用于生產Ad26腺病毒載體的方法

專利名稱：：用于生產Ad26腺病毒載體的方法
技術領域：
：本發明涉及細胞培養和腺病毒生產的領域。更具體而言，它涉及哺乳動物細胞的培養、用腺病毒感染所述細胞和從中生產腺病毒顆粒的改進的方法。
背景技術：
：近期在使用重組病毒載體的DNA疫苗接種的領域中的發展已經產生對大規模制備臨床級材料的需求。需要能夠為世界欠發達和不發達地區提供足夠量的基于重組腺病毒的疫苗的方法以對抗如結核病和瘧疾的世界性問題。一份出生世代的評估顯示，世界欠發達和不發達地區在2010-2015年預計有超過I.5億的新生嬰兒。根據該出生世代，對疫苗的預計年需求量可達到大約每年I.5XIO19病毒顆粒(VP)(http://esa.un.org/unpp/index.asppanel=2)。幾種用于生產腺病毒的方法已有所描述。這些方法使用在轉瓶、細胞工廠(NUNC公司的Nunclon,或Corning公司的CellStack)或CellCubes(Corning公司)中的貼壁細胞培養。貼壁細胞培養的生產方法不能滿足對基于腺病毒的疫苗的全球需求。因此，用于貼壁方法的細胞改造為適于懸浮培養(例如J1EK293和PER.C6細胞系)。使用懸浮培養使得生產方法放大為大規模生物反應器成為可能。用于腺病毒生產的懸浮細胞培養通常可實現介于3至20L的規模，有報道的成功的規模放大高達100L(Kamen等人，2004)和250L(Xie等人，2003)。有實驗報道，放大規模至10000L是可預見的(Xie等人，2003)。但是，放大規模至10000L的一個主要不利條件是高昂的資本投入(CAPEX)，這是設計和建造10000L的生物反應器設施所需要的。此外，建造符合BSL-2條件(二級生物安全)的10000L設施的CAPEX投入，必須在不知道產品成功與否(第四期及以后)之前履行。用于10000L生物反應器制造廠的總的投資費用據報道介于2.25億和3.2億歐元之間(Estape等人，2006)。因此，將需要較小規模，例如在1000L或更小的生物反應器中的制備。使用現有的方法，為了達到I.5XIO19VP/年的目標，一年必須在1000L規模生產超過150批次。因此，有需要改進用于腺病毒生產的系統，優選在非過高的費用下，提高腺病毒顆粒的產量，滿足腺病毒疫苗的全球需求。腺病毒生產優化中所遇到的問題之一是所謂的“細胞密度效應”。在成批模式的操作中，多篇文獻暗示對于腺病毒生產，在感染時存在最佳的細胞密度。最佳值介于0.5-1XIO6細胞/mL(Maranga等人,2005；Kamen等人,2004)。已顯示對于在批量攪拌罐生物反應器中生產腺病毒(Ad5)，每細胞的病毒生產力保持不變直至大約0.9XIO6細胞/mL，但在大約IXIO6細胞/mL時大幅下降(Altaras等人，2005)。超過2XIO6細胞/mL，沒有能夠檢測到感染性顆粒。涉及比生產率下降的在感染時的細胞密度的斷點是培養基依賴的。迄今還沒有可獲得的培養基顯示出支持病毒顆粒的高產量，而在細胞密度超過IXIO6細胞/mL時使比生產率保持最佳的潛力(Kamen等人，2004)。這一下降的原因還不知道，但可能是由于用于病毒生產的營養的獲得性受限，或由于抑制病毒生產的高代謝物濃度。分批補料操作，像添加葡萄糖、谷氨酰胺和氨基酸，使得可以在細胞密度高達2XIO6細胞/mL下感染。然而，在高細胞密度下所獲得的生產力低于在IXIO6細胞/mL的、細胞密度下感染所獲得的生產力(Kamen等人，2004)。在灌注方法中，由中空纖維、旋轉過濾器或聲學分離器將細胞保留在生物反應器中，而培養基灌注穿過生物反應器。在這些方法中，有時可以達到大于100XIO6細胞/mL的細胞密度(例如Yallop等人，2005)。在用中空纖維系統灌注的過程中，受感染的灌注細胞表現出過早的細胞損失。這可能涉及到由于病毒感染所致的細胞的較高的剪切敏感性(Cortin等人，2004)。施加在更脆弱的受感染細胞上的在管道、中空纖維或蠕動泵中引起的流體動力壓力，最有可能是導這一現象的原因。由于受感染的細胞更加脆弱，如果將在整個感染階段保持灌注，已特別地建議聲學分離器(Henry等人，2004年)是合乎需要的。然而，在灌注模式下進行的感染只能以2vol/天的灌注速率保持最高3XIO6細胞/mL的細胞密度。在6XIO6細胞/mL的細胞密度下的感染導致比生產率的五倍的減少(Henry等人,2004年)。盡管有其他人所報道的細胞密度效應，一份報道(Yuk等人，2004)描述了人腫瘤細胞的成功的灌注培養，其用作溶瘤腺病毒載體的生產平臺。此報道描述了使用交替切向流(ATF)技術的高細胞密度灌注方法。在感染時平均活細胞密度為9X106HeLaS3細胞/mL，觀察到大約4X10nVP/mL的平均病毒滴度。在此報道中使用的腫瘤細胞不優選作為生產細胞，因為當所生產的腺病毒顆粒要給人類施用時，腫瘤細胞的使用可能會造成安全風險。此報道中的重組腺病毒是基于Ad5。這樣的腺病毒具有有限的作為疫苗使用的可能性，因為大多數人口含有預先存在的針對Ad5的中和抗體，因此來自其它血清型的重組腺病毒更適合作為疫苗使用(見如WO00/70071)。作為疫苗使用的特別有益的重組腺病毒包括Ad26(W000/70071)。對來自除Ad5外其它血清型的重組腺病毒的大規模生產的信息即使有，也非常有限，特別對于所述有益的血清型26。在大規模下Ad35和Ad5生產之間的某些差異，之前在如PCT/EP2009/064265中已有所描述。不同血清型的重組腺病毒的某些不同的物理性質，可能會導致在生產方法中的差異。這些潛在的差異可能在工業規模上尤其重要，其中甚至在小規模上看似微小的差異，可能在用于生產世界年需求的所設想的規模上具有巨大的經濟后果。例如，申請人證明所報道的Ad5的細胞密度效應不同于Ad35(PCT/EP2009/064265)。因此，在大規模生產方法中rAd35在生產細胞中的增殖不同于rAd5。顯然，來自不同血清型的腺病毒的增殖是非常難以預測的。為了滿足重組腺病毒血清型26(rAd26)疫苗的全球需求，有需要改進用于rAd26生產的系統。本發明提供用于rAd26的工業化生產的改進方法。發明概述在此，我們發現另一種血清型，即Ad26，表現不同于其它血清型Ad5和Ad35。確實，Ad26傾向于表現出輕微的細胞密度效應，不如對Ad5所看到的密度效應那么強烈。并且，用Ad26感染的細胞在感染后傾向于進一步生長，而用Ad35感染的細胞在感染后表現出下降的生長。這些結果再次暗示對特定血清型腺病毒的方法可能必須對各個血清型細微調整，以獲得最佳的結果。本發明提供用于rAd26生產的，對所獲得rAd26的產量和質量而言的優化的系統，而且用于下游加工的收獲操作簡單。本發明提供用于生產重組腺病毒血清型26(rAd26)的方法，該方法包含a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在大約IOXIO6活細胞/mL-16XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染所述細胞；c)用灌注系統進一步培養受感染的細胞以增殖所述rAd26;和d)收獲所述rAd26。