而與DNA連接的FokI (6. 25ng、12. 5ng、25ng、50ng和IOOng)的表達質粒的升高的濃度。第一根柱提供了單獨50ng pCMV.Luc的對照。實施例IlB對該研究進行了描述。圖27A-B的柱狀圖顯示了嵌合FokI的DNA結合特異性可通過與不同類型的異源DNA結合域融合可重復地進行改變，并且靶轉基因的消融可通過加入異源核定位信號(NLS)進一步改良。圖27A顯示了 pCMV熒光素酶與升高濃度的編碼FoKI的表達質粒共轉染的結果(6. 25，12. 5，25，50和IOOng)，所述FoKI通過HTH融合而與DNA連接。第一根柱顯示單獨50ng pCMV熒光素酶的對照。圖27B顯示了 pCMV.熒光素酶與升高濃度的編碼HYH-FokI融合物的表達質粒共轉染的結果，在其N末端還含有NLS (6. 25，12. 5，25，50和IOOng)。第一根柱提供了單獨50ngpCMV熒光素酶的對照。實施例IlC對該研究進行了描述。5.發明詳述在PITA系統中，在復制缺陷型病毒組合物中使用一種或多種復制缺陷型病毒，其中對病毒基因組進行工程改造使其包含(a)編碼治療產物的第一個轉錄單元，將其與控制轉錄的啟動子操作性連接，所述單元包含至少一個消融識別位點；和(b)編碼對于消融識別位點特異的消融因子(或其作為融合蛋白單元的片段)的第二轉錄單元，將其與響應 藥理學試劑而誘導轉錄的啟動子操作性連接。可使用任何特異二聚化所選結構域的結構域的藥理學試劑。在一個實施方式中，可使用雷帕霉素和其稱為”雷帕霉素類似物”的類似物。包含第一轉錄單元的病毒基因組可包含兩個或多個相同的消融識別位點或兩個或多個不同的消融識別位點(即那些對不同的消融因子特異的位點，而不識別其它消融識別位點)。不管相同或是不同，這兩個或多個消融識別位點可與另一個串聯，或位于彼此非比鄰的位置上。此外，消融識別位點可位于相對轉基因編碼序列的任何位置上，即在轉基因編碼序列的內部，編碼序列的5’(如緊接5’或被一個或多個堿基分隔，如啟動子的上游或下游)或編碼序列的3’ (如緊接3’或被一個或多個堿基分離，如聚A序列的上游)。消融因子指任何基因產物，如翻譯或轉錄產物，其特異性識別/結合(a)轉基因單元的消融識別位點(ARS)，并切割或剪切轉基因；或(b)轉錄轉基因單元的消融識別RNA序列(ARRS)，并切割或抑制mRNA轉錄物的翻譯。如本文所述，消融因子可選自下組結合第一轉錄單元中的消融識別位點并剪切或消融DNA的內切核酸酶、重組酶、大范圍核酸酶，以及消融第一轉錄單元中RNA轉錄物或抑制第一轉錄單元中RNA轉錄物翻譯的干擾RNA、核酶、或反義。在一個具體的實施方式中，消融因子是Cre (其消融位點是IoxP)，或消融因子是FLP (其消融位點是FRT)。在一個實施方式中，選擇的內切核酸酶功能不依賴于ATP水解。此類消融因子的例子包括II型S內切核酸酶(如FokI)、NaeI以及內含子內切核酸酶(如I-TevI)，整合酶(催化整合)，絲氨酸重組酶(催化重組)，酪氨酸重組酶，反轉酶(如Gin)(催化反轉)，解離酶(如Tn3)，以及催化轉位、解離、插入、刪除、降解或交換的核酸酶。然而，也可選擇其它合適的核酸酶。為了永久性關閉治療性轉基因，消融因子可以是與第一轉錄單元的消融識別位點結合的內切核酸酶，并消融或剪切基因。當需要暫時關閉轉基因時，應選擇與治療性轉基因的RNA轉錄物中消融位點相結合的消融因子，并消融轉錄物或抑制其翻譯。這種情況下可以使用干擾RNA、核酶或反義系統。當給予治療性轉基因用于治療癌癥、本領域技術人員了解的多種遺傳疾病或用于介導宿主免疫應答時，尤其需要這種系統。消融因子的表達可受到多種元件的調控，包括如誘導型啟動子和/或如本文所述通過使用同源或異源二聚體融合蛋白系統的嵌合消融因子來控制。當選用同源二聚體系統時，消融因子的表達受到誘導型啟動子的控制。當選用異源二聚體系統時，消融因子受到加入藥理學試劑和任選地就形成異源二聚體系統的一種或兩種融合蛋白的其他誘導型啟動子的控制。在一個實施方式中，選用可同源或異源二聚化的消融因子以提供附加層以保證具有轉錄因子調節因子的構建體的安全。本說明書后續將對這些系統進行詳述。可使用適用于基因治療的任何病毒，包括但不限于腺伴隨病毒("AAV")、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒等。在優選實施方式中，所用的復制缺陷型病毒是腺伴隨病毒("AAV")。AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或rhlO對于人對象的應用尤其吸引人。由于AAV基因組包裝大小的限制，可將轉錄單元工程改造并包裝入兩個或更多的AAV原種中。不管包裝入根據本發明用作病毒組合物的一種病毒原種，或是包裝入兩種或多種形成本發明病毒組合物的病毒原種，用于治療的病毒基因組必須共同包含編碼轉基因和消融因子的第一和第二轉錄單元；并還可包含其它轉錄單元。例如，可將第一轉錄單元包裝入一種病毒原種，第二、三和四轉錄單元包裝入第二種病毒原種。或者，可將第二轉錄單元包裝入一種病毒原種，第一、三和四轉錄單元包裝入第二種病毒原種。雖然由于其包裝基因組大小限制而使用AAV，可使用其它病毒制備本發明病毒組合物。在另一實施方式中，當本發明的病毒組合物包含多種病毒時，其可包含不同的復制缺陷型病毒(如AAV和腺病毒)。
在一個實施方式中，本發明病毒組合物在上述此類組合物中包含兩種或更多不同的AAV(或其它病毒)原種。例如，病毒組合物可包括含具有消融識別位點和第一消融因子的治療性基因的第一病毒原種，以及含有其它消融因子的第二病毒原種。另一病毒組合物可包括含治療基因和消融因子片段的第一病毒原種，以及含有消融因子另一片段的第二病毒原種。從本系統組分的說明中易見本發明病毒組合物中兩種或更多病毒原種的其它各種組合。為節約病毒基因組內的空間，工程改造雙順反子轉錄單元。例如，轉錄單元可由相同啟動子調節，如第三和第四轉錄單元(和合適時，編碼治療性轉基因的第一轉錄單元)工程改造為包含IRES(內部核糖體進入位點)或2A肽的雙順反子單元，其在翻譯后事件中自我切割(如弗林蛋白酶-2A)，并且當轉基因(或消融因子編碼序列)大，包含多個亞基，或同時遞送兩個轉基因時，允許通過來自單啟動子的信息共表達異源性基因產物，攜帶所需轉基因或亞基的重組AAV(rAAV)共同給予使其在體內多聯化(concatamerize)以形成單一載體基因組。在這種實施方案中，第一 AAV可攜帶表達單一轉基因的表達盒，第二 AAV可攜帶表達不同轉基因而用于在宿主細胞中共表達的表達盒。然而，選定的轉基因可編碼任何生物活性產物或其他產物，例如適于研究的產物。單一啟動子可指導在單一開放閱讀框內(ORF)包含兩個或三個異源基因(如第三和第四轉錄單元，和合適時，編碼治療性轉基因的第一轉錄單元)的RNA表達，所述異源基因彼此被編碼自身切割肽(如2A肽，T2A)或蛋白酶識別位點(如弗林蛋白酶)的序列分隔。因此ORF編碼單一聚蛋白質，在翻譯中(當為T2A時)或翻譯后被切割為單獨蛋白質。可使用這些IRES和聚蛋白質系統節約AAV包裝空間，它們僅用于表達那些可由相同啟動子驅動的組分。本發明還涉及用于工程改造細胞系的DNA構建體，所述細胞系用于產生復制缺陷型病毒組合物；用于產生和制造所述復制缺陷型病毒組合物的方法；在多種細胞類型和系統中的表達，包括植物、細菌、哺乳動物細胞等，以及使用所述復制缺陷型病毒組合物的治療方法，所述方法用于基因轉移，包括獸用治療(如家畜和其它哺乳動物)和用于體內或離體治療，包括人對象的基因治療。5. I.轉基因消融系統
本發明提供設計使用復制缺陷型病毒組合物遞送轉基因(編碼治療產物-蛋白質或RNA)的藥理學誘導轉基因消融系統(PITA)，所述復制缺陷型病毒組合物通過用于響應藥理學試劑而永久或暫時性消融治療性基因產物的內建安全機制對進行工程改造，所述藥理學試劑優選口服制劑，如包含誘導對轉基因或其轉錄產物特異的消融因子表達的小分子的丸劑。然而，也可選用遞送藥理學試劑的其它途徑。在PITA系統中，使用一種或多種復制缺陷型病毒，其中病毒基因組工程改造為包含轉基因單元(如本文5. I. I部分所述)和消融單元(如本文5. I. 2部分所述)，具體說，使用一種或多種復制缺陷型病毒，其中病毒基因組工程改造為包含(a)編碼治療產物的第一個轉錄單元，將其與控制轉錄的啟動子可操作性連接，所述單元包含至少一個消融識別位點(轉基因單元);和(b)編碼對消融識別位點特異的消融因子的第二轉錄單元，將其與響應藥理學試劑而誘導轉錄的啟動子可操作性連接(消融單元)。在一個實施方式中，PITA系統設計為將復制缺陷型病毒的病毒基因組進一步工程改造使其包含可二聚化結構域單元(如5. I. 3部分所述)。在一個實施方式中，通過遞送可二聚化TF結構域單元，靶細胞被修飾為共表達兩種融合蛋白一種包含與控制消融因子的 誘導型啟動子結合的轉錄因子的DNA-結合域(DBD)，和另一種包含活化控制消融因子的誘導型啟動子的轉錄因子的轉錄活化結構域(AD)，各與二聚化因子結合域融合(如5. I. 3部分所述)。