專利名稱：用于遺傳轉化藻類的新型啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于遺傳轉化藻類的新型的啟動子、含有該啟動子的載體、以及使用了該載體的藻類的遺傳轉化方法。
背景技術：
利用作為恒久的且穩定的能源的太陽光在能源對策考慮上是非常重要的。植物類的光合成是能夠最有效地將太陽光能量轉化為化學能量的良好的系統，不但吸收同化環境中的二氧化碳或過剩的營養鹽，還釋放出氧氣。因此，利用植物的技術開發作為能夠解決能源問題的技術，備受期待。在植物類中，藻類由于生存在大量存在的海水和淡水中，因此，藻類的量也是相當大的，另外，藻類具有顯著光合成能力。并且，在藻類中還有產生不飽和脂肪酸或抗腫瘤化 合物等有用化合物的種類。另外，硅藻類中有產生有用的無機物的藻，因此，利用硅藻類的被稱為生物礦化作用的技術備受關注。因此，藻類可以稱得上是作為有用資源的重要的生物。通常，在產業上利用生物的情況下，可使用導入有用的基因的遺傳轉化技術。為了闡明基因的功能，該遺傳轉化技術還可用于敲除特定基因并抑制其功能的用途。到目前為止，以硅藻和綠藻為中心進行著藻類的遺傳轉化。但是，相關的方法是將內在性的啟動子分離，使基因與其結合并導入藻類中。其中，在內在性的啟動子的分離上花費大量的精力和時間，因此，并非有效的方法。另外，還存在藻類、尤其是海產藻類的遺傳轉化效率本身極其低的問題。另外，在藻類以外的植物或動物的遺傳轉化中，廣泛應用的并非內在性的啟動子，而是來自病毒的啟動子。例如，從十字花科植物感染的花椰菜花葉病毒(CaMV)分離的CaMV35S啟動子不僅限于十字花科植物，還可以用于廣泛植物的遺傳轉化。另外，動物細胞的遺傳轉化廣泛利用從細胞巨化病毒(CMV)分離的CMV啟動子、從猿猴空泡病毒40 (SV40)分離的SV40啟動子。與此相對，在藻類的遺傳轉化中，基本上還沒有使用外來性的病毒啟動子的例子。例如，在非專利文獻I中，記載了使用CaMV35S啟動子進行硅藻隱秘小環藻(Cycrotela cryptica)遺傳轉化的實驗例,但是沒有得到遺傳轉化體。另一方面，在非專利文獻2中，記載了 使用CMV啟動子、CaMV35S啟動子以及勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子向娃藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)導入⑶S基因后，所有的情況下，⑶S ( β -葡萄糖苷酸酶)均得到表達。另外，在非專利文獻3中，記載了使用CaMV35S啟動子向膝溝藻(渦鞭毛藻)Amphidinium和Symbiodinium中導入⑶S基因后，⑶S均得到表達。但是,根據其它文獻(非專利文獻4)，無論多么拼命努力，其它的組均沒有出現膝溝藻的遺傳轉化成功的報告。在先技術文獻非專利文獻
非專利文獻I Dunahay, T. G.等，Journal of Phycology (藻類學雜志)，vol. 31, pp. 1004-1012 (1995)非專利文獻2 :Sakaue, K 等，Physiologia pi ant arum ( 7 ^ '7' 才口 '7' r · 7。7 >夕 7 A) vol. 133，pp. 59-67 (2008)非專利文獻3 :Lohuis, M. R.等，The Plant Journal (植物雜志)，vol. 13, pp. 427-435 (1998)非專利文獻4 ffalker, T. L.等，Journal of Phycology (藻類學雜志)，vol. 41，pp. 1077-1093 (2005)
發明內容