在某些實施方案中，在大約10X106-14XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染步驟b)中的所述細胞。在某些優選實施方案中，步驟c)中所述的灌注系統是交替切向流(ATF)灌注系統。在其他優選實施方案中，步驟a)中所述的灌注系統是交替切向流(ATF)灌注系統。在一個優選實施方案中，步驟a)和c)中所述的灌注系統均為交替切向流(ATF)灌注系統。在某些實施方案中，本發明的方法還包含e)純化所述rAd26。在另外的實施方案中，該方法還包含f)制備含有所純化的rAd26的藥物組合物。在某些實施方案中，所述重組腺病毒缺少El區的至少一部分，并包含異源核酸。在優選實施方案中，所生產的rAd26的物理顆粒與感染性顆粒的比值(VP/IU)小于30:1，優選小于20:1。本發明一方面還提供用于生產至少IX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL的方法，該方法包含a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在大約IOXIO6活細胞/mL-16XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染所述細胞；c)用灌注系統進一步培養受感染的細胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒顆粒的濃度達到至少IX1012VP/mL;和d)收獲所述rAd26。本發明還提供有2L-1000L的工作容積的生物反應器，其包含培養基、生產細胞和至少lX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL。在某些實施方案中，生物反應器具有50L-500L的工作容積。在優選的實施方案中，生物反應器連接至ATF灌注系統。附圖簡述圖I.用rAd5在搖瓶中高細胞密度下的感染。圖2.用rAd35.TB-S在搖瓶和2L生物反應器中高細胞密度下的感染。圖3.用rAd26在搖瓶中高細胞密度下的感染。圖4.用rAd26感染后的細胞生長。圖5.用rAd35感染后的細胞生長。發明詳述本發明描述用于生產大量的重組腺病毒rAd26的新方法。該優化方法依賴于在高細胞密度下感染培養物而且保持高的每細胞的病毒生產力的能力。借此提供在單個生物反應器中獲得高病毒濃度的收獲的病毒溶液的方法。用于rAd26的本發明的方法的一般產量為大約2-3X10nVP/mL。實際上，據信使用本發明的方法可以生產非常大量的rAd26顆粒，例如至少大約5X10nVP/mL的量，優選地至少大約6、7、8或9X10nVP/mL。優選地生產至少IX1012VP/mLrAd26,更優選地至少I.5X1012VP/mL,更加優選地至少2X1012VP/mL,例如介于1\1012和5父1012￥/11^之間。一般，本方法不會產出大于大約lX1013VP/mLrAd26。用根據本發明的方法能夠獲得的產量很可能足以制備世界上基于某種rAd26的疫苗的需求量，而無需工作容積大于1000L的生物反應器設施。本發明提供用于生產重組腺病毒血清型26(rAd26)的方法，該方法包含a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在至少IOXIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染所述細胞；C)用灌注系統進一步培養受感染細胞以增殖所述rAd26;和d)收獲所述rAd26。在某些實施方案中，在大約10XIO6和50XIO6活細胞/mL之間的密度下用rAd26感染步驟b)中的所述細胞。在另外的實施方案中，在大約IOXIO6和20XIO6活細胞/mL之間的密度下用rAd26感染步驟b)中的所述細胞。在另外的有益的實施方案中，在大約10XIO6和16XIO6活細胞/mL之間，例如大約10、11、12、13、14或15XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染步驟b)中的所述細胞。生產細胞和重組腺病毒根據本發明的生產細胞(在本領域和本文，有時也稱作“包裝細胞”、“互補細胞”或“宿主細胞”)可以是所需要的腺病毒在其中能夠增殖的任何生產細胞。例如，在互補腺病毒中的缺陷的生產細胞中完成重組腺病毒載體的增殖。這樣的生產細胞在它們的基因組中優選至少具有腺病毒的El序列，而且由此能夠互補具有在El區的缺失的重組腺病毒。另外，腺病毒可以具有在E3區的缺失，E3區在Ad基因組中是非必要的，因此這缺失不必互補。可以使用任何互補EI的生產細胞，例如被EI永生化的人視網膜細胞(例如911或PER.C6細胞，見美國專利5994128)、El轉化的羊水細胞(見EP專利1230354)、El轉化的A549細胞(見如WO98/39411、美國專利5891690)、GH329:HeLa細胞(Gao等人，2000，HumanGeneTherapy11:213-219)、293細胞和諸如此類的細胞。在某些實施方案中，生產細胞是例如HEK293細胞、或PER.C6細胞、或911細胞、或IT293SF細胞和諸如此類的細胞。優選使用PER.C6細胞(1996年2月29日保藏歐洲細胞培養物保藏中心(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK)，ECACC保藏號96022940，見美國專利5994128)或由其衍生的細胞作為生產細胞。本文顯示在應用高細胞密度感染的方法中，重組腺病毒血清型35(rAd35)與rAd5相比具有迄今未知的有益特性。我們現在也知道另一種血清型(rAd26)在類似的方法中表現也不同于兩種之前提到的血清型，暗示用于重組腺病毒的大規模生產的最佳條件可能必須針對不同的血清型建立。本發明的腺病毒是rAd26。優選地，所述腺病毒載體缺乏腺病毒基因組的El區，例如Ela區和/或Elb區的病毒復制所必需的至少一種必要基因功能。在某些實施方案中，載體缺乏在El區的至少一種必要基因功能和至少部分的非必要的E3區。腺病毒載體可以是“多重缺乏”，意為腺病毒載體缺乏在腺病毒基因組的兩個或多個區的每個中的一或多種必要基因功能。例如，上述的El-缺失或E1-，E3-缺失的腺病毒載體可以另外缺乏在E4區的至少一個必要基因和/或E2區(例如E2A區和/或E2B區)的至少一個必要基因。缺失整個E4區的腺病毒載體可以激發較低的宿主免疫反應。適合的腺病毒載體的實例包括缺少(a)全部或部分El區和全部或部分E2區，(b)全部或部分El區、全部或部分E2區和全部或部分E3區，(c)全部或部分El區、全部或部分E2區、全部或部分E3區和全部或部分E4區，(d)至少部分Ela區、至少部分Elb區、至少部分E2a區和至少部分E3區，(e)至少部分El區、至少部分E3區和至少部分E4區，和(f)所有必要的腺病毒基因產物(例如只包含ITR和包裝信號的腺病毒擴增子)的腺病毒載體。