高分子量重組絲或類絲蛋白、以及使用它們制造的微米或納米級蜘蛛絲或者類蜘蛛絲纖維的制作方法

專利名稱：高分子量重組絲或類絲蛋白、以及使用它們制造的微米或納米級蜘蛛絲或者類蜘蛛絲纖維的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子量基本與天然絲蛋白類似的高分子量重組絲或類絲蛋白，以及使用它們制造的物理性質得以提高的微米或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維。
背景技術：
被蜘蛛用做生命線并在形成放射形蛛網時使用的蜘蛛牽引絲，其強度和彈性度大。按每單位質量計算時，蜘蛛絲的強度是鋼鐵的5倍，比人造纖維Kevlar堅韌3倍(Gosline, J. M. et al. , J. Exp. Biol. , 202: 3295, 1999; Vollrath, F. &Knight, D. P. , Nature410:541, 2001) 0因此，作為一種適用于各種工業用途的材料，蜘蛛牽引絲受到了廣泛的關注。此外，蜘蛛牽引絲具有生物相容性和生物可降解性，因此人們期待能夠應用到許多生物醫學領域中。但遺憾的是，由于蜘蛛具有高度的地域保護性和攻擊性，無法通過 養殖蜘蛛而方便地獲得天然牽引絲。因此，人們一直為了生產出重組牽引絲蛋白而不懈努力。(LazariS，A. et al. , Science, 295:472, 2002;Teule, F. et al. , Nat. Protoc. , 4:341, 2009 ; Arcidiacono, S. et al. , Macromolecules, 35:1262, 2002 ; Brooks, A. E. et al.Biomacromolecules, 9:1506, 2008 ; Heim, M. , Keerl, D. &Scheibel, T. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 48: 3584, 2009 ; Fahnestock, S. R. et al. , Rev. Mo I. Bio techno I. , 74:105, 2000 ;Scheller, J. et al. , Nat. Biotechno I. , 19: 573, 2001; ffidmaier, D. M. et al. Mol. Syst.Biol. ,5:309, 2009)。到目前為止，所有研究過的蜘蛛都自然生產具有250_320kDa高分子量的牽引絲蛋白。然而，目前在大腸桿菌(E.coli)中合成的牽引絲蛋白中，最大的分子量為163kDa (Fahnestock S. R. &Irwin S. L. , AppI. Microbiol. Biotechnol. , 47:23, 1997)，這相當于蜘蛛生產的牽引絲蛋白分子量的一半。沒有對更高分子量的牽引絲蛋白的報道，其原因認為是在蛋白質的合成過程中出現錯誤而導致了不均勻性等問題的緣故。于是，為了提供如產自蜘蛛的牽引絲蛋白一樣具有高分子量，并且在制成纖維后，具有與天然絲蛋白相似或者更優異的物理性質的重組牽引絲蛋白，本發明人做出了許多努力，結果發現，通過在諸如大腸桿菌的細菌中同時表達甘氨酸tRNA而生成分子量為284. 9kDa以上的高分子量重組絲蛋白后，紡織該重組絲蛋白，能夠生產出具有比現有天然蜘蛛絲纖維更優異的物性的蜘蛛絲纖維，從而完成了本發明。

發明內容
本發明的目的在于，提供具有類似天然蜘蛛牽引絲蛋白的高分子量的重組絲蛋白。本發明的另一目的在于，提供紡自高分子量重組絲蛋白且物理性質得以提高的的蜘蛛絲纖維。為了達到上述目的，本發明提供高分子量重組絲或類絲蛋白，所述高分子量重組絲或類絲蛋白具有甘氨酸含量為10%以上的肽重復6Γ160次的結構。另外，本發明提供高分子量重組絲蛋白，所述高分子量重組絲蛋白具有序列號1的肽重復64-160次的結構，并且具有192. 8-482kDa的分子量。此外，本發明提供制備高分子量重組絲或類絲蛋白的方法，其特征在于，共同表達編碼所述重組絲或類絲蛋白的基因，和編碼甘氨酸tRNA的核酸序列。另外，本發明還提供制造微米或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維的方法，其特征在于，使用包含所述高分子量重組絲或類絲蛋白的溶液紡絲。