如上所述，雖然數量極少，但是存在使用來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子 等的病毒啟動子來遺傳轉化藻類的報告例。但是，也有得不到遺傳轉化體或者無再現性的報告。另外，從通常藻類、尤其是海產藻類的遺傳轉化效率非常低考慮，亟待高效的遺傳轉化技術的開發。因此，本發明所要解決的課題是提供高效的遺傳轉化技術，具體地，提供用于遺傳轉化藻類的高效的啟動子、含有該啟動子的載體、以及使用該載體的藻類的遺傳轉化方法。本發明的發明人為了解決上述課題，進行了深入的研究。其結果發現位于被認為是編碼洛氏角刺藻cf. (Chaetoceros cf. lorenzianus) DNA病毒(ClorDNA病毒)的結構蛋白質的基因的上游的啟動子，能夠極其有效地遺傳轉化藻類，從而完成了本發明。本發明涉及的新型啟動子的特征在于具有下述(I) - (3)中任意一種堿基序列。以具有下述(I) - (3)任意一項的結構為特征的啟動子。(I)構成非編碼區域的多聚核苷酸，所述非編碼區域位于編碼ClorDNA病毒的結構蛋白質的基因的上游；(2)缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(I)的一個或多個核苷酸的多聚核苷酸，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸；(3)在嚴格的條件下和由與上述多聚核苷酸(I)的序列互補的堿基序列構成的多聚核苷酸雜交，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸。本發明涉及的載體，其特征在于，該載體含有上述新型啟動子、以及編碼任意蛋白質的基因。另外，本發明涉及藻類的遺傳轉化方法，其特征在于，該遺傳轉化方法包括制備上述載體的工序、以及將上述載體導入藻類細胞的工序。使用含有本發明涉及的啟動子的載體時，能夠有效地遺傳轉化藻類。因此，除了具有高的光合能力、表現出有用物質的產出能力等良好的特性以外，由于是大量存在的物種，根據本發明通過將遺傳轉化困難、至今還未研究出滿意的技術的藻類進行遺傳轉化，使得有用物質的大量生產成為可能。
圖I為表示含有本發明涉及的啟動子的質粒載體的結構的一個例子的圖。圖2為表示與本發明涉及的啟動子比較對照的質粒載體的結構的一個例子的圖。圖2 (I)表示含有假微型海鏈藻(T. pseudonana)的fcp啟動子的質粒載體的結構，圖2 (2)表示不含有啟動子的質粒載體的結構。圖3為表示確認通過本發明的方法遺傳轉化的藻類細胞等中所包含的導入基因的有無的實驗的結果的電泳照片。
具體實施例方式本發明涉及的第一啟動子具有(I)構成位于編碼與ClorDNA病毒的結構蛋白質的基因的上游的非編碼區域的多聚核苷酸。ClorDNA病毒是感染硅藻洛氏角刺藻Cf.的病毒。迄今為止，對藻類、尤其是海產藻類顯示感染性的病毒的報告例很少，近年來，本發明的發明人成功地從赤潮異彎藻(9 7^卜'')、膝溝藻、硅藻等的藻類中分離了各種病毒。本發明涉及的ClorDNA病毒便是本發明 的發明人分離的海產藻類感染性病毒之一。編碼結構蛋白質的基因，只要是與ClorDNA病毒的結構蛋白質的復制相關的基因并且積極地表達的基因，就沒有特別的限定。在本發明中，編碼區域是指經過mRNA翻譯成蛋白質的部分，非編碼區域是指編碼區域以外的部分。即，非編碼區域是指位于ATG等的起始密碼子的上游的部分，除了未被mRNA轉錄的部分,還包括被mRNA轉錄但未翻譯成蛋白質的部分。通常，啟動子具有轉錄的關鍵的核心元件和促進或抑制轉錄的調控元件，在導入基因時，特別重要的是利用核心元件。作為核心元件已知的有TATA框、啟動子元件(Inr)、下游(夕' ^卜U —卜)元件等，作為調控元件已知的有CAAT框、GATA框等。本發明的發明人調查了 ClorDNA病毒的ORF區域的上游的堿基序列，發現了作為CAAT框I的5’ -CAAT-3’、作為 TATA 框的 5’ -TATAAA-3’、作為 ACGTA 框的 5’ -ACGTA-3’ 以及認為是硅藻類的啟動子元件(Inr)的5’-TCA+1TAAA-3’。與此相關，本發明的發明人明確了來自于與本發明涉及的ClorDNA病毒近親的病毒的一種的CsetDNA病毒的、含有上述Inr的啟動子對中心目硅藻不起作用。考慮到這一點，作為本發明涉及的多聚核苷酸(I)能夠發揮高的遺傳轉化能力的理由，可以說上述啟動子元件等以外的未知的序列作為核心元件發揮作用的可能性很高。作為上述多聚核苷酸(I)可以舉出具有序列號13(SEQ ID NO :13)、序列號12(SEQID N0:12)、序列號11 (SEQ ID NO :11)以及序列號I (SEQ ID NO :1)的堿基序列的多聚