如技術人員所知，在從腺病毒基因組缺失必要區的情況下，由這些區所編碼的功能必須以反式提供，優選由生產細胞提供，即當部分或整個El、E2和/或E4區從腺病毒缺失時，這些區必須在生產細胞中存在，例如整合在基因組中，或者以所謂的輔助腺病毒或輔助質粒的形式。在另外的實施方案中，本發明的腺病毒缺少El區的至少一部分，如ElA和/或ElB編碼序列，并還包含異源核酸。適合的異源核酸為技術人員所熟知，例如可以包括轉基因開放讀框，例如編碼多肽的開放讀框，當rAd載體用于疫苗預防的目的時，希望針對所述多肽的免疫反應，如適用于產生對瘧疾(見如WO2004/055187)、HIV、肺結核(見如WO2006/053871)、某些病毒等免疫反應的轉基因，所有均為技術人員所熟知。事實上，異源核酸的性質不是本發明的關鍵，可以是任何異源核酸，因此這里不需要進一步闡述。本領域技術人員會獲知使用如在美國專利6492169或WO03/104467和其中參考文獻中公開的方法，在特定宿主細胞增殖不同血清型的腺病毒載體的可能性。例如，為增殖EI-缺失的rAd26，可以構建表達Ad26的E1B-55K的特定的生產細胞，例如在表達Ad5的ElA和ElB的現有的生產細胞，如PER.C6或HEK293細胞的基礎上(例如美國專利6492169)，此方法為技術人員所知。可選地并且優選地，通過在rAd26載體中包括Ad5的E4-orf6編碼序列，可以不改造用于增殖El缺失的rAd26的生產細胞而使用例如像PER.C6或HEK293的現有(Ad5_)互補細胞系，此方法廣泛公開于例如WO03/104467中，此文獻通過引用全部并入本文。這樣，使用本領域技術人員所熟知的手段和方法，在生產細胞中可以完成任何血清型的腺病毒載體的增殖。腺病毒載體與其構建方法和其增殖方法為本領域所熟知，并且在例如美國專利5559099、5837511、5846782、5851806、5994106、5994128、5965541、5981225、6040174、6020191和6113913，ThomasShenk的AdenoviridaeandtheirReplication,M.S.Horwitz的Adenoviruses,B.N.Fields等人編著的Virology第三版(RavenPress,Ltd.,NewYork(1996))的分別第67和68章，和在此提及的其它參考文獻中有所描述。腺病毒載體的構建為本領域所充分了解并且涉及標準的分子生物學技術的使用，例如那些在如Sambrook等人的MolecularCloning,aLaboratoryManual第二版(ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)),Watson等人的RecombinantDNA第二版(ScientificAmericanBooks(1992)),Ausubel等人的CurrentProtocolsinMolecularBiology(WileyIntersciencePublishers,NY(1995)),和在此提及的其它參考文獻中有所描述的。培養本發明的生產細胞以增加細胞、病毒的數量和/或病毒滴度。培養細胞以使其能夠代謝，和/或生長，和/或分裂，和/或生產本發明的感興趣的病毒。這可以通過為本領域技術人員所熟知的方法實現，包括但不限于為細胞提供營養，例如在合適的培養基中。可以使用不同的培養基，選擇對所用的細胞最佳的培養基和使用環境是本領域技術人員的常規工作之一。因此，適合于本發明的目的的培養基為技術人員所熟知，通常可以從商業來源大量獲得，或者根據標準方法自行制備。培養可以在例如培養皿、轉瓶或生物反應器中，使用分批、分批補料、連續系統等完成。為了通過細胞培養實現大規模(連續)的病毒生產，在本領域優選能夠懸浮生長的細胞，優選能夠在缺乏源于動物或源于人類的血清，或源于動物或人類的血清成分下培養的細胞。適合的培養細胞的條件是已知的(見如TissueCulture(AcademicPress,KruseandPaterson,editors(1973))和R.I.Freshney的Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique第四版(ffiley-LissInc.，2000，ISBN0-471-34889-9)。細胞培養系統和灌注系統生物反應器被廣泛使用于從依賴懸浮的動物細胞培養物中大規模生產生物產品。根據本發明，用于腺病毒增殖的生物反應器可以是例如攪拌罐、一次性生物反應器、氣升式反應器等。根據本發明的某些實施方案，生物反應器是攪拌罐。根據本發明的某些實施方案，生物反應器具有大約2L-2000L的工作容積，本文術語“之間”是指包括所公開的上限值和下限值，即2L是最小的工作容積，而2000L是最大的工作容積。具有介于這些值之間的任何個別值的工作容積的生物反應器，都意為包括在本發明中。在此公開內容中使用的對于數字數值的術語“大約”是指數值±10%。在某些優選的實施方案中，工作容積介于IOL和1000L之間，優選介于20L和800L之間，例如介于30L和600L之間，例如介于50L和500L之間，例如大約250L或大約500L。使用有根據本發明的工作容積的生物反應器的一個優點是避免非常大容積的生物反應器的使用，即工作容積遠大于2000L的生物反應器，優選1000L，并且由此也不需要在建造如此非常大型的生物反應器中的巨大的資金和時間投入。另外，當使用本發明的方法，產品即rAd更為濃縮，從而在收獲和/或進一步下游加工來自生物反應器的rAd中節省時間和費用。工作容積是在生物反應器中的有效培養容積。攪拌罐通常具有1:1到3:1的高度直徑比。培養物通常使用基于葉盤或船舶螺旋槳樣式的一個或多個攪拌器混合。攪拌器系統給出的剪切力小于已有描述的槳葉。攪拌可以直接或間接的由磁耦合驅動器驅動。間接驅動減少穿過攪拌軸上密封物的微生物污染的風險。所述生物反應器的使用和控制包括(不限于)攪拌、溫度、溶解氧、pH值和生物量控制。細胞培養基的攪拌、pH值、溫度、溶解氧濃度在原則上不是關鍵而且取決于所選細胞的種類。優選地，選擇攪拌、PH值、溫度和溶解氧濃度以使其對細胞的生長是最佳的。本領域技術人員知道如何找出對培養最佳的攪拌、PH值、溫度和溶解氧濃度。通常，最佳攪拌介于50和300rpm之間，例如100_250rpm，最佳pH值介于6.7和7.7之間，最佳溫度介于30和39°C之間，例如34、35、36、37或38°C。多數的大規模懸浮培養以分批或分批補料的方行操作，因為它們的操作和規模放大最為直接。然而，基于灌注原理的連續方法正變得更為普遍。根據本發明，在灌注系統中培養生產細胞。