本發明還提供微米或納米級的蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維，其特征在于，通過所述制造微米或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維的方法制造。此外，本發明提供制造微米或納米級的蜘蛛絲纖維的方法，其特 征在于，使用包含重組絲蛋白的溶液紡絲，其中，所述重組絲蛋白具有序列號1的肽重復64-160次的結構，并且具有192. 8-482kDa的分子量。此外，本發明提供用所述方法制造的微米或納米級的蜘蛛絲纖維。


圖I表示用于表達重組蛋白的表達系統以及重復單位的氨基酸序列。圖2表示從10%SDS-PAGE凝膠中分離的16-聚體、32-聚體、64-聚體和96-聚體重組絲蛋白的分子量照片。圖3是表示用濕紡法從20%(w/v)重組絲蛋白溶液中紡得纖維的應力-應變曲線的圖表。圖4是表示用濕紡法從20%(w/v)重組絲蛋白溶液中紡得纖維的斷裂應變、拉伸強度和楊氏模量的圖表。圖5是表示纖維的拉伸強度、斷裂強度和楊氏模量與紡液中重組絲蛋白濃度的函數關系圖表中顯示了。
具體實施例方式除非特別定義，否則在本說明書涉及的技術和科學用語與本領域技術人員一般理解的含義相同。一般來說，本說明書中使用的命名法是本領域眾所周知并被廣泛采用的。在本發明的詳細說明中，主要用語的定義如下。本發明說明書中的“絲蛋白”是指，分子量及結構輪廓接近天然絲蛋白的合成絲蛋白，是通過重組蛋白的制造方法生物合成的蛋白質。絲蛋白的例子包括牽引絲、絲素蛋白和鞭毛樣絲蛋白。另外。本發明的“類絲蛋白”是指，與絲蛋白類似地以甘氨酸含量10%以上的肽作為重復單位，并且通過諸如重組蛋白的制造方法來生物合成的蛋白質。類絲蛋白的例子有彈性蛋白、足絲蛋白和膠原蛋白。本發明說明書中的“蜘蛛絲纖維”是指，利用所合成重組絲蛋白制造并且與天然蜘蛛絲蛋白基本類似的纖維。“類蜘蛛絲纖維”是指，利用所合成的重組類絲蛋白制造并且物理性質與蜘蛛絲纖維相似的纖維。本發明說明書中的“重組蛋白”是指，由一種核酸序列編碼的蛋白質，即通過表達該核酸序列而產生的蛋白，所述核酸序列是嵌入諸如自主復制質粒或病毒之類的載體、或嵌入宿主細胞基因組DNA中、或者在宿主細胞中以獨立分子的形式存在而插入的核酸序列。本發明說明書中的“宿主細胞”是指，可以表達來自其他細胞或生物體的功能性基因和/或基因產物的任何細胞。本發明的一實施方式涉及高分子量重組絲或類絲蛋白，所述高分子量重組絲或類絲蛋白具有甘氨酸含量為10%以上的肽重復64-160次的結構。在此，構成上述絲蛋白或類絲蛋白的甘氨酸含量在10%以上的肽，是構成以下蛋白的重復肽，即所述蛋白為由牽引絲蛋白、彈性蛋白、絲素蛋白、足絲蛋白、鞭毛樣絲蛋白和膠原蛋白所組成的組中選出的蛋白。序列號1到4的氨基酸序列為牽引絲蛋白的重復肽，序列號5到7的氨基酸序列為彈性蛋白的重復肽，序列號8的氨基酸序列為絲素蛋白的重復肽，序列號9的氨基酸序列為足絲蛋白的重復肽，序列號10的氨基酸序列為鞭毛樣絲蛋白的重復肽，序列號11和12的氨基酸序列為膠原蛋白的重復肽。·
序列號1:nh2-sgrgglggqgagmaaaaamggagqggygglgsqgt-cooh序列號2:NH2-GPGQQ_C00H序列號3:NH2-GPGGY_C00H序列號4:NH2-GGYGPGS_C00H序列號5:NH2-GVGVP_C00H序列號6:NH2-VPGG_C00H序列號7:NH2-APGVGV_C00H序列號8:NH2-GAGAGS_C00H序列號9:NH2-GPGGG_C00H序列號10:NH2-GPGGX-C00H序列號11:nh2-gapgapgsqgapglq-cooh序列號12:NH2-GAPGTPGPQGLPGSP-C00H本發明中，以上述序列號1所示的氨基酸序列作為重復單位并以包含64個該重復單位的方式制造的重組絲蛋白(以下稱為64聚體)的分子量為約192. 8kDa，說明了能夠制造出分子量大于現有大腸桿菌內合成的最大牽引絲蛋白(163kDa)的重組絲蛋白。而且，以上述序列號1所示的氨基酸序列作為重復單位并以包含96個該重復單位的方式制造的重組絲蛋白(以下稱為96聚體)的分子量達到了 284. 