核苷酸。本發明涉及的第二啟動子為(2)缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(I)的一個或多個核苷酸的多聚核苷酸，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(2)中，缺失、置換或添加的核苷酸的數目優選為I以上200以下，更優選為I以上100以下，進一步優選為I以上70以下，進一步優選為I以上30以下，進一步優選為I以上20以下，進一步優選為I以上10以下，特別優選為I以上5以下。本發明涉及的第三啟動子為(3)為在嚴格的條件下和由與上述多聚核苷酸(I)的序列互補的堿基序列構成的多聚核苷酸雜交，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸。
在上述多聚核苷酸(3)中，所謂嚴格的條件是指在含有O. 1%SDS的2XSSC中、在65°C下雜交后，用O. I X SSC-O· ISDS洗滌2次。在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，所謂使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸是指通過導入到藻類細胞內，能夠使結合于其下游的編碼任意蛋白質的基因表達的多聚核苷酸。在上述多聚核苷酸(2)和(3)中，與上述多聚核苷酸(I)的同源性優選為50%以上，更優選為70%以上，進一步優選為80%以上，進一步優選為90%以上，進一步優選為95%以上，進一步優選為98%以上，特別優選為99%以上。上述多聚核苷酸(I) - (3)可以從編碼ClorDNA病毒或其變異體的結構蛋白質的基因的上游分離。但是，也可以化學合成。這些多聚核苷酸(I)- (3)可以從模板通過PCR擴增使用。本發明的載體含有上述啟動子和編碼任意的蛋白質的基因。 載體的種類只要是能夠導入藻類細胞的載體，就沒有特別的限定，可以使用質粒載體、病毒載體中的任意一種。但是，由于很難說感染藻類、尤其是海產藻類的病毒的研究已經得到充分發展，因此優選使用質粒載體。在此，“任意的蛋白質”沒有特別的限定，只要是期望生產的有用的蛋白質即可。本發明涉及的載體還可以含有通常的載體所含有的其它的序列。作為相關的序列，可以舉出用于確定導入本發明的載體的藻類的標記基因、或在藻類細胞中作用的終止子。作為本發明的載體的制備方法，可以使用通常的方法。例如，將上述各序列與供體載體用限制性內切酶剪切后退火(7 二一 U >々'')，通過DNA連接酶連接即可。或者，也可以通過利用了 clonase (々口 f 一 )反應的簡單的公知方法，將各序列克隆到載體。本發明涉及的藻類的遺傳轉化方法的特征在于，包括制備上述載體的工序、以及將上述載體導入藻類細胞的工序。本發明的載體的制備方法如上所述，可以使用本領域技術人員公知的方法。作為本發明的載體導入藻類細胞的方法，可以使用基因槍法、玻璃珠攪拌法、微量注射法、農桿菌法(了，π K々f U >> 二法)、醋酸鋰法、磷酸鈣法、原生質體法等公知的方法。但是，在海產藻類的情況下，需要在高鹽濃度的培養基中增殖，因此，電穿孔法不適合。利用本發明的載體遺傳轉化的藻類細胞能夠通過利用與導入的標記基因相應的選擇性培養基進行培養來確定。實施例以下通過列舉實施例來更具體地說明本發明，但是本發明根本不受下述實施例的限制，可以在符合前述和后述的宗旨的范圍內適當地增加變更進行實施，它們均包含在本發明的技術范圍內。實施例I本發明涉及的ClorDNA病毒啟動子的分尚(I)感染海產藻類的病毒的基因組DNA的提取按照Tomaru, Y.等，Aquatic Microbial Ecology, vol. 50, pp. 103-112 (2008)記載的方法，從以中心目硅藻洛氏角刺藻Cf.為宿主的洛氏角刺藻(Chaetoceroslorenzianus) DNA病毒(ClorDNA病毒)提取基因組。具體地，首先，通過用O. 22 μ m過濾器(MILLIP0RE社制，Millex-GS,孔徑
