專利名稱：L-賴氨酸生產率提高的微生物以及用其生產l-賴氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及具有高L-賴氨酸生產率的微生物以及用其生產L-賴氨酸的方法。
背景技術：
L-賴氨酸是通過賴氨酸生物合成途徑由草酰乙酸合成的。對L-賴氨酸的生物合成重要的酶是天冬氨酸半醛脫氫酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶，它們分別由基因asd、dapB和ddh編碼，并且是介導部分賴氨酸生物合成途徑的NADPH依賴性還原酶。在該途徑中，產生一分子L-賴氨酸直接需要由酶消耗三分子NADPH，和間接消耗一分子NADPH。谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)細胞中NADPH的再生與L-賴氨酸生物合成的直接關聯之前已被報道(Wittmann and Heinzle,Microbiol 68:5843-5849, 2002 ；Marx et al.，J Biotechnol 104 :185-197，2003 ；0hnishi et al.，Microbiol Lett242 :265-274,2005)。在棒狀桿菌中，NADPH的主要供應途徑是TCA循環和戊糖磷酸途徑。優選生成L-賴氨酸所必需的還原能通過戊糖磷酸途徑的氧化途徑提供。在碳代謝產量方面，戊糖磷酸途徑在經濟上更有利，因為戊糖磷酸途徑的兩個循環釋放一分子CO2,并伴隨產生兩分子NADPH,而每一個TCA循環釋放兩分子CO2,并伴隨產生一分子NADPH。因此，L-賴氨酸產量提高需要更多的NADPH供應，導致對戊糖磷酸途徑更加依賴。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6DPH)和6_磷酸葡糖酸脫氫酶(6P⑶)都參與戊糖磷酸途徑，它們被報道與L-賴氨酸的生產相關(Marx et al. ,Biotechnol Bioeng 56:168-180,1997 ；ffittmann and Heinzle, Microbiol 68 :5843-5849,2002)。在產L-氨基酸的棒狀桿菌菌種中，當編碼造成戊糖磷酸途徑中NADPH生成的酶的基因被增強或當該酶被突變時，L-氨基酸的生產率被報道增加。例如，J. Becker等報道，向產L-賴氨酸的谷氨酸棒狀桿菌中編碼G6DPH的zwf基因提供較強的啟動子，導致賴氨酸產量顯著增加(J. Becker et al.，J Biotechnol 132 :99-109,2007) 歐洲專利號 1305237公開了通過培養被導入編碼6PGD突變體的基因的產L-氨基酸的棒狀桿菌而生產L-氨基酸的方法。然而，現有報道中沒有公開通過減弱棒狀桿菌內源的葡糖酸激酶(GntK)活性，增加戊糖磷酸途徑中NADPH生物合成的棒狀桿菌屬微生物。技術問題導致本發明的本發明人進行的透徹全面的研究以尋找高效高產量生產L-賴氨酸的方法為目的，導致這樣的發現通過在氧化戊糖磷酸途徑中進行遺傳修改造成的NADPH生產的提高能增加L-賴氨酸的產量。技術方案因此，本發明的一個目的是提供葡糖酸激酶(GntK)活性與內源活性相比減弱的產L-賴氨酸微生物。
本發明的另一個目的是提供生產所述產L-賴氨酸微生物的方法，包括構建編碼具有減弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其通過全部或部分地突變所述多核苷酸實現；將所述多核苷酸片段插入載體中，以獲得重組載體，所述載體能與宿主細胞中的染色體進行同源重組；將所述重組載體導入能生產L-賴氨酸的宿主細胞中以形成同源重組體；以及從所述同源重組體中選擇具有與其內源活性相比減弱的GntK活性的菌種。本發明的進一步目的是提供生產L-賴氨酸的方法，包括；培養本發明的微生物以獲得細胞培養物；以及從所述細胞培養物或所述微生物收集L-賴氨酸。有益效果本發明可以通過增加棒狀桿菌菌種的胞內NADPH水平高效高產量地生產其生物合成需要NADPH的L-氨基酸，特別是L-賴氨酸。