9kDa，確認了其具有與從蜘蛛獲得的天然絲蛋白的分子量(250-320kDa)基本相似的高分子量。然而，當以160個以上的重復單位含有上述肽序列時，超出了大腸桿菌所具有蛋白的合成范疇，因此，本發明的重組絲或類絲蛋白的特征是具有肽重復64-160次的結構，優選重復80-160次，更優選重復96-160次。在本發明中用作重復單位的氨基酸序列不局限于與序列號1-12完全相同的序列。而且，在此所述的氨基酸序列也包括變異體。因此，本發明中蛋白質的氨基酸序列也涵蓋了由于氨基酸插入、缺失和替換所產生的有別于這里所公開序列的所有序列。優選氨基酸替換是將一個氨基酸用與其結構和/或化學性質相似的氨基酸替代，即保守氨基酸置換。氨基酸替換可根據所涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性而進行。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸；中性極性的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸；帶負電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。重復單位中“插入”與“缺失”氨基酸的個數通常在I到5個之間，優選為1、2或3個。重復單位中的附加氨基酸個數通常少于100個，優選低于80個，更優選低于50個，最優選低于20個。將這些氨基酸插入到本發明的重復單位中從而插入到蛋白質內和/或附加到蛋白質內。值得注意的是，本發明中所構想的附加氨基酸僅限于不會對本申請蛋白質所要求的特性產生負面影響的附加氨基酸。通過使用重組DNA技術系統化地在蛋白質中制造氨基酸的插入、缺失或置換，并檢測所得重組變體的活性，可以實驗確定可允許的變化程度。這對于本領域技術人員來講屬于常規實驗。因此，本發明的特征在于，將具有與序列號I至少有90%以上同源性的氨基酸序列作為重復單位。本申請中，“至少有90%以上的同源性”意指，與序列號1的序列有91%、·91. 5%,92%,92. 5%,93%,93. 5%,94%,94. 5%,95%,95. 5%,96%,96. 5%,97%,97. 5%,98%,98. 5%、99%、99.5%的同一性。“同源性”是指兩段氨基酸序列之間的相似度。有同源性是指，在序列和功能上都相似。同源性的對比可通過目測進行，但通常更普遍地借助現成的基因對比程序來計算兩個以上序列之間同源性的百分比(Wilbur, ff. J. &Lipman, D. J. , Proc. Natl.Acad. Sd. USA.，80:726，1983)。在本發明中，通過在細菌中共同表達甘氨酸tRNA來制備重組絲蛋白或重組類絲蛋白。因而，本發明的另一實施方式涉及制備重組絲或類絲蛋白的方法，其特征在于，共同表達編碼重組絲蛋白或重組類絲蛋白的基因和編碼甘氨酸tRAA的核酸序列。此時，優選上述細菌為大腸桿菌。也就是說，與以往技術中無法制備高分子量的重組絲蛋白不同地，在本發明中，通過在諸如大腸桿菌的細菌中，共同表達編碼甘氨酸tRAA的核酸序列、和編碼以序列號I的氨基酸作為重復單位的絲蛋白的基因，能夠制備出分子量高達192. SkDa以上的重組絲蛋白。因此，本發明的以序列號1的氨基酸序列作為重復單位的絲蛋白的特點在于，其分子量為192. 8 482kDa。本發明的另一實施方式涉及蜘蛛絲纖維或類蜘蛛絲纖維，其是通過紡織高分子量重組絲蛋白或類絲蛋白而制造的物理性質得以提高的蜘蛛絲纖維或類蜘蛛絲纖維。在本發明中，使用含有上述高分子量重組絲蛋白或類絲蛋白的紡液，并通過噴絲頭兒紡絲，能夠生產出微米級或納米級的蜘蛛絲纖維。在此使用的“紡液(dope solution)”意指含有絲蛋白的所有液體混合物，對其進行擠壓成型，以形成蜘蛛絲纖維或進行流延成膜(Film casting)。當將蛋白單體(singlechain)作為單體(monomer)時,除了蛋白單體以外,紡液也可以含有例如二聚體、三聚體和四聚體的高階聚合物。通常，紡液為PH在4. 0-12. O的水溶液，并且含有低于40%(w/v)的有機物或離液劑。優選紡液不含有有機溶劑或者離液劑，但可以含有可提高溶液保存性、穩定性或可操作性的添加劑。本發明中的紡液優選含有20-80%(w/v)的重組絲蛋白。此外，采用濕紡法時，將上述紡液紡至液體凝固槽中。