O.22 μ m)將病毒液(IOmL)過濾，除去藻細胞的碎片等。向得到的濾液中添加40%聚乙二醇6000溶液(Woko社制)使得最終濃度為10w/v%，在4°C下靜置一晚。將該液轉移至離心分離用試管(Nalgen社制，UltraBottle Assemblies),使用超速離心機(BECKMAN社制，Ultracentrifuge L8-70M)在57000Xg、4°C下離心分離I. 5小時后，除去其上清液。通過向得到的沉淀中添加混合磷酸緩沖液(IOmM磷酸二氫鈉、IOmM磷酸氫鈉，pH7. 2，5mL)，洗滌病毒粒子。再次，在217000Xg、4°C下離心分離4小時，同樣地除去其上清液后，將得到的沉淀溶解到滅菌后的精制水(Millipore社制，milliQ (注冊商標)，300 μ L)。將該溶液轉移至I. 5mL容量的微量離心管(印pendorf管)，添加蛋白水解酶K和10%肌氨酰使得各自最終濃度為lmg/mL和lw/v%，在55°C下恒溫放置I. 5小時。然后，使用通常的方法進行苯酚/氯仿處理和氯仿處理，在得到的上清液中添加其十分之一量的3M醋酸鈉(pH4. 8)，進一步添加其2. 5倍量的乙醇。將該溶液在_80°C下靜置I小時。然后，使用微量高速離心機 (KUBOTA社制，KUB0TA3740)在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘，將得到的沉淀用70%乙醇洗滌后，干燥。將其溶解到滅菌milliQAGOyL)中，得到DNA溶液。(2) ClorDNA病毒啟動子的分尚使用ORF finder (NCBI )，檢索上述(I)得到的ClorDNA病毒的基因組DNA所含的ORF后，使用Blast (DDBJ)將上述(I)得到的ClorDNA病毒的基因組DNA的序列信息與數據庫比較，檢測出結構蛋白質的0RF。將該ORF序列的上游的堿基數507的序列表示為序列號7(SEQ ID NO :7)。序列號7的3’末端的ATG為該ORF的起始密碼子。將從認為是該序列中的翻譯起始點的ATG序列的上游26堿基的第482號的堿基至第9號堿基的區域，通過使用了 ClP2L/attBl 引物(序列號 2，SEQ ID NO 2)和 ClP2/attB4 引物(序列號 3，SEQ IDNO :3)的PCR反應進行擴增。并且，在序列號2 (SEQ ID NO 2)中5_29的堿基序列和序列號3 (SEQ ID NO 3)中5_28的堿基序列，顯示為用于后述的質粒的構筑的BP clonase反應所必要的attB序列。另外，得到的ClorDNA病毒啟動子的堿基序列如序列號I (SEQ IDNO 1)所不。并且，序列號I的喊基序列中的第460號的T為轉錄起始點。PCR反應的條件如以下所示。作為PCR反應液，混合5 X緩沖液(TaKaRa社制，5μ L), dNTP Mix (TaKaRa 社制，2 μ L)、Prime Star HS (TaKaRa 社制，0. 25 μ L，5U/μ L)、ClorDNA病毒的基因組DNA (I μ L)、以及2種引物(IOpmol/μ L，各I μ L)，最后添加混合滅菌milliQ水使總量為25 μ L。接著，重復在98. (TC下10秒、40. (TC下30秒、72. (TC下60秒的循環30次，最后在72. (TC下反應5分鐘。為了確認片斷的擴增，進行了電泳。