結合所附的附圖，由下文的詳細說明將更清楚地理解本發明的上述和其他目的、特征和其他優勢，其中圖I是說明谷氨酸棒狀桿菌中戊糖磷酸途徑的示意圖；圖2是說明用于無標記刪除棒狀桿菌染色體Ncgl2399基因的pDZ_ANCgl2399載體的不意圖；和圖3是說明用于無標記刪除棒狀桿菌染色體Ncgl2905基因的pDZ_ANCgl2905載體的示意圖。最佳實施方式根據其一個方面，本發明提供具有弱于內源活性的葡糖酸激酶(GntK)活性的產L-賴氨酸微生物。L-賴氨酸是堿性a-氨基酸，其化學式為NH2 (CH2)4CH (NH2) C00H。它是必需氨基酸，即人體不能合成。L-賴氨酸是通過賴氨酸生物合成途徑由草酰乙酸合成的，該途徑的部分由NADPH依賴性還原酶催化。通過該途徑生物合成一分子L-賴氨酸需要由酶直接消耗三分子NADPH，和間接使用一分子NADPH。本文所用的術語“葡糖酸激酶(GntK) ”指與產生6_磷酸葡糖酸的GntK途徑有關的酶，該6-磷酸葡糖酸是微生物中戊糖磷酸途徑的氧化過程中的中間體。棒狀桿菌屬微生物運行兩個途徑，即G6TOH途徑和GntK途徑，以合成6-磷酸葡糖酸——戊糖磷酸途徑的中間體(圖I)，即棒狀桿菌屬微生物可通過GntK途徑部分地降解葡萄糖。基于阻斷GntK途徑可以中斷向6-磷酸葡糖酸提供碳并將碳流從6-磷酸葡糖酸轉至戊糖磷酸途徑的氧化過程的假設，本發明人提出，阻斷GntK途徑導致6-磷酸葡糖酸脫氫酶(6PGD)活性的特異性增加，從而增加NADPH的再生。在此背景下，被推測在微生物中起葡糖酸激酶(GntK)作用的酶的活性被減弱。優選地，具有葡糖酸激酶(GntK)活性的酶可以是由SEQ ID NO :1的氨基酸序列表示的NCgl2399或由SEQ ID NO 2的氨基酸序列表示的NCgl2905。如本文所用，術語“內源活性”意在表示天然微生物中酶的活性，特別在與GntK組合使用時，指天然微生物表現出的GntK活性。術語“內源活性的減弱”是在微生物中含有編碼內源蛋白的多核苷酸的染色體上，由選自以下的方法實現的全部或部分刪除多核苷酸序列、部分替換多核苷酸序列或在多核苷酸序列中至少插入一個堿基對。此外,可以通過突變多核苷酸序列的調控元件減弱內源活性，其中突變是通過對調控元件全部或部分刪除、替換或插入實現的。調控元件可以在染色體中多核苷酸序列的上游或下游，優選地，調控元件可以是啟動子、增強子等，但本發明不限于此。多核苷酸的突變可以使用眾所周知的方法實現，如同源重組。本文所用的術語“與內源活性相比減弱的GntK活性”意在表示GntK活性被遺傳突變如干擾(disruption)下調，因而低于天然微生物中酶的內源活性。在本發明的實施方式中，本發明提供具有提高的L-賴氨酸生產率的棒狀桿菌屬微生物，其是通過導入由圖2或圖3的酶切圖所示的重組載體干擾GntK活性實現的。當存在兩個或更多個編碼具有葡糖酸激酶活性并具有彼此不同的氨基酸序列的蛋白質的染色體基因時，可以通過在其中至少一個染色體基因上全部或部分刪除、替換或插入，而減弱內源GntK活性。并且可以通過在其中至少一個所述染色體基因的調控元件上全部或部分刪除、部分替換或插入，而減弱內源GntK活性。
優選地，由刪除、替換或插入核苷酸造成的突變可以被允許發生在編碼NCgl2399或Ncgl2905的基因上，或具有分別編碼Ncgl2399和Ncgl2905的SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的核苷酸序列的基因中的一個或兩個上，或它們的調控元件上，使得GntK不能正常發揮功能。在本發明中，可以通過將攜帶部分編碼葡糖酸激酶的基因的重組載體導入其中以刪除或突變其內源葡糖酸激酶基因，制備具有與其內源活性相比減弱的葡糖酸激酶活性的微生物。將部分基因插入染色體可以用眾所周知的方法實現，如同源重組。在這點上，本發明提供制備產L-賴氨酸微生物的方法，包括以下步驟1)構建編碼具有減弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其是通過全部或部分突變所述多核苷酸實現的；2)將多核苷酸片段插入載體中，以獲得重組載體，所述載體能與宿主細胞中的染色體進行同源重組；3)將重組載體導入能生產L-賴氨酸的宿主細胞中以形成同源重組體；以及4)從同源重組體中選擇具有與其內源活性相比減弱的GntK活性的菌株。本文所用的術語“重組載體”意在指不能從宿主細胞染色體單獨復制的載體，通常指包含允許外源基因與染色體同源重組的基本元件的遺傳構建體。重組載體可以攜帶抗生素耐受基因和選擇基因，如果聚糖蔗糖酶(sacB)基因。優選地，本發明可使用由圖2和圖3的酶切圖所示的重組載體。只要能生產L-賴氨酸，任何菌種可以不受限制地用作重組載體所導入的宿主細胞。優選的是棒狀桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium spp.)的微生物。可用于本發明的宿主細胞的實例包括谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032、嗜熱產氨棒狀桿菌(C. thermoaminogenes)FERM BP-1539、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067 和乳酸發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869,以及由其衍生的產L-賴氨酸突變體或菌種，如谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881、谷氨酸棒狀桿菌KFCC11001和谷氨酸棒狀桿菌KCCM10770P。