優選上述液體凝固槽含有選自由甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、水和硫酸銨水溶液組成的組中的液體。另一方面，蜘蛛絲纖維的直徑可以由噴絲頭的直徑來決定。例如，上述蜘蛛絲纖維的直徑可以為O. 6^50 μ m,但并不僅限于此。在本發明的一個實施例中，測量了上述由濕紡法制造的蜘蛛絲纖維的物理性質(比如拉伸強度，楊氏模量和斷裂應變)。測量結果表明，利用本發明高分子量的重組絲蛋白，能夠制造出物理性質得到提高的蜘 蛛絲纖維。特別是，由96聚體重組絲蛋白制造的纖維顯示出508±108MPa的拉伸強度和15±5%的斷裂應變，這與用天然N. clavipes蜘蛛牽引絲所測得的數值(740-1，200MPa和18-27%)相仿。尤其是96聚體纖維的楊氏模量為21±4GPa，相當于天然牽引絲(Il-HGPa)的兩倍。本發明的96聚體的拉伸強度為508 ±108MPa，是迄今為止報道的重組蜘蛛絲蛋白中最高的拉伸強度。除以上描述的濕紡法之外，也可以利用電紡法生產纖維。在電紡法中,對含有高分子量重組絲蛋白或重組類絲蛋白的溶液施加電壓，從而將溶液向所加電場的方向噴射。依照此方法,可以得到微米級或納米級蜘蛛絲纖維或類蜘蛛絲纖維。舉例來說，在室溫下，將重組絲蛋白在六氟異丙醇(HFIP ；Sigma)中溶解2天，得到12%(w/v)的絲蛋白溶液。在電紡過程中，對使用了鉬絲電極的玻璃移液管尖端的一滴絲溶液液滴，施加12kV的電壓。當所加電場力超過絲溶液液滴的表面張力時，會形成纖維噴射，并向所加電場方向噴射。可將纖維收集在鋁覆蓋平板上的玻璃材料上，而且，為了誘導β平面的形成，可對某種程度的電紡絲纖維進行甲醇處理。此時，在室溫下培養24小時后進行風干3天，而后便可以測量其物理性質。接下來，根據原子顯微鏡的力曲線測量，可以計算出每個所用樣品的楊氏模量。在室溫(21 °C )下測量懸臂撓度轉換中光電探測器的靈敏度后，用硅懸臂(FESP，VeecoInstruments Inc.)和原子顯微鏡 Dimension V (Veeco Instruments Inc. , Plainview, NY)繪制力-距離曲線。每個樣品約測量20次，并且測量楊氏模量時，在每個力曲線中可以應用一個修正的赫茲模型(Hertz, 1882，Sneddon, 1965)。根據所得參數可以直接計算出每個樣品的楊氏模量。在赫茲模型中，楊氏模量(E)由以下方程給出E=pF(l-v2)/ (2a2tana)(I)F=kd (2)其中，F、v、a、k和d分別表示尖端的力、泊松比、樣品的應變、懸臂的彈簧常數和懸臂撓度。根據尖端的形狀與彈簧常數、懸臂的種類和撓度以及樣品的泊松比，可以確定纖維的楊氏模量。另一方面，本說明書定義的重組絲蛋白/重組類絲蛋白及由其制造的纖維、細絲、膜、泡沫、球體、納纖絲、水凝膠等，均可用于生物工程和/或醫學領域，優選用作在傷口縫合或覆蓋系統的制造以及神經外科手術和眼科手術中使用的縫合材料。此外，該蛋白/絲線可使用于替代材料的制造中，優選用于人造軟骨或肌腱材料的制造中。另外，本發明中的蜘蛛絲纖維或類蜘蛛絲纖維可以用于制造諸如醫用膠帶、植皮片、替換韌帶和外科手術用修復網等的醫療器材；并且可以廣泛地應用于工業及商業產品中，比如服裝面料、防彈背心襯里、輸送面料、包或錢包帶、纜繩、繩子、粘接材料、非粘接材料、皮包帶材料、汽車罩及其零部件、飛機制造材料、耐氣候性材料、靈活隔斷材料、體育器材；并且，可以應用于實際上需要具有高拉伸強度和高彈性特點的幾乎所有的纖維及織物。本發明還可應用于穩定原纖維產品的適應性和其他形式的應用，比如用于干噴涂料、珠狀顆粒、或與其它成分的混合使用。本發明中的重組絲蛋白或重組類絲蛋白可以添加到纖維素、角蛋白和膠原蛋白產品中，因此，本發明還涉及包括纖維素和/或角蛋白和/或膠原蛋白以及本發明的重組蛋白的紙制品或護發護膚產品。含有本發明蛋白的紙制品和護發護膚產品表現出優異的特性，特別是優異的拉伸強度或抗撕裂強度。再者，本發明的高分子量重組蛋白還可以用作紡織品和皮革制品的涂層，從而賦予涂層產品穩定性與耐用性。絲蛋白特別顯示出作為皮革制品涂層的適用性，此時，能夠避免或至少削弱鞣革對于環境的負面作用。實施例下面，通過實施例更詳細地說明本發明。但這些實施例僅用于例示本發明，本領域技術人員應該理解本發明的范圍并不限定于這些實施例中。