電泳使用TAE緩沖液(三醋酸緩沖液)和瓊脂糖S (二 7 > -7'— >社制)I. 5%凝膠。作為電泳用試劑，使用向PCR產物各9 μ L分別添加IOX加樣緩沖液(TaKaRa社制)I μ L混合而成的混合物。另外,作為DNA分子量標記使用 IOObp Ladder ( 7 夕'一)(Τ0Υ0Β0 社制，代碼 No. DNA-030X，2 μ L)，同時進行電泳。另外，使用Mupid電泳槽(ADVANCE社制)，在100V的條件下電泳約30分鐘。電泳結束后，使用溴化乙錠，通過常規方法(Sambrook and Russell 2001)染色,在紫外線照射下拍攝照片。實施例2含有本發明涉及的ClorDNA病毒啟動子的載體的制備
(I)各輸入性克隆質粒的制備使用Multisite Gateway (注冊商標)Pro Kit (invitrogen社制)制備分別導入了由上述實施例I得到的ClorDNA病毒啟動子、作為導入基因的耐諾爾絲菌素(V —才^ V ; >)基因(nat) (Poulsen, N.等，Jornal of Phycology, 42, ppl059-1065. (2006))、以及假微型海鏈藻(Thlassiosira pseudonana)的 fcp 終止子(Poulsen, N.等，Jornal ofPhycology, 42, pp 1059-1065. (2006))的輸入性克隆質粒。具體地，使用High pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche社制)，按照其使用說明書將具有用于質粒的構筑的clonase反應所必要的attB序列的、上述實施例I中得到的ClorDNA病毒啟動子溶液進行了精制。接著，將該溶液(50fmoles)與供體載體(invitrogen社制，pD0NR22 IPI-P4，IOOng/ μ L )混合，通過向該溶液中添加滅菌mi 11 iQ水形成總量為8μ L的混合液。并且,該供體載體具有用于質粒的構筑的BP clonase反應所必要的attP序列。向該混合液中進一步添加混合BP clonase (商標)II酶混合物(Enzyme Mix)(invitrogen社制,2 μ L),在25°C下反應I小時。然后，向反應液中添加蛋白水解酶K (invitrogen社制，I μ L),在37°C下處理10分鐘。將該反應液(2. 5 μ L)混合到One ShotMach ITl (注冊商標)chemically competent cells (invitrogen 社制，25 μ L)中，在冰上靜置30分鐘。然后，在42°C下進行30秒熱激處理后，立刻轉移至冰上，靜置2分鐘。然后，添加S0C(invitrogen社制，250mL)，在37°C下振動培養I. 5小時。將培養的菌液(275 μ L)涂抹到含有50μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂培養基(1%胰蛋白胨、O. 5%酵母提取物、l%NaCl、
1.5%瓊脂)。將該培養基在^ ^千 '> 工一力一恒溫箱(”寸”社制)內在37°C下倒置培養一晚(10小時左右)。將得到的菌落用接種環接種到LB液體培養基(IOmL)上，在37°C下振動培養一晚。使用Pure Yield質粒中量純化系統(Plasmid Miniprep System)(Promega社制)從該培養液(3mL)提取導入了具有LR clonase反應所必要的attL序列的ClorDNA病毒啟動子的輸入性克隆質粒。另外，與上述實施例I同樣地擴增具有用于質粒的構筑的BP clonase反應所必要attB序列的耐諾爾絲菌素基因(nat)，與上述同樣地導入到作為具有用于構筑質粒的BP clonase反應所必要的attP序列的供體載體的pD0NR221P4r_P3r，得到導入了具有LRclonase反應所必要的attL序列的抗生素耐藥性基因的輸入性克隆質粒。