優選的是谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881。在本發明的實施方式中，使用谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881，但本發明不限于此。在本發明的實施方式中，使用pDZ載體(公開于韓國專利號0924065)刪除基因，該PDZ載體可在谷氨酸棒狀桿菌中進行目標基因的無標記刪除而不進行復制。即，構建攜帶部分編碼NCgl2399或NCgl2905的基因的重組載體，將其轉化到產L-賴氨酸棒狀桿菌菌株中，并允許其與基因組進行同源重組，以制備具有減弱的葡糖酸激酶活性的產L-賴氨酸棒狀桿菌菌種。在本發明中，將編碼NCgl2399的部分基因插入pDZ載體中，以構建重組載體，稱為pDZ-ANCgl2399，該重組載體隨后被轉化到棒狀桿菌菌種中。獲得的重組棒狀桿菌菌種——其中編碼NCgl2399的染色體基因被干擾——被命名為KFCC10881-ANCgl2399。單獨地，將攜帶編碼NCgl2905的部分基因——稱為pDZ- Δ NCgl2905——的重組pDZ載體轉化到棒狀桿菌菌種中。獲得的編碼NCgl2905的染色體基因被干擾的重組菌株被命名為KFCC10881-Δ NCgl2905。此外，用重組質粒 pDZ- Δ NCgl2905 轉化 KFCC10881- Δ NCgl2399以提供NCgl2399和NCgl2905都有缺陷的突變菌株。該菌株被命名為谷氨酸棒狀桿菌CAO1-0892，于2010年6月24日以登錄號KCCMl 1085P保藏于韓國微生物保藏中心(韓國，首爾)。此外，在本發明的一個實施方式中，評估了重組谷氨酸棒狀桿菌菌種的胞內葡糖酸激酶活性和NADPH水平。NCgl2399基因缺陷的菌株和NCgl2399和NCgl2905基因都有缺陷的菌株的胞內GntK活性被觀察到與親本菌株相比被減弱。此外，胞內NADPH水平和6PGD活性被觀察到與親本菌株相比被提高(表2)。因此，制備菌株的L-賴氨酸生產率被觀察到與親本菌株相比有所增加(表3)。這些結果證明葡糖酸激酶活性減弱至內源活性以下增加了 6P⑶活性，這對NADPH產生有積極效果，從而導致高效、高產率的L-賴氨酸生產。此外，在兩個或更多個不同的基因編碼具有葡糖酸激酶活性的蛋白的情況下，通過刪除其中兩個或更多個基因可以獲得較高的L-賴氨酸生產率。因此，本發明的產L-賴氨酸微生物可用于高效、高產率地生產L-賴氨酸。根據其另一方面，本發明提供生產L-賴氨酸的方法，包括以下步驟1)培養本發明的微生物以獲得細胞培養物；和2)從細胞培養物或微生物收集L-賴氨酸。如本文所用，術語“培養”指允許微生物在人工控制的條件下生長。多種本領域熟知的方法可用于培養本發明的重組體。細胞可以用分批方法或連續方法如補料分批方法或重復補料分批方法培養，但本發明不限于此。用于培養的培養基必須滿足所使用菌種的要求。本領域熟知適用于培養棒狀桿菌的培養基(例如 Manual of Methods for General Bacteriology, American Society forBacteriology, Washington D. C. , USA, 1981)。培養基的碳源可以是糖類(saccharides 和Carbohydrates)，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油和脂類，如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸、蓖麻酸；醇類，如甘油和乙醇；以及有機酸，如乙酸。這些材料可以單獨或組合使用。可用于培養重組體的氮源的實例包括蛋白胨、酵母膏、肉湯、麥芽膏、玉米漿、大豆粉和尿素；或無機化合物，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可以單獨或組合使用。磷源中可用于培養基的是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和相應的鈉鹽。此外，培養基可以包含細胞生長必需的金屬鹽，并可以補充必需的營養物，如氨基酸和維生素。此外，可以在培養基中加入適當的前體。營養物或補充物可以一次一起加入或在培養過程中分別加入。