專利名稱：奶牛fgf2基因的單核苷酸多態性序列及其檢測方法
奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列及其檢測方法技術領域
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列及其檢測方法。
背景技術：
FGF2是纖維母細胞生長因子家族成員，通過細胞表面的FGF受體(FGFR)調節機體的生長和發育。FGF2誘導的信號轉導是正常細胞生長分化所必需的，參與血管新生、胚胎發育、骨骼形成等生理過程。此外，有研究表明，FGF2在某些情況下也可以誘導ES細胞向神經系統分化。成纖維細胞生長因子(FGF)家族調控不同生理時期牛的乳腺發育，而且FGF2 在牛發情期和懷孕早期的子宮內膜表達，能夠增加滋養外胚層IFN-tau(IFN- τ )的mRNA和蛋白質豐度。IFN-τ是反芻動物懷孕建立的因子，激活子宮內膜腺體中的JAK-STAT通路， 是JAK-STAT信號傳導途徑中的重要一員，在受精和早期胚胎發育中具有重要作用，能夠促進反芻動物懷孕的持續，而且多個信號通路都跟IFN- τ的表達有關。
目前國內外對FGF2基因與奶牛的繁殖性狀和產奶性狀相關性的研究很少。單核苷酸多態性(SNPs)和生產性狀間的關聯分析表明FGF2基因與奶牛體細胞數、生產使用年限和胚胎死亡率等性狀間存在顯著相關，為奶牛的標記輔助選擇育種提供理論依據。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供FGF2基因第一內含子中的SNP位點、其確定方法及應用，為提高奶牛的繁殖率和使用年限以及奶牛的分子育種提供理論依據。
本發明的技術方案如下
奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列，其中，所述奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列包括奶牛FGF2基因第一內含子第11646位為A或G的單核苷酸多態性序列。
—組檢測權利要求1所述奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的引物，其中，所述引物對的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物對的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示。
上述技術方案所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，包括下述步驟
以奶牛基因組池DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶牛FGF2基因；對純化的PCR產物進行測序，確定奶牛FGF2單核苷酸多態性位點；
所述的引物對P的上游引物FGF2-Inl的序列如序列表1所示，下游引物FGF2_In2 的序列如序列表2所示，具體的為
上游引物FGF2-Inl :5，TCAGTCTTCACATCCGTCTCAG 3，，
下游引物FGF2-In2 :5，TCATACACTGAAGCCTGAAGC 3，。
上述技術方案所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其中，所述檢測方法還包括對奶牛FGF2基因單核苷酸多態性序列的鑒定步驟，包括以奶牛FGF2基因為模板，以引物對F為引物，進行PCR擴增；PCR產物用Csp6I限制性內切酶進行酶切后用瓊脂糖凝膠電泳進行分離鑒定，根據電泳結果鑒定奶牛FGF2基因第11646位的單核苷酸多態性為A等位基因為207bp，G等位基因為171bp ；
所述引物對F的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物對F的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示，具體為
上游弓ι 物 FGF2-F 5，CATAGTTCTGTAGACTAGAAG 3，，
下游引物FGF2-R :5，CCTCTAAAGAAGGATTAAGTCAAAATGGGGCTGGTA 3，；
在本技術方案中為了引入Csp6I限制性內切酶的識別位點，所述引物對F為突變引物，下游引物FGF2-R的G堿基為突變堿基(A突變為C)。
上述技術方案所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其中，所述鑒定步驟中的PCR反應過程為95°C變性5min，然后94°C 45s，退火溫度63到50°C 45s, 72 °C 45s，32個循環，每個循環降低2°C，然后72°C延伸Snin。
上述技術方案所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其中，瓊脂糖凝膠的濃度為2%。
本發明具有以下有益效果
本發明的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性位點是首次發現的新位點，通過對 2773個個體的基因型與性狀間的關聯分析表明該SNP位點與乳脂量和乳脂率、體細胞計數、繁殖力有關；通過對4542個個體外受精胚胎的基因型分析，發現該SNP位點與胚胎成活率有關，通過對該基因多態性的研究，可用于奶牛分子標記輔助育種以及提高體外受精胚胎成活率。
1、圖 1 為 FGF2 gene 11646 位點的 A/G 突變2、圖2為限制性內切酶Csp6I酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施例方式
為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1 :FGF2基因的SNP位點的檢測方法與鑒定
(一)本發明FGF2基因的SNP位點(即第一內含子11646位點的A/G突變)確定步驟
本發明的FGF2基因第一內含子中的SNP位點的確定方法，包括步驟
(1)采集2773奶牛個體的血液、牛奶和精液，分別從血液、牛奶和精液中提取奶牛的基因組DNA，利用GFX基因組DNA純化試劑盒提取(操作步驟按照試劑盒的操作說明進行)，奶牛個體樣品采集和來源見表1 ；
表1樣品采集及來源
權利要求
1.奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列，其特征在于所述奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列包括奶牛FGF2基因第一內含子第11646位為A或G的單核苷酸多態性序列。
2.一組檢測權利要求1所述奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的引物對，其特征在于所述引物對的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物對的下游引物FGF2-R 的序列如序列表4所示。
3.權利要求1所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，包括下述步驟以奶牛基因組池DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶牛FGF2基因；對純化的 PCR產物進行測序，確定奶牛FGF2單核苷酸多態性位點為第11646位A或G ；所述的引物對P的上游引物FGF2-Inl的序列如序列表1所示，下游引物FGF2_In2的序列如序列表2所示。
4.根據權利要求3所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其特征在于所述檢測方法還包括對奶牛FGF2基因單核苷酸多態性序列的鑒定步驟，包括以奶牛基因組為模板，以引物對F為引物，進行PCR擴增，其中引物對F的上游引物FGF2-F的序列如序列表3所示，所述引物對F的下游引物FGF2-R的序列如序列表4所示；PCR產物用 CspBI限制性內切酶進行酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離鑒定，根據電泳結果鑒定奶牛FGF2基因第11646位的單核苷酸多態性為A等位基因為207bp，G等位基因為171bp。
5.根據權利要求4所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其特征在于所述鑒定步驟中的PCR反應過程為95°C變性5min，然后94°C 45s，退火溫度63°C到 500C 45s, 720C 45s，共32個循環，每個循環降低2°C，然后72°C延伸&iiin。
6.根據權利要求4或5所述的奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列的檢測方法，其特征在于瓊脂糖凝膠的濃度為2%。
全文摘要
本發明奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列及其檢測方法，屬于基因工程技術領域，所述奶牛FGF2基因的單核苷酸多態性序列包括奶牛FGF2基因第一內含子第11646位為A或G的單核苷酸多態性序列。所述檢測方法為以奶牛基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增奶牛FGF2基因；對純化的PCR產物進行測序，確定奶牛FGF2單核苷酸多態性位點為第11646位A或G。本發明的奶牛FGF2基因的SNP位點與乳脂量和乳脂率、體細胞計數、繁殖力有關；通過對體外受精胚胎的基因型分析，發現該SNP位點與胚胎成活率有關，通過對該基因多態性與性狀的關聯分析研究，可將該標記位點用于奶牛分子標記輔助育種以及提高體外受精胚胎成活率。
文檔編號C12N15/11GK102533774SQ20111046009
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者張婷婷, 張智英, 徐華榮, 李托, 王昕 , 趙志東 申請人:西北農林科技大學