進一步,與上述實施例I同樣地擴增具有用于質粒的構筑的BP clonase反應所必要attB序列的假微型海鏈藻的fcp終止子，與上述同樣地導入到作為具有用于質粒的構筑的BP clonase反應所必要的attP序列的供體載體的pD0NR221P3_P2，得到導入了具有LRclonase反應所必要的attL序列的終止子的輸入性克隆質粒。(2)目標質粒的制備通過使用Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival(注冊商標)感受態細胞(invitrogen社制)，向pBluescript SK- (Stratagene社制)中組合具有LR clonase反應所必要的attR序列的Reading Frame Casette,制備目標質粒。首先，對于pBluescript SK_(2 μ g)，使用限制性內切酶 EcoRI 20U(Τ0Υ0Β0 社制，IOU/ μ L)在37°C下消化3小時。通過按照常規方法向該反應液中添加乙醇，使DNA沉淀回收。接著，使用T4DNA聚合酶使末端平滑化。即，向回收的DNA中添加IOX緩沖液(5 μ L)、
2.5mM dNTP (TAKARA 社制，2 μ L)、T4DNA 聚合酶(T0Y0B0 社制，O. 5U/μ L，I μ L)以及滅菌milliQ水(42 μ L)，制備總量為50 μ L的反應液。將該反應液在12°C下恒溫放置15分鐘。立刻向該反應液中添加滅菌milliQ水(350 μ L)，按照常規方法進行苯酚/氯仿處理和氯仿處理后，持續進行乙醇沉淀回收DNA。接著，為了防止用限制性內切酶剪切后的質粒再次環化，使用 CIAP (TaKaRa 社制，Calf intestine Alkaline Phosphatase)進行該剪切碎片的5’末端的脫磷酸處理。向實施了平滑化處理的DNA中添加10XCIAP緩沖液(5 μ L)和CIAP (O. IU/μ L，I μ L)，制備反應液，利用滅菌milliQ水使得總量為50 μ L0將該反應液在37°C下恒溫放置15分鐘，繼續在56°C下恒溫放置15分鐘后，再次添加CIAP(0. IU/μ L，
1μ L)，在37°C下恒溫放置15分鐘，繼續在56°C下恒溫放置15分鐘。向該反應液中分別添力口 10%SDS溶液(2· 5μ L)、500mMEDTA溶液(O. 5μ L)、蛋白水解酶K溶液(20mg/y L，0. 5μ L)后，在56°C下恒溫放置30分鐘，繼續在75°C下恒溫放置10分鐘。然后，按照常規方法實施苯酚/氯仿處理和氯仿處理。接著，通過乙醇沉淀回收DNA，溶解到滅菌mi 11 iQ水(10 μ L)中。將得到的具有平滑末端的pBluescript SK-和 Reading Frame Casette A (invitrogen 社制，RfA)混合，使用 pGEM-T Vector Systems Kit (Promega 社制)附帶的T4DNA連接酶連接。首先，向高壓釜滅菌后的O. 2mL容量的PCR用試管中添加2 X快速連接緩沖液(Promega 社制，5 μ L)、pBluescript SK- (IOOng/ μ L, O. 5 μ L)> RfA (5ng/ μ L,
2μ L)、T4DNA 連接酶(Promega 社制，3U/ μ L，I μ L)和滅菌 milliQ 水(I. 5 μ L)，制備總計為IOyL的反應液。將該反應液在室溫下保存I小時，在4°C下恒溫放置一晚(16小時以上)。將該連接性^ V一 3 >)溶液(5 μ L)混合到 ccdB Survival Competent Cells(invitrogen社制，50 μ L)，在冰上靜置30分鐘。然后，在42°C進行30秒熱激處理后，立刻轉移到冰上，靜置2分鐘。接著，添加SOC (25011^)，在371下振動培養1.5小時。將培養的菌液(300 μ L)涂抹到含有25 μ g/mL氯霉素和50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上。