加入能夠同時與兩種融合蛋白中存在的二聚化因子結合域相互作用的藥理學試劑或“二聚化因子”(5. 1.4部分中描述)導致AD融合蛋白募集至調節的啟動子，從而起始消融因子的轉錄。參見例如，美國專利號5，834，266和美國專利號7，109,317中描述的阿利雅得公司(Ariad) ARGENTK系統，各通過引用全文納入本文。通過使用當沒有配體時彼此沒有親和力的二聚化因子結合域和合適的最小啟動子，使轉錄完全依賴于二聚化因子的加入。為此，可進一步工程改造復制缺陷型病毒的病毒基因組，使其包含第三和第四轉錄單元(可二聚化的TF結構域單元)，各編碼調節第二轉錄單元中消融因子的誘導型啟動子的轉錄因子的可二聚化結構域，其中(C)第三種轉錄單元編碼與藥理學試劑結合域融合的轉錄因子DNA結合域，其與組成型啟動子可操作性連接；以及(d)第四種轉錄單元編碼與藥理學試劑結合域融合的轉錄因子活化結構域，其與啟動子可操作性連接。在一個實施方式中，可二聚化TF結構域的各組分在組成型啟動子下表達。在另一實施方式中，可二聚化TF結構域單元的至少一種組分在誘導型啟動子下表達。圖24顯示了 PITA系統一個實施方式的示意圖，顯示了編碼與組成型啟動子可操作性連接的治療性抗體的轉基因單元，編碼與轉錄因子誘導型啟動子可操作性連接的內切核酸酶的消融單元，以及可二聚化的TF結構域單元，各轉錄因子結構域的融合序列與組成型啟動子可操作性連接。在給予雷帕霉素或雷帕霉素衍生物之前，治療性抗體和兩種轉錄因子結構域融合蛋白基線表達。給予雷帕霉素后，二聚化的轉錄因子誘導內切核酸酶的表達，其切割轉基因單元內的內切核酸酶識別結構域，從而消融轉基因表達。在一個實施方式中，PITA系統所用復制缺陷型病毒是腺伴隨病毒(“AAV”)(如
5.I. 5部分所述)。AAVl、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或rhlO對于人對象的應用尤其吸引人。由于AAV基因組包裝大小的限制，可將轉錄單元工程改造并包裝入兩個或更多的AAV原種中。例如,可將第一轉錄單元包裝入一種AAV原種，且第二、三和四轉錄單元包裝入第二 AAV原種。或者，可將第二轉錄單元包裝入一種AAV原種，且第一、三和四轉錄單元包裝入第二AAV原種。5. I. I.轉基因單元在PITA系統中，使用一種或多種復制缺陷型病毒，其中對病毒基因組進行工程改造使其包含轉基因單元。本文所用術語“轉基因單元”指包含下述的DNA: (I)編碼轉基因的DNA序列；(2)包含在破壞轉基因表達的位置中的至少一個消融識別位點(ARS)，包括轉基因或其表達控制元件內或與其側接(如啟動子的上下游和/或聚A信號的上游)；和(3)調節轉基因表達的啟動子序列。編碼轉基因的DNA可以是基因組DNA、cDNA或包含一種或多種內含子的cDNA，所述內含子例如可以增強轉基因的表達。在設計用于移除轉基因的系統中，所用ARS被消融或者剪切轉基因的消融因子(如5. 1.2部分所述)識別，如內切核酸酶識別序列，包括但不限于重組酶(如Cre/loxP系統，FLP/FRT系統)，大范圍核酸酶(如I-Scel系統)，人工限制性酶系統或另一人工限制性酶系統，如鋅指核酸酶，或對于人類基因組罕見限制性位點具有特異性的限制性酶。為了抑制轉基因的表達，ARS能夠編碼消融 識別RNA序列(ARRS)，即被消融轉基因轉錄產物或其mRNA翻譯物的消融因子所識別的RNA序列，如核酶識別序列，RNAi識別序列或反義識別序列。能夠工程改造入本發明的轉基因單元的轉基因的例子包括但不限于編碼下列的轉基因中和HIV感染的抗體或抗體片段，治療性抗體如VEGF抗體，TNF-α抗體(如英夫利昔單抗，阿達木單抗)，EGF-R抗體，巴利昔單抗，西妥昔單抗，英夫利昔單抗，立妥昔，阿來組單抗-CLL,達珠單抗,依法利珠單抗(efalizumab),奧馬珠單抗，帕利珠單抗，曲妥珠單抗，吉姆單抗，阿達木單抗，或前述任何治療性抗體的片段；可溶性血管內皮生長因子受體-l(sFIt-l)，可溶性TNF-a受體(如依那西普)，VIII因子，IX因子，胰島素，胰島素樣生長因子(IGF)，肝細胞生長因子(RGF)，血紅素加氧酶-I (R0-1)，神經生長因子(NGF)，β -IFN, IL-6，抗-EGFR 抗體，干擾素(IFN)，IFN β-I a,抗-CD20 抗體，胰高血糖素-like肽-I (GLP-I)，抗細胞粘著分子，a4-整聯蛋白抗體，膠質細胞系起源的神經營養因子(GDNF)，芳香L-氨基酸脫羧酶(ADCC)，腦起源的神經營養因子(BDNF)，睫狀神經營養因子(CNTF)，甘丙肽，神經肽Y (NPY)，TNF拮抗劑，來自IL-8家族的趨化因子，BC12，IL-10,治療性siRNA，治療性u6蛋白質，內皮抑素，纖溶酶原或其片段，HMP3，VEGF-A，RIFI a ,PEDF或IL-I受體拮抗劑。