細胞的灌注培養在本領域具有它的傳統含義，即意為在培養中由分離裝置保留細胞，其中有細胞密度低于分離前的液體流出，并且在其中有細胞培養基的流入。灌注培養的使用是為了應對在高密度(例如10-50XIO6活細胞/mL)培養細胞的挑戰。為了增加密度超過2-4XIO6活細胞/mL，使用新鮮的供給物連續或間斷地替換培養基，以彌補營養的不足并且除去有毒的產物。灌注也使得可以對培養環境(pH值、d02、營養水平、等等)有好得多的控制。穿過培養物的新鮮培養基的灌注可以通過用多種分離裝置(例如細網孔旋轉過濾器、中空纖維或平板膜過濾器、沉降管)保留細胞來實現。在本發明方法的優選實施方案中，分離裝置是包含中空纖維的過濾模塊。術語“中空纖維”是指管狀膜。管的內徑優選介于0.3和6.0毫米之間，更優選介于0.5和3.0毫米之間，最優選介于0.5和2.0毫米之間。在某些實施方案中，選擇膜中網孔尺寸(孔尺寸)以使網中孔的尺寸接近細胞的直徑，確保細胞的高度保留而細胞碎片可以通過過濾器。在其他實施方案中，網孔尺寸顯著小于細胞的直徑。優選地，網孔尺寸介于0.1-30微米之間，例如介于0.I和3微米之間，例如大約0.2微米。包含中空纖維的過濾模塊可從例如通用電氣公司(原Amersham公司)購買獲得。在本發明的方法過程中，在流出的培養基中未觀察到顯著量的腺病毒顆粒，盡管病毒顆粒小于所應用的網孔尺寸。使用灌注是為了保持某些代謝產物的所要求的水平并清除從而減少培養基中的雜質。灌注速率可以通過各種方式測量，例如單位時間的置換容積或者某些代謝物的水平，其在灌注期間必須保持。一般情況是在培養過程中并不是所有時間進行灌注，通常只在培養中不時按要求進行。例如，一般直到某些培養基成分，如葡萄糖，開始變得耗盡需要更換才開始灌注。本領域已知若干灌注系統，基本上適用于本發明的方法。術語“灌注系統”是指連接至分離裝置的生物反應器的組合。分離裝置可以并入生物反應器中(如細網孔旋轉過濾器)或在生物反應器外(如中空纖維)。在這兩種情況中，如上所解釋的，分離裝置防止細胞團從反應器洗出，并且使培養基的更新成為可能。本發明人對幾種灌注系統進行預實驗，其中交替切向流(ATF)灌注系統給出最好的結果。因此，在本發明的優選實施方案中，生物反應器同ATF灌注系統(例如ATF系統，RefineTechnology,Co.,EastHanover,NJ)一起運行(連接于ATF灌注系統)。該系統由安裝在中空纖維外殼一端的隔膜泵組成。外殼的另一端連接于組合接頭，所述組合接頭反過來通過可用端口連接到生物反應器。隔膜泵和控制系統用于通過中空纖維產生交替切向流。這意味有一與中空纖維的膜表面的相同方向(即切向)的流動，其流動是來回流動，并且有另一基本垂直于所述過濾器表面方向的流動。通過本領域技術人員所知的方法可以實現切向流動，并在例如美國專利6544424中有所描述。ATF灌注系統的操作已有所描述(Furey，2002)。ATF系統使得可以更長時間地培養細胞并達到高細胞密度而不堵塞過濾器。事實上，使用ATF灌注系統可以獲得超過100XIO6活細胞/mL的極高的細胞密度，例如用PER.C6細胞(見如Yallop等人)。然而在更早的報道中，灌注系統中的PER.C6細胞被用于完全不同的目的，并沒有用腺病毒感染。ATF系統額外的優點是該系統產生低剪切壓力。能量加在液體的表面，產生低剪切層流。特別對其中細胞用腺病毒感染的本發明而言，這可能是一個優點。用ATF系統的灌注過程中，在感染后沒有發現細胞密度的損失，沒有觀察到過早的細胞損失，反而觀察到穩定的細胞生長。由于細胞保持完整，為病毒的增殖創造最佳條件。因此在預培養階段(根據本發明的步驟a)中用ATF系統的灌注是有益的，因為它使得可以獲得非常高的細胞密度，并且對隨后的使用腺病毒的感染而言細胞條件良好，有可能對所獲得的高產量有所貢獻。為了達到所述的高細胞密度，某些實施方案中，在生產細胞的細胞生長過程(步驟a)的一部分時間中至少部分灌注培養基。在某些實施方案中，一旦達到大約2XIO6活細胞/mL和SxlO6活細胞/mL之間的細胞密度就開始灌注。另外，在感染階段后的(根據本發明的步驟c)用ATF系統灌注是有益的，因為它使得可以從受感染的細胞獲得非常高的腺病毒的產量。因此在優選實施方案中，本發明方法的預培養階段和感染后階段均使用ATF灌注系統。ATF灌注過程中所用的培養基的體積可以根據細胞的需要改變，此體積可以由技術人員容易地設定和調整，一般為0.5-5容器容積/天(vol/d),例如l_3vol/d,例如大約2vol/d。在某些有益的實施方案中，更新速率為l-2vol/d，如發明人在本文所示，從所獲得的rAd26的產量和質量而言其給出非常好的結果，而培養基的消耗和由此而來的費用仍然合理。最后，ATF灌注系統是可放大的系統。可獲得不同尺寸的ATF單元。由于使用空氣流來推動培養物穿過中空纖維膜，它可以產生非常快速的低剪切的切向流速率，使得從研發到規模高達IOOOL的生產中使用該技術成為可能(Furey,2002)。有可能進一步的發展將使得ATF灌注系統可以更進一步放大規模。在Yuk等人的文獻中，使用腫瘤細胞系生產rAd5，其中完整的方法是在單一的生物反應器中進行的，它在生產生物反應器中將用大約8-10天。在本發明的某些實施方案中，使用兩個不同的生物反應器，一個用于預培養(步驟a，預培養生物反應器)，一個用于細胞的感染(步驟b)和感染后培養(步驟C，生產生物反應器)。為這些步驟使用兩個單獨的生物反應器的優點是僅僅需要在生產生物反應器中培養大約I.5-6,—般大約4-5天,因此每年可以進行多得多的運行。在感染期間中添加大量的新鮮培養基，對減少在生產生物反應器灌注期間中所需培養基的體積也是有益的。在可選的實施方案中，也可能在單一生物反應器中進行本發明的步驟a-c。感染在本發明的方法中，用重組腺病毒感染生產細胞。一般地，在最佳條件下將病毒暴露于適合的生產細胞，使得攝入病毒。此最佳條件取決于所選細胞的類型和腺病毒的類型。本領域技術人員知道如何尋找此最佳條件，即對于攪拌、PH值、溫度、溶解氧((102或D0)、感染復數(MOI)的最佳條件。通常，最佳攪拌介于大約50和300rpm之間，一般大約100-200rpm,例如大約150rpm;一般DO是20—60%，例如40%;最佳pH值介于6.7和7.7之間；最佳溫度介于30和39°C之間，例如34-37°C;而最佳MOI介于5和1000之間，例如大約50-300。一般地，腺病毒自發地感染生產細胞，讓生產細胞與rAd顆粒接觸足以感染細胞。通常，向培養物添加腺病毒種子儲備來開始感染，隨后腺病毒在生產細胞中增殖。這對本領域技術人員而言都是常規工作。在本發明的某個實施方案中，在感染前停止灌注而在感染后的1-20小時后，例如3-15小時后，例如5小時后恢復灌注。這一延時應該使得病毒顆粒可以進入細胞并防止病毒顆粒被沖刷出系統之外。在感染后，灌注速率的定義為通過灌注手段所保持的葡萄糖的水平。例如，在本發明中培養基中的葡萄糖濃度通常保持在大約2mmOl/L-20mmOl/L的濃度，一般大約5-10mmol/L。