實施例I :高分子量絲蛋白表達載體pSH32、pSH48、pSH64、pSH80和pSH96的構建，編碼甘氨酸tRNA的核酸序列表達載體的構建，以及各種分子量重組絲蛋白的制備。1-1 :pSH32、pSH48、pSH64、pSH80 和 pSH96 的構建。所有基因操作步驟皆按標準方法進行(Sambrook et al. , Molecular cloning:alaboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 1989) 為了構建重組質粒 pSH32,質粒 pSH16a (Lee et al. , Theoriesand Applications of Chem. Eng.，8 (2) : 3969，2002)(序列號13)經限制性內切酶 SpeI 和NheI (New England Biolabs, USA)酶切，得到長I. 7kb的片段，經限制性內切酶SpeI處理后連接到脫磷酸化的質粒pSH16a上，從而得到了含有編碼序列號14的32聚體絲蛋白的核酸序列的重組質粒PSH32。用限制性內切酶SpeI和NheI酶切檢查插入片段的方向。以同樣的方式，用內切酶SpeI和NheI酶切質粒pSH16a得到I. 7kb的片段，而后將該片段連接到經內切酶SpeI酶切的質粒pSH32上，以得到重組質粒pSH48。另外，質粒pSH32經過內切酶SpeI和NheI酶切，得到長3. 4kb的片段，而后連接到經內切酶SpeI酶切過的質粒PSH32上，從而得到含有編碼序列號15的64聚體絲蛋白的核酸序列的重組質粒pSH64。每個插入片段的方向經內切酶SpeI和NheI酶切而檢測。另外，同樣地，向經內切酶SpeI酶切的質粒PSH64，分別插入pSH16a或pSH32的SpeI-NheI酶切DNA片段，由此，分別構建包含有編碼序列號16的80聚體絲蛋白的核酸序列的重組質粒pSH80，以及包含有編碼序列號17的96聚體絲蛋白的核酸序列的質粒pSH96。每個質粒中插入片段的方向可以通過內切酶SpeI和NheI酶切來檢測。圖I顯示了重組絲蛋白的表達結構以及蛋白重復單位的氨基酸序列。其中，對應于序列號I的氨基酸重復單位的核酸序列與序列號18的核酸序列相同。1-2 pTet-glyVXY 載體的構建所有基因操作步驟都按照標準方法進行(Sambrook et al. , Molecular cloning:alaboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 1989)。為了確保編碼甘氨酸tRNA的glyVWX基因，以從大腸桿菌W3110菌株(源自原養型菌株大腸桿菌Κ-12，λ-,F-)中分離得到的染色體DNA作為模板，以序列號19和序列號20為引物,進行多聚酶鏈式反應(PCR)。序列號19:5’ -GCTCGATATCTAACGACGCAGAAATGCGAAA-3’
序列號20:5’-CATTGGATCCTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3’在如下條件下使用Pfu聚合酶(SolGent，Korea)進行PCR反應在95°C下進行初始變性(denaturation) 4分鐘、然后在95 °C下進行第二次變性20秒、在51 °C下退火(annealing) 30秒、及在72°C下延伸(extension) 60秒，將上述過程循環10次。之后在95°C下變性20秒、在60°C下退火30秒、以及在72°C下延伸60秒，將該過程循環19次；接下來在72°C下最后延伸5分鐘。對由上述PCR獲得的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，得到純化的479_bpPCR產物。用限制性內切酶BamHI和EcoRV (New England Biolabs, USA)同時酶切PCR產物，為了利用可持續表達的四環素抗性基因(tet)的啟動子，質粒也經由同樣的內切酶酶切。將酶切后的PCR產物和質粒用T4DNA連接酶(Roche, Germany)彼此連接到一起，并將該連接產物轉化到大腸桿菌 ToplO (F-mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) <t OlacZ Δ Μ15 Δ lacX74 recAlaraD139 Δ (ara-leu) 7697galU galK rpsL (StrE) endAl nupG)菌株中。