轉基因可在組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子或生理因素調節的啟動子的控制之下。適用于控制治療產物表達的組成型啟動子的例子包括但不限于人巨細胞病毒(CMV)啟動子，猿病毒40(SV40)早期和晚期啟動子，U6啟動子，金屬硫蛋白啟動子，EFla啟動子，泛素啟動子，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)啟動子，二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子(Scharfmann 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:4626-4630 (1991),腺苷脫氨酶啟動子，憐酸甘油激酶(PGK)啟動子，丙酮酸激酶啟動子磷酸甘油變位酶啟動子，β-肌動蛋白啟動子(Lai 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10006-10010 (1989)，莫洛尼白血病病毒和其它逆轉錄病毒的長末端重復(LTR)，單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子，以及本領域熟練技術人員所知的其它組成型啟動子。用于控制治療產物表達的合適的誘導型啟動子包括對外源性試劑(如藥劑)或對生理性線索反應的啟動子。這些效應元件包括但不限于結合于HIF-Ia和β的缺氧效應元件(HRE)，四環素效應元件(如 Gossen 和 Bujard(1992，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:5547-551)所述；蛻皮激素誘導效應元件(No D 等，1996，Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 93:3346-3351)，金屬離子效應元件如 Mayo 等所述(1982，Cell29:99-108) ；Brinster等(1982，Nature 296:39-42)和 Searle 等(1985，Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489)；熱休克效應元件如Nouer等所述(參見《熱休克響應》(Heat Shock Response),Nouer, L.編，CRC, Boca Raton, Fla.，167-220，1991);或激素效應元件如 Lee 等所述(1981, Nature 294:228-232) ;Hynes 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2038-2042,1981) ；Klock 等(Nature 329:734-736,1987)；和 Israel 和 Kaufman (1989, Nucl. AcidsRes. 17:2589-2604)，以及本領域所知其它誘導型啟動子.優選的效應元件是蛻皮激素誘導型效應元件，更優選的效應元件是四環素效應元件。適用于本發明的組織特異性啟動子包括但不限于表I所示，以及本領域所知其它組織特異性啟動子。
·
表I :組織特異性啟動子
組織啟動子—
肝臟_TBG，A1AT-
心臟Troponin T(TnT)—
11CCl O, SPC, FoxJl
中樞神經系統/腦突觸蛋l:.i,酪鉍酸羥化酶，
rmon1CaMKII (Ca2+/鈣調蛋白依賴 _ ________
腦腺__眺島桌，彈性蛋 ι痛-I