有利地，可能在高細胞密度下(即高于IOXIO6活細胞/mL)用rAd26感染生物反應器而保持高的每細胞的病毒生產力。在某些實施方案中，比生產率保持在大約0.5XIO6-L5XIO6VP/細胞。此外，在本發明中，感染前細胞培養物的活力保持高于75%。意味著感染時培養物中細胞總量的至少75%是活的。在某些實施方案中，感染時細胞培養物的活力為至少80%，在另外的實施方案中至少85%。使用技術人員可獲得的常規方法可以測量活力，例如臺盼藍排除、凱西(Casy)細胞計數等。在某個實施方案中，感染時的細胞密度為大約10XIO6和50XIO6活細胞/mL之間，如大約IOXlO6和20XIO6活細胞/mL之間，如大約IOXlO6和15XIO6活細胞/mL之間，如大約10XIO6和14XIO6活細胞/mL之間。這些細胞密度允許高病毒生產力且細胞碎片和宿主細胞DNA積累有限，這給這些實施方案在腺病毒收獲物的下游加工帶來優勢。因此，本發明提供用于rAd26生產的優化的方法，產出高質量的高數量rAd26顆粒，同時為下游加工目的提供仍可管理的收獲材料。在這些細胞密度感染可以生產更高濃度的重組腺病毒，特別是rAd26，而且超過迄今所公開的rAd26的產量。如在本公開內容中首次顯示，與在高細胞密度(10X106活細胞/mL以上)的rAd5感染相反，使用懸浮液中的生產細胞，使用灌注系統，在IOXIO6活細胞/mL以上的密度下用rAd26感染仍增加了rAd26的容積生產力，感染時的細胞密度增長高達至少16XIO6活細胞/mL。在本發明的一個優選實施方案中，提供生產至少lX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL的方法。本發明的方法允許回收物理顆粒對感染性顆粒的比值小于30:1的rAd26，這對將給人類施用的腺病毒是一個重要的參數。可以以病毒顆粒(VP)/感染性單位(IU)的比值測量，例如采用QPA分析(Wang等人，2005)。較低的比值是有益的，因為在這種情況下需要施用較少的病毒顆粒來感染同樣數目的細胞。目前的FDA法規要求小于30:1的VP/IU比值，因此本文描述的本發明的方法適于制備滿足這一具體要求的大量的rAd26。Yuk等人(2004)的作者報道了低于本文公開的數量的病毒顆粒絕對數量，另外在Yuk等人(2004)所公開的樣品的VP/IU比值為大約100(Yuk等人，2004中的圖2A/2B)。相反，我們報道更高的絕對產量并且顯著更好的低于20:1的VP/IU比值。因此，在某些優選的實施方案中，本發明的方法提供的rAd26批次具有小于20:1的VP/IU比值，例如大約20I-大約5I。細胞收獲和裂解的方法在腺病毒的感染后，病毒在細胞內復制從而被擴增。腺病毒的感染最后導致受感染的細胞的裂解。因此，腺病毒的裂解特性準許兩種不同的病毒生產模式。第一種模式是在細胞裂解前收獲病毒，采用外部因子來裂解細胞。第二種模式是在由生產的病毒(幾乎)完全裂解細胞后收獲病毒的上清(見例如美國專利6485958，描述不使用由外部因子來裂解宿主細胞的腺病毒的收獲)。對后者的模式，要求較長的孵育時間以實現完全的細胞裂解，和由此的病毒高產量。另外，宿主細胞內容物逐步溢出進入培養基可能對所獲得的病毒的完整性和產量是有害的。因此，根據本發明，優選采用外部因子主動地裂解細胞以收獲腺病毒。可用于主動的細胞裂解的方法為本領域技術人員所知，例如在W098/22588的28-35頁中有所討論。在這一方面有用的方法例如凍融、固體剪切、高滲和/或低滲裂解、液體剪切、超聲處理、高壓擠壓、去污劑裂解、上述的組合等。在本發明的一個實施方案中，至少使用一種去污劑裂解細胞。使用去污劑裂解具有方法簡單和易于放大的優勢。可使用的去污劑和使用的方式，通常為本領域技術人員所知。例如，在WO98/22588的29-33頁中討論了幾個實例。本文所用的去污劑可以包括陰離子、陽離子、兩性離子和非離子型去污劑。本領域技術人員清楚的知道去污劑的濃度可能有所不同，例如在大約0.1%-5%(W/W)的范圍內。在一個實施方案中，所用的去污劑是TritonX-100。可以采用核酸酶來清除污染，即主要是生產細胞、核酸。適用于本發明的典型的核酸酶包括Benzonase、Pulmozyme、成任何在本領域經常使用的其他DNase和/或RNase。在優選的實施方案中，核酸酶是Benzonase，它通過水解特定核苷酸之間的磷酸二酯鍵來迅速地水解核酸，從而減少細胞裂解液的粘度。Benzonase能夠從MerckKGaA商購獲得(代碼W214950)。所采用的核酸酶的濃度優選地在1-100單位/ml的范圍內。從生產細胞的培養物中收獲腺病毒的方法已在WO2005/080556中徹底公開。根據本發明，收獲的時間為感染后大約24-120小時，例如感染后大約48-96小時，例如感染后72小時。純化方法在某些實施方案中，收獲的腺病毒被進一步純化。腺病毒的純化可以以幾個步驟進行，包含澄清、超濾、滲濾或使用層析分離，如WO05/080556所描述，其通過引用并入本文。澄清可以通過過濾步驟完成，從細胞裂解物中清除細胞碎片和其他雜質。使用超濾濃縮病毒溶液。使用超濾器的滲濾或緩沖液交換是清除或交換鹽、糖等的方法。本領域技術人員知道如何找到每個純化步驟的最佳條件。WO98/22588(通過引用并入本文)也描述用于生產和純化腺病毒載體的方法。該方法包含使宿主細胞生長、使用腺病毒感染所述宿主細胞、收獲和裂解所述宿主細胞、濃縮所述粗裂解物、交換所述粗裂解物的緩沖液、使用核酸酶處理所述裂解物和進一步使用層析純化病毒。純化可以通過例如密度梯度離心實現，如在WO98/22588的59_61頁所討論的。然而，優選地，純化采用至少一個層析步驟，如在WO98/22588的61_70頁所討論的。已描述許多對腺病毒進一步純化的方法，其中層析步驟包括在所述方法中。本領域技術人員會獲悉這些方法，并且能夠改變應用層析步驟的確切方式以優化此方法。例如，通過陰離子交換層析步驟純化腺病毒是可能的，見如W005/080556。對腺病毒純化，優選使用至少一個陰離子交換層析步驟。陰離子交換層析步驟后，病毒可以足夠純。然而，在某些實施方案中，進一步進行尺寸排阻層析步驟以提高此方法的穩健性。此步驟可以在陰離子交換層析步驟之前或之后。明顯地，其他的純化步驟也可以適合地與陰離子交換層析步驟組合。用于腺病毒純化的陰離子交換層析的使用已被廣泛描述，因此這方面是在本領域技術人員熟識的范圍內。許多不同的層析基質已被應用于腺病毒的純化并且是適合的，而本領域技術人員能夠容易地找到用于純化病毒的最佳的陰離子交換材料，例如由以下技術所指導的。美國專利5837520(又見于Huyghe等人，1995,HumanGeneTherapy6:1403-1416)描述一種純化腺病毒的方法,其中宿主細胞裂解物用核酸酶處理,然后是陰離子交換和金屬離子親和層析。美國專利6485958描述使用強陰離子交換層析來純化重組腺病毒。陰離子交換層析與流化床柱已應用于腺病毒顆粒的純化，見W000/50573。