在含有 34mg/L 氯霉素的LB固體瓊脂培養基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl和15g/L瓊脂)中挑選轉化菌株，從而構建重組質粒pTet-glyVXY。所構建的重組質粒經內切酶酶切和堿基序 列分析確認。1-3 :重組質粒pTet~gly2的構建所有基因操作步驟都按照標準方法進行(Sambrook et al. , Molecular cloning:alaboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York, 1989)。為了更過量表達編碼甘氨酸tRNA的glyVXY基因，以pTet-glyVXY作為模板，以序列號21、22作為引物，進行PCR反應。序列號21:5’-GGCTCGCATGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA-3’序列號22:5’-ATTGTCGACTGCTGCAGTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3’在如下條件下使用Pfu聚合酶(SolGent, Korea)進行PCR反應在95°C下進行初始變性3分鐘、然后在95°C下進行第二次變性20秒、在52°C退火30秒、以及在72°C延伸50秒，將上述過程循環10次；而后在95°C變性20秒、在62°C退火30秒、以及在72°C延伸50秒，將該過程循環19次；接下來在72°C最后延伸5分鐘。對由上述PCR獲得的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，得到純化的674_bpPCR產物。用限制性內切酶SphI和SalI(New England Biolabs, USA)分別酶切674-bp PCR產物和質粒pTet-glyVXY，并用T4DNA連接酶(Roche, Germany)連接在一起，而后將連接產物轉化到大腸桿菌ToplO菌種。在含有34mg/L氯霉素的LB固體瓊脂培養基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl和15g/L瓊脂)中挑選轉化菌株，從而構建出重組質粒pTet-gly2。所構建的重組質粒通過內切酶酶切和堿基序列分析確認。1-4 :各種分子量重組絲蛋白的制備為了制備具有各種分子量的絲蛋白，將實施例1-1中構建的pSH16a載體和pSH32載體分別引入到實施例1-2中獲得的重組質粒pTet-glyVXY和大腸桿菌BL21(DE3)菌株(F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm(DE3);帶有 T7RNA 聚合酶基因的卩遼菌體)(New EnglandBiolabs, USA)中。另外，將pSH64載體和pSH96載體分別引入到實施例1_3中獲得的pTetgly2載體和大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中。將如此轉化獲得的菌株接種到含有34mg/L氯霉素和25mg/L卡那霉素的LB液體培養基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)中，于30°C和180rpm連續振蕩培養。在接種1%后，當用分光光度儀在波長600nm下所測得的光密度(O. D.)達到O. 2,0. 4或O. 6時，向每個菌株加入ImM IPTG以誘導表達絲蛋白基因。誘導絲蛋白表達5小時后收集培養液。為了分析所制備的重組蛋白，將所收集的每組培養物在4°C和IOOOOg離心分離10分鐘，將得到的細胞顆粒(Cell Pellets)溶解于TE緩沖液和5XLaemmli樣品緩沖溶液中。取等量(O. 024mg)的樣品，并用10%SDS-PAGE進行分離，用Coomassie亮藍R250 (Bio-Rad, USA)染色，隨后用GS-710校準成像密度計(Bio-Rad, USA)定量。