專利名稱：痛風相關尿酸濃度檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及分子生物學和醫學領域，具體涉及檢測痛風相關尿酸濃度的試劑盒，通過同時檢測與痛風密切相關的葡萄糖易化轉運蛋白-9 (SLC2A9)和三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2 (ABCG2)的單核苷酸多態性位點基因型來評估個體患痛風的風險。
背景技術：
血尿酸增高(高尿酸血癥)導致痛風，當尿酸達超飽和狀態時，可在關節內形成單鈉尿酸鹽結晶。對某些人來說，這些晶體可誘發疼痛性自限性炎性反應，即急性痛風性關節炎。高尿酸血癥最重要的原因是尿酸從尿中排泄減少，而尿酸的排泄是由表達在腎集合管上的尿酸轉運分子來調節的，這是痛風發生的關鍵病理生理。發生痛風其他的關鍵點是肝臟尿酸鹽生成、單鈉尿酸結晶形成和急性炎癥反應觸發。調節尿酸濃度的全基因組相關掃描證實有2種主要的高尿酸調節分子——腎臟尿酸轉運子SLC2A9和ABCG2。葡萄糖易化轉運蛋白-9(Facilitated Glucose Transporter 9, SLC2A9,GLUT-9)是溶質運載蛋白家族成員(Solute Carrier Family)之一,在維持體內葡萄糖代謝的相對穩定和平衡中具有重要作用，還可能參與軟骨基質中成骨細胞的生長發育的調控，其表達異常或變異還可能與尿酸轉運異常有夫。SLC2A9基因定位于5號染色體(5B3)，有2個變體，分別由540aa和511aa組成，在小鼠陰道，結締組織，肺和脾臟等組織表達豐富，而人類只在正常腎臟有效高的表達，在卵巢腫瘤，子宮和軟骨肉瘤時呈現高表達。之前對于尿酸轉運蛋白的研究，主要集中于尿酸如何由腎小管轉運至上皮細胞內部，而對其如何從細胞內進入血液的過程，研究甚少。最近Promsuk等發現GLUT9是ー種果糖轉運蛋白，屬于SLC2A9家族，在腎臟中固定在腎小管上皮細胞基地外側膜上，主要負責將尿酸分泌到細胞外。該蛋白的轉運功能并不依賴于Na+，而當細胞外K+濃度升高時，其轉運功能增強。Promsuk等將其命名為電勢驅動尿酸轉運蛋白I (voltagedriven uratetransporter I, URATvl)。腎臟低尿酸血癥患者證實了該蛋白在人體內對尿酸的轉運作用，該患者編碼URATl的SL22A12的基因序列正常，而編碼GLUT9的SLC2A9上P412R基因序列發生了缺失型突變。同事，Veronique等通過對克羅地亞人基因組研究發現，尿酸濃度變化的I. 7% 5. 3%與SLC2A9基因序列有關，同時該基因序列的多樣性與英國人群，克羅埃西亞人群，德國人群樣本的尿酸分級排泄減少有關，該蛋白尿酸轉運功能通過爪蟾卵模型(Xenopus laevis oocytes)得到驗證。Dinour等研究了兩個患者有嚴重遺傳性低尿酸血癥的家庭，其中ー個家庭6個成員SLC2A9上的L75R發生錯義突變，另ー個發生36kb的缺失突變，蛋白合成不完整。結果說明，L75R基因突變嚴重影響尿酸的正常重吸收。目前通過基因組多樣性研究，已經發現有6個SLC2A9單核苷酸多態性(rs6855911，rs7442295，rs6449213, rsl2510549, rs737267, rsl014290)與血清尿酸濃度有夫。1998年Doyle等首先在乳腺癌細胞株MCF-7/AdrVp中檢測到一種跨膜轉運蛋白，成為乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP),系統發育分析該基因為 ABC 轉運蛋白超家族(ATP-binding cassette transporter superfamily, ABCtransporter superfamily)G亞家族第2成員，命名為ABCG2。ABCG2定位于細胞膜，在正常組織中分布廣泛，主要分布于具有分泌和排泄功能的組織如胎盤合體滋養層、小腸和結腸上皮、肝臟小管膜、膽小管膜、乳腺小葉及血管內皮細胞中。人類ABCG2基因位于4q22 23，編碼655個氨基酸殘基。ABCG2全長66kb，由16個外顯子和15個內含子組成，外顯子為6(T332bp不等。ABCG2在人體內承擔著一定的生理功能，如維持細胞穩態、血腦屏障、胎血屏障等，同時與疾病的易感性及藥動學等相關。三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2 (ABCG2)作為ー種轉運蛋白定位于細胞膜，廣泛分布在具有分泌和排泄功能的組織，在腎臟中，該蛋白表達在腎小管上皮細胞刷狀緣側。在機體內負責維持細胞穩態，對細胞低氧的保護，及在藥代動力學中的作用等，目前是臨床治療腫瘤(化療)的靶點之一。最近，Owen等通過爪蟾卵表達人ABCG2蛋白的方法和LLC-PKl細胞實驗證實了 ABCG2是ー種尿酸分泌蛋白。同時在14783名受試者中，進行ABCG2單核苷酸基因多態性分析，發現rs2231142 (Q141K)功能缺失與血清尿酸濃度密切相關。約有10%的白人痛風病案與該缺失突變相關。Hirotaka Matsuo等對739名日本人受試者數量性狀遺傳位點分析顯示，該功能缺失能夠阻礙尿酸排泄，使血清尿酸濃度上升，引發高尿酸血癥。同樣，Kazumasa等在3923名年齡在40 90歲的日本人中，分析了 rs2231142單核苷酸多態性與血清尿酸濃度及高尿酸血癥和痛風的關系，證明兩者具有密切相關性。
發明內容本實用新型針對目的是提供ー種采用熒光定量PCR技術同時檢測兩個尿酸濃度相關基因SNP位點的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應液的兩個試管、裝有陽性對照品的ー個試管、裝有陰性對照品的ー個試管組成，襯墊上設有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品。其中熒光定量PCR反應液的成分包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用上游引物、SNP位點檢測用下游引物、SNP位點基因型ー熒光探針、SNP位點基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，葡萄糖易化轉運蛋白-9 (SLC2A9)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GTACCACTCCACCTGG -3’下游引物序列5’- TGTCTTCATCTACTTG -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - AAGCACAaAAATGA - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- AAGCACAgAAATGA -TAMRA -3’三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2 (ABCG2)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GCAAGCCGAAGAGCTG -3’下游引物序列5’- CACTCTGACGGTGAGA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - TGAGAACTgTAAGTTT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - TGAGAACTtTAAGTTT -TAMRA -3’對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為ロ腔粘膜細胞DNA樣品。 