另外，用于腺病毒顆粒的純化的擴張床陰離子交換層析和某些用于陰離子交換層析的層析樹脂已在美國專利6586226中有所描述。除了陰離子交換柱，例如由Pall公司(如MustangTM系列)和Sartorius公司(如Sartobind系列)所生產的陰離子交換膜層析產品是適合的。對于在腺病毒純化中使用這些過濾器和它們的優勢，見WO03/078592和W02005/080556。美國專利6537793描述使用離子交換層析從宿主細胞純化腺病毒顆粒，具體教導出于此目的優選使用QSepharoseXL型層析支持物。在本發明的一個實施方案中，使用QSepharoseXL柱進一步純化腺病毒。該純化方法也可以適當地采用尺寸排阻層析步驟。國際申請WO97/08298描述使用某些層析基質的腺病毒的純化以防止對病毒的損害，包括陰離子交換和尺寸排阻步驟。美國專利6261823描述用于純化腺病毒的方法，其中腺病毒制備物經歷陰離子交換層析和接著的尺寸排阻層析。在此尺寸排阻步驟中，實現從低分子量的雜質中對病毒顆粒的一組分離。采用羥基磷灰石介質來凈化腺病毒也是可能的，見WO02/44348。也可以使用反相吸附步驟，例如在WO03/097797的26頁描述的。國際申請WO97/08298描述使用某些層析基質純化腺病毒以防止對病毒的損害，包括陰離子交換和尺寸排阻步驟。某些超濾方法也非常適合用作腺病毒的純化，正如在WO2006/108707中所公開的。這些步驟可以在除某些層析純化步驟之外額外進行或代替所述層析純化步驟進行。從高細胞密度培養物中對腺病毒的進一步的有益的純化方法已在由申請人于2009年10月15日提交的EP09173090.3和EP09173119.0申請(通過引用全部并入本文)中有所描述。制備藥物制備物在某些實施方案中，將純化的腺病毒配制成藥物組合物。這可以通過多種方法和使用多種緩沖液完成，其全部依據本領域技術人員所熟知的常規方法。在一般情況下，必需使腺病毒顆粒處于藥學可接受的組合物中，所述組合物包含該腺病毒和至少一種藥學可接受的賦形劑。可以在技術人員所知的條件下制備這樣的組合物，并在某些實施方案中此組合物適合于給人類施用。例如，在組分離過程中腺病毒可以通過緩沖液交換至也為腺病毒世界標準所用的緩沖液中并最終儲存在該緩沖液中(Hoganson等人，Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002,43-48頁)20mM的pH8的Tris,25mM氯化鈉，2.5%甘油。顯然，可以使用許多其他的緩沖液，例如適用于純化的(腺)病毒制備物的儲存和藥物學施用的幾種配方的實例可以在歐洲專利號0853660和國際專利申請WO99/41416、WO99/12568,WO00/29024,WO01/66137、W003/049763中找到。在某些實施方案中，腺病毒載體用作疫苗，而這些一般包含在藥學可接受的載體或賦形劑以及(或)稀釋劑中。藥學可接受的載體或賦形劑和稀釋劑在本領域是眾所周知的，并廣泛應用于范圍廣泛的治療產品。優選地，使用在疫苗中工作良好的載體。更優選地，疫苗還包含佐劑。如本領域所知的，佐劑進一步提高對所應用的抗原決定簇的免疫反應，例如在W02007/110409中所公開的包含腺病毒和磷酸鋁佐劑的藥物組合物。為了給人類施用，本發明可以采用包含rAd和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在此上下文中，“藥學可接受的”一詞是指所述載體或賦形劑，在所采用的劑量和濃度下，不會對施用的對象造成任何不想要的或有害的效果。這樣的藥學可接受的載體和賦形劑是本領域所熟知的(見Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.R.Gennaro,Ed.,MackPublishingCompany[1990];PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins,S.FrokjaerandL.Hovgaard,Eds.,Taylor&Francis[2000];andHandbookofPharmaceuticalExcipients,3rdedition,A.Kibbe,Ed.,PharmaceuticalPress[2000])。純化的rAd優選以無菌溶液來配制和施用，不過利用凍干制備物是在本發明的范圍內。通過無菌過濾或在本領域中本身已知的其他方法制備無菌溶液。然后將該溶液凍干或填充入藥物劑量容器。該溶液的PH通常在pH3.0至9.5的范圍內，例如pH5.0至7.5。rAd一般在具有適合的藥物可接受的緩沖劑的溶液中，而且rAd的溶液可能也含有鹽。任選地，可以存在穩定劑，如白蛋白。在某些實施方案中，添加去污劑。在某些實施方案中，rAd可以配制成可注射的制備物。這些制劑含有有效量的rAd，是無菌液體溶液、液體懸浮液或者是凍干版本并且任選地含有穩定劑或賦形劑。本發明公開生產腺病毒載體特別是rAd26的方法，，此方法的產量非常高，并且就我們所知在此所獲得的和公開的產量尚未有所報道。在本發明的方法中使用了生物反應器，而具有每容積非常高數量的腺病毒顆粒的生物反應器是本發明的直接(中間)產品。本發明因此還提供有介于2L和2000L之間的工作容積的生物反應器，優選介于IOL和1000L之間，其包含培養基、生產細胞和至少lX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL。如上所描述的，所述培養基可以是任何適合于所述細胞的增殖和腺病毒感染的培養基。生物反應器的容積、生產細胞和rAd26顆粒的數量和VP/IU比值的方面在上面的本發明方法中有所描述。在優選的實施方案中，生物反應器連接至ATF灌注系統。在另一方面，本發明提供生產至少lX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL的方法，該方法包含a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在大約10XIO6活細胞/mL和16XIO6活細胞/mL之間的細胞密度下用rAd26感染所述細胞；c)用灌注系統進一步培養受感染的細胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒顆粒的濃度達到至少IX1012VP/mL;和d)收獲所述rAd26。在本公開內容之前，如此高產量的rAd26是否可行是完全未知的，更別說如何達到如此高的產量。根據在此公開的方法，本發明公開這些產量是可能的。優選地，所收獲的rAd26的物理顆粒對感染性顆粒的比值小于30:1。有益的另外的實施方案在前述的根據本發明的方法中有所描述。在下面的實施例中進一步解釋本發明。該實施例不以任何方式限制本發明。它們只用于澄清本發明。實施例實施例I:在高細胞密度下使用Ad5載體的感染從PER.C6工作細胞庫中解凍細胞，并濕潤培養箱中在37°C和10%的CO2下在不含血清的培養基中增殖細胞。