使用Bradford蛋白質定量法，以牛血清白蛋白為基準溶液，測量樣品中蛋白質含量(Bradford, Μ. Μ. , Anal. Biochem. , 72:248, 1976)。結果，如圖2所示，16聚體(用pSH16a載體制備)、32聚體(用pSH32載體 制備)、64聚體(用pSH64載體制備)和96聚體(用pSH96載體制備)的重組絲蛋白分子量分別為約50.4kDa、100.7kDa、192.8kDa和284. 9kDa。在現有的技術中，已知合成于大腸桿菌的最大牽引絲蛋白的分子量為163kDa，并且認為難以生成分子量大于163kDa 的絲蛋白(Fahnestock, S. R. &Irwin, S. L. , Appl. Microbiol. Biotechnol. , 47:23, 1997 ; VendreIy，C. &Scheibel, T. , MacromoI. Biosci. , 7 :401, 2007 ; Lazaris, A. , etal.，Science, 295:472, 2002)。然而根據本發明，通過共同表達甘氨酸tRNA的編碼核酸序列與上述表達載體，可以產生具有如192. 8kDa和284. 9kDa這樣高分子量的重組絲蛋白。實施例2 :濕紡法生產蜘蛛絲纖維-分子量對濕紡纖維機械性能的影響將實施例1-2中制備的重組絲蛋白分別溶解在紡織溶劑六氟異丙醇(HFIP; Sigma)中而制備紡液后，用泵(KDS100;KD Scientific)以l_2ml/hr的速度對紡液注射成型。至于紡液中絲蛋白的濃度，由于溶解性和粘稠度的關系，天然96聚體蛋白的最大操作濃度為20%(w/v)，因此，所有的紡織均在紡液中絲蛋白濃度為20%(w/v)的條件下進行。此時，通過26-G注射器針頭(KoreaVaccine Co. , Ltd.)，將紡液從I-ml Kovax注射器射出至裝有含90% (v/v)甲醇的水的凝固裝置中，進行注射成型。紡絲之后，將所紡纖維放置在凝固裝置中20分鐘，并且，當用手分別拉長時，纖維拉長至原來的5倍。圖3顯示了纖維的應力-應變曲線。接下來，在室溫下對纖維進行干燥，并且為了防止纖維在測量過程中收縮并為了保持其拉伸長度，將纖維始終置于張力下。測試前，使纖維樣品(n=10)在相對濕度50%和室溫條件下適應24小時。用IOOg的負荷傳感器在萬能拉力試驗機(RB302ML，R&B Inc.)上進行抗拉試驗。標距長度為20mm,十字頭速度為10mm/min。機械性能數據以平均值土標準偏差(n=10)表示。使用未配對t-測驗進行統計學分析，當P〈0. 05時，認為有統計學意義。測量結果如圖4所示，隨著絲蛋白分子量的增加，纖維的機械性能(諸如斷裂應變、拉伸強度和楊氏模量)得到了提高(32聚體的斷裂應變為3. 27±0. 32%、拉伸強度為202 土 25MPa、楊氏模量為8. 28 土0. 85GPa; 64聚體的斷裂應變為4. 31 ±0. 64%、拉伸強度為252±26MPa、楊氏模量為10. 14±0. 67GPa;96聚體的斷裂應變為15±5%、拉伸強度為508±108MPa，楊氏模量為21±4GPa)。特別是，與由64聚體以下的重組絲蛋白生成的蜘蛛絲纖維相比，使用分子量達到284. 9kDa的96聚體重組絲蛋白所生產的蜘蛛絲纖維，其斷裂應變、拉伸強度和楊氏模量都得到了超過預期的顯著提高。SP，由96聚體重組絲蛋白紡制的纖維顯示了 508±108MPa的拉伸強度與15±5%的斷裂應變，這與天然N. clavipes蜘蛛牽引絲的數值(740_1200MPa; 18_27%)相接近。尤其是96聚體纖維的楊氏模量為21±4GPa,相當于天然牽引絲(ll_14GPa)楊氏模量的兩倍。本發明的96聚體纖維的拉伸強度(508±108MPa)為迄今為止得到的重組蜘蛛絲蛋白中最高的拉伸強度。實施例3 :紡液濃度對濕紡纖維性質的影響為了檢驗紡液中重組絲蛋白濃度對所紡纖維性能的影響，將16聚體、32聚體和64聚體的蛋白分別以最大操作濃度進行紡織，并與實施例2進行比較。其結果，如圖5所示，當16聚體蛋白的濃度從20%增大到最高濃度30%的時候，所紡纖維的性能有了顯著提高。然而，當32聚體蛋白的濃度從20%增高到最高濃度27%的時候，纖維的斷裂應變和拉伸強度的雖然有所提高，但并不具有統計學意義。