將該培養基在I &十工一力一恒溫箱內在37°C下倒置培養一晚。將得到的菌落用接種環接種到LB培養基(IOmL)上，在37°C下振動培養一晚。使用Pure Yield質粒中量純化系統(Promega社制)從該培養液(3mL)提取目標質粒。(3)表達克隆質粒載體的制備通過使用Multisite Gateway Pro Kit (invitrogen 社制)在上述實施例 2 (I)中得到的輸入性克隆質粒與上述實施例2 (2)中得到目標質粒之間進行LRclonase反應，制備啟動子、抗生素耐藥性基因以及終止子連接而成的表達克隆質粒載體。具體地，將分別組合了啟動子、抗生素耐藥性基因、終止子的三種輸入性克隆質粒(分別IOfmoles)和目標載體(20fmoles)混合,進一步通過添加滅菌milliQ水制備總量為8μ L的混合液。向該溶液中添加混合LR Clonase II PLUS Enzyme Mix( invitrogen社制，2^0，在251下反應16小時。然后，向該反應液中添加蛋白水解酶K (invitrogen社制，I μ L)，在37°C處理10分鐘。將該反應液(2. 5 μ L)混合到One Shot Mach ITl (注冊商標)chemically competent cells (invitrogen 社制，25 μ L)中，在冰上靜置 30 分鐘。然后，在42°C下進行30秒熱激處理后，立刻轉移至冰上，靜置2分鐘。然后，添加SOC (250mL),在37°C下振動培養I. 5小時。將培養的菌液(275 μ L)涂抹到含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養基。將該培養基在W十4工一力一;〖亙溫箱內在37°C下倒置培養一晚。將得到的菌落用接種環接種到LB培養基(200mL)上，在37°C下振動培養一晚。使用NucleoBond(注冊商標)Xtra Midi (MACHEREY-NAGEL社制)，按照其使用說明書，從該培養液提取質粒DNA。(4) DNA序列的確認為了確認制備得到了作為目標的表達克隆質粒載體，使用雙脫氧法(Dideoxy)確定堿基序列。使用上述實施例2 (3)制備的表達克隆質粒載體(200ng)為模板，進行循環序列測定PCR。其反應條件如以下所示。反應液(IOyL)由模板DNA (IOOng/μ L，2 μ L)、Big Dye終結者循環測序(Big Dye Terminator Cycle Sequencing)ver. 3. I (Applied Biosystems社制，0. 5 μ L)、5X序列測定緩沖液(2 μ L)、引物(I. 6pmol/ μ L, 0. 66 μ L)、滅菌蒸懼水(4.84yL)構成。引物使用Μ13Μ3引物(序列號4，SEQ ID Ν0:4)。作為反應條件，在95°C下加熱5分鐘后，進行96°C下10秒、50°C下5秒、60°C下4分鐘的反應40個循環。反應后，將反應液轉移至I. 5mL容量的微量離心管，添加3M醋酸鈉(I μ L)、99. 5%乙醇(25 μ L) 和125mM EDTA溶液(I μ L)，用手指彈的方式進行充分混合后，在室溫下放置15分鐘。在14000rpm、4°C下離心分離20分鐘后，用黃色槍頭(〃工口一子)小心除去上清液，添加70%乙醇(35μ L)，混合均勻。再次，在14000rpm、4°C下離心分離10分鐘后，用黃色槍頭將上清液完全除去，在開蓋的狀態下，在室溫下放置10分鐘，使沉淀干燥。向干燥的顆粒中添加甲酰胺(Applied Biosystems社制，10 μ L),使用高知大學綜合研究中心基因實驗設施內的ABI PRISM (注冊商標)3100-Avant Genetic Analyzer(Applied Biosystems社制)進行解析。