......脂肪.細通........................................................................................................................................................................Α.Ρ.2,..........脂.聯素......................................................................................................................—
肌肉 —^ ,ΜΗΟ 內皮細胞 ~~ 內皮縮 IillitJJIc-I (ET -I), Flt-I ...MMlI...................................................................................................Γ 涵萬.................................................................................................................................—例如但不限于，本發明的復制缺陷型病毒組合物可用于遞送VEGF拮抗劑用于治療人對象中的加速黃斑變性；VIII因子用于治療人對象中的血友病A ;IX因子用于治療人對象中的血友病B ;胰島素樣生長因子(IGF)或肝細胞生長因子(HGF)用于治療人對象中的充血性心力衰竭；神經生長因子(NGF)用于治療人對象中的中樞神經系統紊亂；或抗HIV的中和抗體用于治療人對象中的HIV感染。轉基因編碼的其他有用治療產物包括激素與生長因子和分化因子，包括但不限于胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)IP泡刺激素(FSH)、黃體激素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、血管內皮生長因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、促紅細胞生產素(EPO)、結締組織生長因子(CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(TOGF)、胰島素生長因子I和IUIGF-I和IGF-II)、轉化生長因子α超家族中的任一種,包括TGFa、活化素、抑制素或任何的骨形態發生蛋白(BMP) BMP1-15、生長因子的調蛋白/調節素/ARIA/神經鞘分化因子(NDF)家族中的任何一種、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養因子的NT-3和NT-4/5、睫狀神經營養因子(CNTF)、膠質細胞源性神經營養因子(⑶NF)、神經秩蛋白、集聚蛋白、臂板蛋白(semaphorin)/崩潰蛋白家族中的任一種、神經生長因子-I和神經生長因子_2、肝細胞生 長因子(HGF)、蝶素(ephrin),重組人頭蛋白(noggin)、音猬蛋白和酪氨酸
羥化酶家族。其他有用的轉基因產物包括調節免疫系統的蛋白質，包括但不限于細胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-I到IL-25(包括，例如IL_2、IL-4、IL-12和IL-18)、單核細胞化學誘導蛋白、白血病抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子和干擾素、干細胞因子、flk-2 / flt3配體。免疫系統產生的基因產物也可用于本發明。這些產物包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合T細胞受體、單鏈T細胞受體、I類和II類MHC分子、以及工程改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因產物還包括補體調節蛋白質，例如補體調節蛋白、膜輔因子蛋白(MCP)、衰變加速因子(0么的、0 1、0 2和0059。其他有用的基因產物包括激素受體、生長因子、細胞因子、淋巴因子、調節蛋白質和免疫系統蛋白質的任一種。本發明包括膽固醇調節和/或脂質調節的受體，包括低密度脂蛋白(LDL)受體、高密度脂蛋白(HDL)受體、極低密度脂蛋白(VLDL)受體和清除受體。本發明也包括以下基因產物例如類固醇激素受體超家族的成員，包括糖皮質激素受體和雌激素受體、維生素D受體和其他核受體。