可以使用堿性化合物調整培養基的pH，如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨或酸性化合物、如磷酸或硫酸。可以使用消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯抑制所述培養基中泡沫的產生。可以通過向其中導入氧氣或含氧氣體(例如空氣)，將培養基保持在有氧條件下。培養溫度通常在20和45°C之間，優選地在25和40°C之間。持續培養直到產生最大量的L-氨基酸。在此方面，其可以在10至160小時內完成。在產生后，L-賴氨酸可以被運送到培養基中或保留在細胞內。根據本發明的L-賴氨酸生產方法包 括從細胞或細胞培養物收集賴氨酸。可以用眾所周知的方法從培養基或細胞分離L-賴氨酸。可用于本發明的分離方法的實例包括離心、過濾、陰離子交換層析、結晶和HPLC，但不限于此。發明方式通過以下的實施例，可以獲得對本發明的更好的理解。以下實施例被提出以進行示例，但不被解釋為限制本發明。實施例I :通過位點特異性基因干擾(Site-Specific Gene Disruption)制備突變菌株設計用于制備突變菌株KFCC10881-ANCgl2399 和 KFCC10881-Λ NCgl2905 的引物。首先，從 NIH GenBank 獲得 NCgl 2399 (SEQ ID NO :1)和 NCgl2905 (SEQ ID NO 2)的序列。在這些序列的基礎上，合成將用于構建NCgl2399和NCgl2905的失活片段的引物2399F1、2399F2、2399R1、2399R2、2905F1、2905F2、2905R1 和 2905R2 (表 I)。表 I 總結了用于本發明的引物的核苷酸序列以及其SEQ ID NO，其中限制性位點用下劃線標出。表I
權利要求
1.產L-賴氨酸微生物，具有與其內源活性相比減弱的葡糖酸激酶(GntK)活性。
2.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，其中所述葡糖酸激酶具有SEQID N0:1或SEQ ID NO 2的氨基酸序列。
3.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物,其中所述微生物屬于棒狀桿菌屬。
4.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，其中所述 內源葡糖酸激酶活性通過在編碼葡糖酸激酶的染色體基因上的全部或部分刪除、部分替換或插入而減弱。
5.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，其中所述內源葡糖酸激酶活性通過在編碼葡糖酸激酶的染色體基因的調控元件上的全部或部分刪除、部分替換或插入而減弱。
6.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，其中當存在兩個或更多個編碼具有葡糖酸激酶活性并具有彼此不同的氨基酸序列的蛋白質的染色體基因時，所述內源葡糖酸激酶活性通過在至少一個所述染色體基因上的全部或部分刪除、替換或插入；或在至少一個所述染色體基因的調控元件上的全部或部分刪除、部分替換或插入而減弱。
7.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，源自谷氨酸棒狀桿菌KFCC10881。
8.權利要求I所述的產L-賴氨酸微生物，被確定為谷氨酸棒狀桿菌CA01-0892，以登錄號KCCMl 1085P保藏。
9.制備權利要求1-8中的一項所述的產L-賴氨酸微生物的方法，包括以下步驟 1)構建編碼具有減弱的活性的葡糖酸激酶(GntK)的多核苷酸片段，其通過全部或部分地突變所述多核苷酸實現； 2)將所述多核苷酸片段插入載體中，以獲得重組載體，所述載體能與宿主細胞中的染色體進行同源重組； 3)將所述重組載體導入能生產L-賴氨酸的宿主細胞中以形成同源重組體；和 4)從所述同源重組體中選擇具有與其內源活性相比減弱的GntK活性的菌種。
10.生產L-賴氨酸的方法，包括以下步驟 1)培養權利要求1-8中的一項所述的微生物，以獲得細胞培養物；和 2)從所述細胞培養物或所述微生物收集L-賴氨酸。
全文摘要
公開了具有與其內源活性相比減弱的葡糖酸激酶活性的產L-賴氨酸微生物，和用于制備所述微生物和使用所述微生物生產L-賴氨酸的方法。
文檔編號C12R1/15GK102741393SQ201180002405
公開日2012年10月17日 申請日期2011年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者張在佑, 文準玉, 林相曹, 趙載熔, 金亨俊 申請人:Cj第一制糖株式會社