每3至4天進行繼代培養，直到達到足夠的細胞密度以在I.5L的容積和0.2至0.5XIO6活細胞/mL的細胞密度下接種2L的生物反應器。在37°C、40%的DO和7.3的pH下，在生物反應器中增殖細胞。在4.7XIO6總細胞/mL的細胞密度下，開始ATF灌注方法。該ATF來自RefineTechnology有限公司(EastHanover,NJ)89小時后細胞密度達到12.4XIO6總細胞/mL。在此刻收獲部分細胞并在300g下離心細胞5分鐘。在新鮮的不含血清的培養基中重新懸浮細胞沉淀至以下濃度-I.3XIO6活細胞/mL,30mL/搖瓶(shaker),兩個250mL的搖瓶-IOXlO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶-20XIO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶-30XIO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶在90VP/細胞的MOI下，用Ad5.CS(rAd5載體；Shott等人，2008)感染這些搖瓶，在36°C、10%的C02和IOOrpm下孵育。感染后第I天和第2天，對在10、20和30XIO6活細胞/mL下被感染的搖瓶進行培養基更新。通過在300g下5分鐘的離心步驟和在每搖瓶30mL新鮮培養基中重新懸浮細胞沉淀進行培養基的更新。感染后第3天收獲搖瓶并取樣用于AEX-HPLC分析。通過將每個搖瓶的ImL樣品體積與100yL的10%TritonX-100混合并在37°C孵育30分鐘進行收獲物的細胞裂解。孵育后將樣品與2.42iiL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，隨后在37°C孵育30分鐘，最后向樣品添加100iiL的50%蔗糖。2500g下5分鐘的離心步驟后，在低于-65°C下保存樣品，直到進行AEX-HPLC分析來測定所生產的病毒顆粒數量(VP/mL)。結果如圖I中所示。在IOXIO6活細胞/mL的細胞密度下感染的容積產量是在IXIO6活細胞/mL下的10倍。這有些出人意料，因為在之前報道中所報道的細胞密度效應是在低得多的密度下(即在大約0.5-3XIO6細胞/mL,例如Maranga等人，2005；Kamen等人，2004；Altaras等人，2005)。然而，超過IOXlO6細胞/mL就觀察到細胞密度效應，并且容積產量下降。因此，在灌注系統中觀察到對重組Ad5的細胞密度效應。實施例2:在低細胞密度下(1-1.6XIO6活細胞/mL)使用rAd35的感染在實施例I中，使用了rAd5。然而，已知有不同的腺病毒血清型并且為不同的目的有所描述。這些血清型可能具有不同的屬性，因此對一種血清型有用的方法不一定總是適合于另一種血清型。這可能在工業規模方法中尤其相關，其中看似微小的差別可能從經濟上來說非常重要。用于例如疫苗的一個具體的有益的血清型是Ad35，在下面的實施例中我們測試改善rAd35的產量以獲得大量rAd35的可行性。這一實施例顯示在低細胞密度下用rAd35載體的感染，作為與下面的在較高的細胞密度下感染細胞的實施例的比較。從PER.C6r作細胞庫中解凍細胞，并在濕潤培養箱中在37°C和10%的CO2下在不含血清的培養基中增殖細胞。每3至4天進行繼代培養，直到達到足夠的細胞密度以在5L的容積和0.2至0.35XIO6活細胞/mL的細胞密度下接種IOL的生物反應器。在37°C、40%的DO和7.3的pH下，在生物反應器中增殖細胞。接種后四天(當細胞密度達到介于2至3.5XIO6活細胞/mL之間)用5L新鮮培養基稀釋細胞懸浮液，之后用rAd35.TB-S(rAd35載體；Radosevic等人，2007)在70VP/cell的MOI下感染。在36°C、7.3的pH和40%的DO下進行病毒增殖。感染后三天，對生物反應器取樣用于細胞計數和病毒生產的測定。為了釋放病毒，每個生物反應器的ImL樣品與IOOiiL的10%TritonX-100混合，并在37°C孵育30分鐘。孵育后將樣品與2.42iiL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，隨后在37°C孵育30分鐘。最后向樣品添加100iiL的50%蔗糖。2500g下5分鐘的離心步驟后，在低于-65°C的溫度下保存樣品直到AEX-HPLC分析。根據以上所述方法，總共進行和分析了10次生物反應器運行，這些運行給出一致的結果(未顯示)。平均病毒顆粒生產為2.3X10nVP/mL。對于大約I.5XIO19VP的年需求，以這樣的產量必須進行大約65000L。這會需要大型的設施和因此而來的在疫苗開發過程中大量的前期投資。實施例3:使用rAd35在高細胞密度(>10X106活細胞/mL)下的感染方法的可行性研究。從PER.C6工作細胞庫中解凍細胞，并在濕潤培養箱中在37°C和10%的0)2下在不含血清的培養基中增殖。每3至4天進行繼代培養，直到達到足夠的細胞密度可以在I.5L的容積和0.2至0.5XIO6活細胞/mL的細胞密度下接種2L的生物反應器。在37°C、40%的DO和7.3的pH下，在生物反應器中增殖細胞。在6.8XIO6總細胞/mL的細胞密度下，使用ATF灌注系統開始培養基的灌注。70個小時后細胞密度達到36.8父106總細胞/mL。在此刻進行以下感染在以下細胞密度下的搖瓶中的感染O1.3\106活細胞/1^，3011117搖瓶，兩個2501^的搖瓶OIOXIO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶O20XIO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶O30XIO6活細胞/mL，30mL/搖瓶，兩個250mL的搖瓶在8.7XIO6總細胞/mL(84%的活性)下在2L生物反應器的規模下感染O感染生物反應器后一個小時，從生物反應器取出樣品并轉移到兩個250mL的搖瓶，30mL/搖瓶。對于在250mL搖瓶的感染方法，從2L生物反應器收獲一部分的細胞懸浮液并且將此懸浮液在300g離心5分鐘。在新鮮的不含血清的培養基中重新懸浮細胞沉淀至上述濃度。在70VP/細胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染搖瓶，并在36°C、10%的C02和IOOrpm下孵育。感染后第I天和第2天，對在10、20和30XIO6活細胞/mL下被感染的搖瓶進行培養基的更新。通過在300g下5分鐘的離心步驟和在每搖瓶30mL新鮮培養基中重新懸浮細胞沉淀進行培養基的更新。感染后第3天收獲搖瓶并取樣用于AEX-HPLC分析。通過將每個搖瓶的ImL樣品體積與100iiL的10%TritonX-100混合并在37°C孵育30分鐘進行所獲物的細胞裂解。