此外，有用的基因產物包括轉錄因子，例如jun、fos、max、mad、血清應答因子(SRF)、AP_l、AP2、myb、MyoD和肌細胞生成蛋白、含ETS-盒的蛋白質、TFE3、E2F、ATFl、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C / EBP、SPI、CCAAT-盒結合蛋白、干擾素調節因子(IRF-I)、Wilms腫瘤蛋白、ETS-結合蛋白、STAT、GATA-盒結合蛋白，例如GATA-3和翼狀螺旋蛋白的叉頭蛋白家族。其他有用的基因產物包括氨甲酰合成酶I、鳥氨酸轉氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α -I抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、胱硫醚合成酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰-CoA脫氫酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA變位酶、戊二酰-CoA脫氫酶、胰島素、葡糖苷酶、丙酮酸羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR)序列和抗肌萎縮蛋白基因產物[例如小-或微-抗肌萎縮蛋白]。其他有用的基因產物包括例如可用于酶替代治療的酶，所述治療可用于酶活性缺乏所導致的各種病癥。例如，含有甘露糖-6-磷酸的酶可用于治療溶菌酶儲存疾病(例如編碼β -葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)的基因)。5.1.2.消融單元對PITA所用一種或多種復制缺陷型病毒的病毒基因組進行工程改造使其還包含如本文所定義的消融單元或消融因子的編碼序列。為了永久性關閉轉基因表達。消融因子可以是內切核酸酶，包括但不限于重組酶，大范圍核酸酶，鋅指內切核酸酶或具有人基因組罕見限制性位點的任何限制性酶，與轉基因單元的ARS結合并消融或剪切轉基因。這類消融因子的例子包括但不限于Cre/loxP系統(Groth 等，2000，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5995-6000) ;FLP/FRT 系統(Sorrell 等，2005，Biotechnol. Adv. 23,431-469);大范圍核酸酶如I_SceI，其識別特定的非對稱18bp元件(T AGGGAT AACAGGGT AAT (SEQ ID NO: 25))，一種哺乳動物基因組中的罕見序列并產生雙鏈斷裂(Jasin，M.，1996，Trends Genet.，12，224-228);以及人工限制性酶(如將鋅指DNA結合域與DNA切割結構域融合，使其工程改造為靶向哺乳動物基因組中獨特的ARS序列的鋅指核酸酶(Miller 等，2008，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105:5809-5814))。在一個實施方式中，消融因子是嵌合酶，其基于同源或異源二聚體融合蛋白。當需要暫時關閉轉基因時，應選擇與轉基因的RNA轉錄物中ARRS相結合并消融轉錄物或抑制其翻譯的消融因子。這類消融因子的例子包括但不限于干擾RNA(RNAi)、核酶如核糖開關(Bayer等,2005, Nat Biotechnol. 23(3) :337-43)、或識別ARRS的反義寡核苷酸。適用本領域技術人員所知的任何方法可設計并構建識別ARRS的RNAi、核酶和反義寡核苷酸。當給予治療性轉基因以治療癌癥或介導宿主免疫應答時，尤其需要該系統。在一個實施方式中，消融因子的表達必須通過提供消融基因轉錄嚴格控制的誘導型啟動子進行控制，如藥理學試劑，或者藥理學試劑或其它實施方式中的生理學線索所激活的轉錄因子。優選非泄漏(non-leaky)的并被嚴格控制的啟動子。