本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復凍融。[0022]本實用新型試劑盒使用方法毎次檢測均應設立陽性對照和陰性對照。擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行，分為6個反應管，每ー個SNP位點檢測使用3個反應管，其中I個反應管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用I個反應管，每管中總體積 ομ 1，其中8μ I PCR反應液，2 μ I檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循 環的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應完成后在熒光定量PCR儀上進行終點熒光讀取，根據得到的ニ維熒光圖和實時擴增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點基因型。本實用新型提供的該試劑盒主要用于檢測尿酸濃度相關基因SNP位點，從而告知被檢者患病風險數值，提前預防和控制，指導醫師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者迸行針對性治療。本實用新型的特點是該試劑盒運用熒光定量PCR技術實現了同時檢測兩個尿酸濃度相關基因SNP位點基因型的目的，相對于現有的熒光定量PCR試劑盒只檢測ー個SNP位點，本實用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點檢測整合在ー個試劑盒內，使用更方便而且成本更低，對個體患痛風風險性的評估也更便捷。
圖I為本實用新型的結構示意圖。
具體實施方式
本實用新型結合附圖和具體實施例作進ー步說明。應該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本實用新型范圍。實施例I參見圖1，本實用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中熒光定量PCR反應液的成分包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、SNP位點檢測用上游引物、SNP位點檢測用下游引物、SNP位點基因型ー熒光探針、SNP位點基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復凍融。實施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關試劑購于美國Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。2.引物及探針葡萄糖易化轉運蛋白-9 (SLC2A9)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GTACCACTCCACCTGG -3’下游引物序列5’- TGTCTTCATCTACTTG -3’[0040]基因型ー熒光探針序列5’-FAM - AAGCACAaAAATGA - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- AAGCACAgAAATGA -TAMRA -3’三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G2 (ABCG2)上的SNP位點檢測引物和探針為上游引物序列5’- GCAAGCCGAAGAGCTG -3’下游引物序列5’- CACTCTGACGGTGAGA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - TGAGAACTgTAAGTTT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - TGAGAACTtTAAGTTT -TAMRA _3’ 3.樣本檢測選取30例血液樣本，其中已確定患痛風的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。姆一例檢測為12個反應管,姆管中總體積10μ I,其中8μ I PCR反應液,姆ー個SNP位點檢測使用3個反應管，I個反應管中加入2 μ I被檢測DNA,另外2個反應管中加入2 μ I陽性對照和陰性對照，在ΑΒΙ7900熒光定量PCR儀上進行擴增。反應條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進行60個循環的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應完成后在熒光定量PCR儀上進行終點熒光讀取。
權利要求1.ー種痛風相關尿酸濃度檢測試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2)、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應液的兩個試管(3)、裝有陽性對照品的一個試管(4)、裝有陰性對照品的一個試管(5)組成，襯墊(2)上設有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應液(3 )、陽性對照品(4 )和陰性對照品(5 )。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測尿酸濃度相關基因位點是否發生突變從而評估個體患痛風風險性的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測兩個SNP位點的熒光定量PCR反應液的兩個試管3、裝有陽性對照品的一個試管4、裝有陰性對照品的一個試管5組成，襯墊上設有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實用新型試劑盒運用熒光定量PCR技術實現了同時檢測兩個尿酸濃度相關基因SNP位點基因型的目的，相對于現有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個SNP位點，本實用新型試劑盒將與同一疾病的兩個SNP位點檢測整合在一個試劑盒內，使用更方便而且成本更低，對個體患痛風風險性的評估也更便捷。
文檔編號C12M1/34GK202401060SQ2011205694
公開日2012年8月29日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫學科技有限公司