專利名稱：一種采用戊二醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme435的方法
技術領域：
本發明涉及一種采用戊ニ醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，以及采用修飾后的脂肪酶Novozyme 435催化外消旋2，2- ニ甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體(S)-(+)_2，2-ニ甲基環丙烷甲酸。
(ニ)
背景技術：
S-(+)_2，2-ニ甲基環丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中間體。西司他丁 (Cilsatatin)化學名(+) _ (Z) _7_[ QR) - (2_ 氨基 _2_ 羧基乙基)硫]_2_[ (IS) - (2，2-ニ 甲基環丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一個應用于臨床的腎脫氫ニ肽酶抑制劑。西司他丁與碳青霉烯類抗生素亞胺培南(Imipenem)制成的復合劑泰能 (Tienam)既有極強的廣譜抗菌活性，又具內酰胺酶抑制作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌均有較強的抗菌作用，特別適用于治療多種菌聯合感染以及需氧菌和厭氧菌的混合感染，是目前臨床應用最廣泛的抗生素和治療未知重癥感染的王牌藥物之一。制備S-(+)_2，2-ニ甲基環丙烷甲酸的方法主要有化學法和生物法。王普等采用脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2-ニ甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體S-(+)-2，2-ニ甲基環丙烷甲酸， 可獲得45. 6%的產率，產物光學純度為99. 2%。脂肪酶Novozyme 435重復使用4次后，產率下降至25.8%，僅為初次催化產率的56. 5%，ee值為96. 9% (脂肪酶Novozyme 435選擇性催化2，2_ ニ甲基環丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2，2-ニ甲基環丙烷甲酸.催化學報.2010， 31 (6) =651-655)。由于Novozyme 435為南極假絲酵母脂肪酶B (即脂肪酶CAL-B)經大孔吸附樹脂吸附制得的固定化酶，在反應過程中會出現酶分子脫落現象，從而造成酶回收量的減少，影響酶的重復使用效果，從而影響該生物拆分過程的催化劑成本。
發明內容
本發明目的是進ー步提高脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2_ ニ甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解的酶活性和穩定性，通過對脂肪酶Novozyme 435進行戊ニ醛交聯的“酶二次修飾”，提高該酶的穩定性，改善其催化活性，提高重復使用次數。本發明采用的技術方案是一種采用戊ニ醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入質量濃度0. 5% 10%的戊ニ醛溶液中，在20 50°C、40 MOrpm下進行化學交聯15 120min，交聯反應結束后，用蒸餾水充分洗去未反應的戊ニ醛，干燥得到戊ニ醛交聯修飾后的脂肪酶Novozyme 435。所述的脂肪酶 Novozyme 435 購自丹麥諾禾ロ諾德公司(Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark)。戊ニ醛與酶分子中的氨基結合，使酶分子固定化，從而提高酶的穩定性，但加入過量的戊二醛也會破壞酶分子的結構，引起酶的失活。因此，在進行戊二醛交聯反應時，需要選取適當的戊二醛濃度，既保證酶的修飾所需，同時又盡可能減少因過高戊二醛濃度造成的酶分子失活，以提高酶的穩定性。所用戊二醛溶液質量濃度優選為0. 5% 3. 0%。優選的，所述交聯反應在30 35 °C、120 MOrpm下進行。采用戊二醛交聯后的脂肪酶Novozyme 435為生物催化劑，以外消旋2，2_ 二甲基環丙烷甲酸乙酯為底物，于水相反應體系中，PH 6. 0 8. 0、20 50°C下進行酶催化不對稱水解反應，反應結束后，反應液經分離得到產物(S)-(+)_2，2-二甲基環丙烷甲酸。該水相反應體系通常可以是pH 6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液，即所述的反應是將2， 2-二甲基環丙烷甲酸乙酯與戊二醛交聯修飾后的脂肪酶Novozyme 435加入pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液中進行水解反應，通常反應條件為搖床轉速為40 240rpm，pH 6. 0 8. 0,20 50°C，反應時間為0 80h，所述的2，2- 二甲基環丙烷甲酸乙酯的添加量為5g/ L 20g/L磷酸緩沖液，所述的交聯修飾脂肪酶Novozyme 435添加量為10g/L 20g/L磷酸緩沖液。所述的產物產率和產物e. e.值測定采用氣相色譜法。反應結束后，反應液用兩倍體積乙酸乙酯萃取，定容后采用氣相色譜分析。本發明中所用色譜柱為Chirasil-Dex CB毛細管柱Q5mmX0· 25mm ；Varian Co.， Palo Alto, CA, USA)。色譜條件為載氣為氮氣；檢測器為氫火焰離子檢測器；進樣口溫度和檢測器溫度為250°C ；柱溫為程序升溫80°C保留3min，然后以8°C /min升溫至180°C，保留^iin ；流速為2ml/min ； 分流比為15 1。底物和產物標準品的氣相色譜圖見
圖1。酶活力的定義為在30°C下，每分鐘催化2，2_ 二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解生成1微克 S-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸所需的酶量，為一個酶活力單位(U)。酶活力用每克脂肪酶 Novozyme 435所含的酶活力單位數(U/g)表示。生物催化2，2_ 二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解的反應過程如下
權利要求
1.一種采用戊二醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入質量濃度0. 5% 10%的戊二醛溶液中， 在20°C 50°C、40rpm MOrpm下進行化學交聯反應15min 120min，反應結束后，用蒸餾水充分洗去未反應的戊二醛，干燥得到戊二醛交聯修飾后的脂肪酶NOVOZyme435。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所用戊二醛溶液質量濃度為0.5% 3. 0%。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述交聯反應在30°C 35°C、120rpm 240rpm下進行。
全文摘要
本發明提供了一種采用戊二醛交聯修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L～20g/L添加量，加入質量濃度0.5％～10％的戊二醛溶液中，在20℃～50℃、40rpm～240rpm下進行交聯反應15min～120min，反應結束后，用蒸餾水充分洗去未反應的戊二醛，干燥得到戊二醛交聯修飾后的脂肪酶Novozyme 435。本發明采用戊二醛對脂肪酶Novozyme 435進行化學交聯后，得到的二次修飾后脂肪酶Novozyme 435的穩定性得到了提高，經考察重復5次用于催化2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解的催化性能，經二次修飾后的Novozyme 435重復使用5次后所得產率較未交聯修飾的脂肪酶Novozyme 435提高了49.3％。
文檔編號C12N11/08GK102533710SQ20111046047
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者何軍邀, 梁法勇, 王普, 黃金 申請人:浙江工業大學