此外，64聚體蛋白的最大操作濃度為23%，此時的機械性能與已經實驗過的濃度20%時的機械性能相比沒有太大的區別，即，機械性能基本沒有變化。以上，對本發明的特定功能進行了詳細說明，但對于本領域技術人員而言，上述的內容僅僅是優選的實施方式，而并不能限制本發明的范圍。因此，本發明的實質范圍將由所附權利要求和其等同物來定義。工業實用性本發明提供分子量與天然絲蛋白極基本相似的高分子量重組絲或類絲蛋白、以及使用它們制造的物理性質得到提高的微米或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維。本發明的重組絲蛋白和重組類絲蛋白與源于蜘蛛的牽引絲蛋白一樣具有高分子量，而且，由此所制造的纖維具有類似天然絲蛋白或優于天然絲蛋白物理性質。因此，本發明的重組絲蛋白和重組類絲蛋白、以及由此產生的纖維能夠應用于以往非常期待應用蜘蛛絲的生物工程領域和/或醫學領域等的各類產業中，因此，具有工業實用性。序列表Free Text已附電子檔
權利要求
1.一種高分子量重組絲或類絲蛋白，具有甘氨酸含量10%以上的肽重復6Γ160次的結構。
2.如權利要求I所述的高分子量重組絲或類絲蛋白，其中，具有所述肽重復8(Γ160次的結構。
3.如權利要求I所述的高分子量重組絲或類絲蛋白，其中，具有所述肽重復96 160次的結構。
4.如權利要求I所述的高分子量重組絲或類絲蛋白，其中，所述肽是組成選自以下組的蛋白的重復肽牽引絲、彈性蛋白、絲素蛋白、足絲、鞭絲和膠原蛋白。
5.如權利要求I所述的高分子量重組絲或類絲蛋白，其中，所述肽具有序列號1至11之一的氨基酸序列。
6.如權利要求5所述的高分子量重組絲或類絲蛋白，其中，重復與所述肽具有至少90%以上同源性的氨基酸序列。
7.—種重組絲蛋白，具有序列號I的肽重復6Γ160次的結構，并且具有192. 8 482kDa的分子量。
8.一種高分子量重組絲或類絲蛋白的制造方法，其中， 在細菌中共同表達編碼權利要求廣7中任一項所述的重組絲或類絲蛋白的基因和編碼甘氨酸tRNA的核酸序列。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所用細菌為大腸桿菌。
10.一種微米級或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維的制造方法，其中， 對包含權利要求I飛中任一項所述的高分子量重組絲或類絲蛋白的紡液進行紡絲。
11.如權利要求10所述的方法，其中， 使用包含2(T80%(w/v)重組絲或類絲蛋白的紡液進行濕紡法紡絲。
12.如權利要求11所述的方法，其中，將紡液紡至液體凝固槽中。
13.如權利要求12所述的方法，其中，所述凝固槽包含選自以下組的液體甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、水和硫酸銨水溶液。
14.一種微米級或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維，其中， 通過權利要求10所述的方法制備。
15.一種微米級或納米級蜘蛛絲纖維的制造方法，其中， 對包含權利要求7所述的高分子量重組絲蛋白的紡液進行紡絲。
16.一種微米級或納米級蜘蛛絲纖維，其中， 通過權利要求15所述的方法制備。
17.如權利要求16所述的微米級或納米級蜘蛛絲纖維，其中， 至少具有252MPa的拉伸強度、10. 14GPa以上的楊氏模量和4. 31%以上的斷裂應變。
全文摘要
本發明涉及分子量與天然絲蛋白極其相似的高分子量重組絲或類絲蛋白，并涉及使用它們制造的物理性質得到提高的微米或納米級蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維。根據本發明，重組絲或類絲蛋白與源于蜘蛛的牽引絲蛋白一樣具有高分子量，而由此所制造的纖維與天然絲蛋白制作的纖維相比具有優良的物理性質。因此，本發明的重組絲或類絲蛋白以及由此制造的蜘蛛絲或類蜘蛛絲纖維能夠應用于以往期待應用蜘蛛絲的生物工程領域和/或醫學領域等的各產業中。
文檔編號C12N15/63GK102906107SQ201180017801
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者李相燁, 夏小霞, 錢志剛, 李政旭, 樸泳煥 申請人:韓國科學技術院