適于控制消融因 子表達的誘導型啟動子如效應元件包括但不限于四環素(tet)效應元件(如Gossen和Bujard(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-551 所述)；蛻皮激素誘導效應元件(NoD 等，1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:3346-3351);金屬離子效應兀件，如 Mayo 等所述(1982，Cell. 29:99-108) ；Brinster 等(1982，Nature296:39-42)和 Searle 等(1985，Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489);熱休克效應元件，如Nouer等所述(參見熱休克響應(Heat Shock Response), Nouer, L.編，CRC, Boca Raton, Fla. ,167-220,1991)；或激素效應元件，如 Lee 等所述(1981，Nature294:228-232) ;Hynes 等(1981，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 78:2038-2042) ；Klock 等(1987，Nature 329:734-736)；以及 Israel 和Kaufman (1989,Nucl. Acids Res. 17:2589-2604)，以及本領域所知其它誘導型啟動子。適用此類啟動子，可對消融因子的表達進行控制，例如，通過Tet-on/off系統(Gossen等，1995,Science268:1766-9 ;Gossen 等，1992， Proc. Nati. Acad. Sci. USA. ，89(12):5547-51);TetR-KRAB 系統(Urrutia R. ,2003, Genome Bioi. ,4(10) :231 ；Deuschle U 等，1995，MolCell Biol. (4) : 1907-14);米非司酮(RU486)調節型系統(Geneswitch ；ffang Y 等，1994,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ,91(17) :8180-4 ；Schillinger 等，2005, Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 102(39) :13789-94);人源化他莫昔芬 _dep 調節型系統(Roscilli 等，2002，Mol.Ther. 6(5):653-63);以及蛻皮激素-cbp 調節型系統(Rheoswitch ;Karns 等，2001，BMCBiotechnol. I 11 ；Palli 等，2003, Eur JBiochem. 270(6) : 1308-15)，僅舉幾例。可通過組成型或誘導型啟動子控制嵌合酶。在一個實施方式中，系統使用嵌合的內切核酸酶，其中該核酸酶至少有兩個結構域，即催化結構域和序列特異性DNA結合域，均分別在受控啟動子的驅動下表達，且可操作性相連。當同時表達兩個結構域時，兩個結構域的產物形成嵌合內切核酸酶。通常提供包含每一結構域與DNA結合域相連的分離的轉錄單元。此類DNA結合域，如鋅指基序、同源結構域基序、HMG-盒結構域、STAT蛋白質、B3、螺旋-環-螺旋、翼狀螺旋-轉角-螺旋、亮氨酸拉鏈、翼狀螺旋、POU結構域、DNA結合域抑制子、癌基因的DNA結合域以及自然發生的能夠識別>6個堿基對的序列特異性DNA結合蛋白。[1995 年 7 月 25 日授權的 US 5，436，150]。在一個實施方式中，消融因子的表達在誘導型啟動子的控制之下，所述誘導型啟動子受到5. I. 3部分所述可二聚化的轉錄因子結構域調節。此類誘導型啟動子的一個例子包括但不限于GAL4結合位點最小啟動子，其對于GAL4轉錄因子產生響應。還可將GAL4DNA結合域或反式激活結構域與類固醇受體融合，如蛻皮激素受體(EcR)。還可選用如本文所述的其它合適的誘導型啟動子。5. I. 3.可二聚化的轉錄因子結構域單元在一個實施方式中，設計PITA系統將復制缺陷型病毒的病毒基因組進一步工程改造使其包含異源二聚化融合蛋白的可二聚化結構域單元。這些單元可以是本文所定義的可二聚化TF單元或其它可二聚化的融合蛋白單元(如嵌合酶的部分)。這種情況下，使用二聚化因子(參見5. I. 4部分)，其與二聚化因子結合域結合，并使DNA結合域融合蛋白和活化結構域融合蛋白二聚化(可逆性交聯)，形成雙功能轉錄因子。參見例如，阿利雅得公司ARGENT 系統，對其的描述參見美國
發明者J·M·威爾森, S-J·陳, A·P·特列季亞科夫 申請人:賓夕法尼亞大學托管會