預先,使用基因解析軟件Vector NTI Advance Ver10. O (invitrogen 社制，http://www. invitrogen. com/vntigateway),向目標質粒的喊基序列中組合啟動子、抗生素耐藥性基因以及終止子的堿基序列，由此，制作表達基因質粒載體的堿基序列。接著，通過使用Vector NTI Advance Ver 10. O的AlignX進行校正(7 7^ ^ >卜)，將該在計算機上制作的表達克隆質粒載體的堿基序列與通過上述方法實驗確定的表達克隆質粒載體的喊基序列進行比較，確認到上述實施例2 (3)制備的表達克隆質粒載體中導入了目標基因。得到的表達克隆質粒載體的結構如圖I所示。另外，作為對照，同樣地構筑所述的質粒的構成要素中、ClorDNA病毒的啟動子置換為中心目娃藻假微型海鏈藻的fcp啟動子的質粒(pTpfcpPro/nat/TpfcpTer),以及進一步不含啟動子的質粒(pNat/TpfcpTer)。這些結構分別如圖2 (I)和圖2 (2)所示。實施例3中心目硅藻的遺傳轉化使用上述實施例2的3種質粒載體,將中心目娃藻角毛藻(chaetoceros sp.)進行遺傳轉化。具體地，使具有ClorDNA病毒(ClorDNAV)的啟動子或假微型海鏈藻的fcp啟動子、且組合了抗生素耐藥性基因和假微型海鏈藻的fcp終止子的質粒載體附著到平均粒徑
I.Iym的鎢粒子M17上。同時，將不含啟動子的質粒載體也附著到鎢粒子上。另外，將中心目硅藻角毛藻以每個培養基I X IO8細胞涂抹到固體培養基上。使用粒子槍(Bio-Rad社制，Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System),通過將 2 張安全膜(9 7。f Y 一于、^ ^ )650psi (Bio-Rad社制)重疊，將上述鎢粒子以He氣壓1350psi打入細胞內。接著，用含有諾爾絲菌素500 μ g/mL的O. 3%瓊脂糖HGS (高強度瓊脂糖，和光純藥工業社制)f/2培養基培養該細胞，測算相當于總細胞數IX IO8的菌落數。結果如表I所示。[表 I]
權利要求
1.一種啟動子，其特征在于，該啟動子具有下述(I) - (3)任意一項的結構， (1)構成非編碼區域的多聚核苷酸，所述非編碼區域位于編碼ClorDNA病毒的結構蛋白質的基因的上游； (2)缺失、置換或添加了上述多聚核苷酸(I)的一個或多個核苷酸的多聚核苷酸，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸； (3)在嚴格的條件下和由與上述多聚核苷酸(I)的序列互補的堿基序列構成的多聚核苷酸雜交，并且使編碼任意蛋白質的基因的表達在藻類細胞內活化的多聚核苷酸。
2.根據權利要求I所述的啟動子，其中，上述多聚核苷酸(I)具有序列號I3的堿基序列。
3.根據權利要求I所述的啟動子，其中，上述多聚核苷酸(I)具有序列號12的堿基序列。
4.根據權利要求I所述的啟動子，其中，上述多聚核苷酸(I)具有序列號11的堿基序列。
5.根據權利要求I所述的啟動子，其中，上述多聚核苷酸(I)具有序列號I的堿基序列。
6.—種載體，其特征在于，該載體含有權利要求1-5中任意一項所述的啟動子、以及編碼任意蛋白質的基因。
7.一種藻類的遺傳轉化方法，其特征在于，該遺傳轉化方法包括制備權利要求6所述的載體的工序、以及將上述載體導入藻類細胞的工序。
全文摘要
本發明的目的在于提供高效的遺傳轉化技術，具體地，提供用于遺傳轉化藻類的高效的啟動子、含有該啟動子的載體、以及使用該載體的藻類的遺傳轉化方法。本發明涉及的啟動子以具有構成非編碼區域的多聚核苷酸等為特征，所述非編碼區域位于編碼ClorDNA病毒的結構蛋白質的基因的上游。
文檔編號C12N1/13GK102753687SQ20118000892
公開日2012年10月24日 申請日期2011年2月10日 優先權日2010年2月17日
發明者岡見卓馬, 外丸裕司, 足立真佐雄, 長崎慶三 申請人:國立大學法人高知大學