孵育后將樣品與2.42yL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，隨后在37°C孵育30分鐘，最后向樣品添加IOOiiL的50%蔗糖。2500g下5分鐘的離心步驟后，在低于-65°C下保存樣品直到進行AEX-HPLC分析。在2L生物反應器中剩余的細胞用新鮮的不含血清的培養基稀釋到8.7XIO6總細胞/mL(84%活性)。在70VP/細胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染生物反應器，并在36°C、7.3的pH和40%的DO下孵育。感染后15小時啟動ATF系統，培養基更新速率為每天I生物反應器容積。感染后第1、2、3和4天對生物反應器取樣用于細胞計數(CASY細胞計數)和病毒生產的的AEX-HPLC測定。如上所述進行樣品的制備。在低于-65°C下保存樣品直到進行AEX-HPLC分析。感染生物反應器后大約一小時，從2L生物反應器取出一份至少60mL的樣品并以每搖瓶30mL的容積開始兩個感染(250mL搖瓶)。感染后第I天和第2天，進行培養基更新以模仿灌注系統。通過在300g下5分鐘的離心步驟和在每搖瓶30mL新鮮培養基中重新懸浮細胞沉淀進行培養基的更新。感染后第3天收獲搖瓶并取樣用于AEX-HPLC分析。如上所述進行樣品的制備。在低于-65°C下保存樣品直到進行AEX-HPLC分析。結果如圖2所示。結果顯示在介于I.3XIO6活細胞/mL和30XIO6活細胞/mL之間的感染是可能的。與rAd5的結果相反，rAd35的總產量隨著感染時細胞密度的增加(甚至在IOXIO6活細胞/mL樣品以上)而增加。在30XIO6活細胞/mL達到I.4X1012VP/mL的容積得率。該結果清楚地表明在高細胞密度下，即IOXIO6活細胞/mL或更高，用Ad35.TB-S感染是可能的。即使在30XIO6活細胞/mL，感染也給出高的容積產量。需要注意的是看到從I.3XIO6活細胞/mL的120.000VP/細胞到30XIO6活細胞/mL的47.000VP/細胞的單位生產力的下降。從在生物反應器中感染的細胞懸浮液開始的搖瓶顯示8.OX10nVP/mL的收獲產量和92.000VP/細胞的單位生產力。在2L生物反應器中的結果有些低獲得5X10nVP/mL的收獲產量，其單位生產力為57.000VP/細胞。實施例4:使用rAd35載體在高細胞密度下感染的生物反應器實驗。I)從PER.C6工作細胞庫中解凍細胞，并在濕潤培養箱中在37°C和10%的CO2下在不含血清的培養基中增殖細胞。每3至4天進行繼代培養，直到達到足夠的細胞密度可以在0.59X106活細胞/mL的細胞密度下接種2L的生物反應器。在37°C、40%的DO和7.3的pH值下，在2L生物反應器中增殖細胞。當達到大約2.9XIO6總細胞/mL的細胞密度(接種后4天)啟動ATF系統。經過118小時的灌注后達到29XIO6總細胞/mL的細胞密度。此刻收獲一部分的細胞懸浮液而剩余的細胞在2L生物反應器中用新鮮培養基稀釋到16.4XIO6總細胞/mL的細胞密度(82%活性，13.4XIO6活細胞/mL)。隨后在70VP/細胞的MOI下，用Ad35.TB-S感染2L生物反應器，并在36°C、7.3的pH值和40%的DO下孵育。感染后15小時啟動ATF系統，培養基更新速率為每天2容器容積。感染后第1、2和3天對生物反應器取樣用于細胞計數(CASY細胞計數)和病毒生產的AEX-HPLC測定。為了釋放病毒，將ImL樣品與100iiL的10%TritonX-100混合，并在37°C孵育30分鐘。孵育后將樣品與2.42iiL的benzonase核酸酶/MgCl2混合，隨后在37°C孵育30分鐘，最后向樣品添加IOOiiL的50%蔗糖。2500g下5分鐘的離心步驟后，在低于-65°C的溫度下保存樣品直到AEX-HPLC分析。結果如表2中所示。此結果證明在IOXIO6活細胞/mL以上的細胞密度下的感染在連接到灌注系統的生物反應器中是可行的，并且與批量方法(實施例2)相比它可能增加容積產量幾乎10倍。沒有觀察到受感染培養物的過早的細胞損失，表明ATF方法對培養受感染細胞是一種合適的系統。表2:實施例4(1)的結果權利要求1.用于生產重組腺病毒血清型26(rAd26)的方法，所述方法包括a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在IOXIO6活細胞/mL-16XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染所述細胞；c)用灌注系統進一步培養受感染的細胞以增殖所述rAd26;和d)收獲所述rAd26。2.權利要求I的方法，其中在大約IOXIO6-HXIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染步驟b)中的所述細胞。3.前述權利要求中任一項的方法，其中步驟c)中的所述灌注系統是交替切向流(ATF)灌注系統。4.前述權利要求中任一項的方法，還包括e)純化所述rAd26,和任選地f)制備含有所純化的rAd26的藥物組合物。5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述重組腺病毒缺少El區的至少一部分，并包含異源核酸。6.前述權利要求中任一項的方法，其中步驟a)中的所述灌注系統是交替切向流(ATF)灌注系統。7.前述權利要求中任一項的方法，其中步驟a)在第一生物反應器中進行，步驟b)和c)在第二生物反應器進行。8.前述權利要求中任一項的方法，其中所生產的rAd35的物理顆粒與感染性顆粒的比值(VP/IU)小于30:1，優選小于20:I。9.包含培養基、生產細胞和病毒顆粒的生物反應器，其中所述生物反應器具有2升-1000升，優選50升-500升的工作容積，并且特征在于所述生物反應器包含至少IX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL。10.權利要求9的生物反應器，其連接至ATF灌注系統。11.權利要求9或10的生物反應器，其中所述rAd26病毒顆粒具有小于30:1，優選小于20:1的VP/IU比值。12.用于生產至少lX1012rAd26病毒顆粒(VP)/mL的方法，所述方法包括a)用灌注系統懸浮培養生產細胞；b)在IOXIO6活細胞/mL-16XIO6活細胞/mL的密度下用rAd26感染所述細胞；c)用灌注系統進一步培養受感染的細胞以增殖所述rAd26，由此rAd26病毒顆粒的濃度達到至少IX1012VP/mL;和d)收獲所述rAd26。全文摘要本發明提供大規模生產重組腺病毒26的方法，其使用灌注系統并在高密度細胞下感染。文檔編號C12N15/861GK102762721SQ201180009594公開日2012年10月31日申請日期2011年2月14日優先權日2010年2月15日發明者A·魯伊琴斯,H·范赫克申請人:克魯塞爾荷蘭公司