專利名稱：一種含金紋細蛾幾丁質酶基因重組質粒的構建和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及一種新的金紋細蛾幾丁質酶基因LrCHI，涉及昆蟲幾丁質酶基因的重組原核載體的構建和應用。并且涉及到金紋細蛾幾丁質酶基因的克隆方法、重組質粒構建過程以及LrCHI對真菌生長的抑制研究。
背景技術：
幾丁質(chitin)又稱甲殼素、殼多糖，是通過β-1，4-糖苷鍵連接成不分支的 N-乙酞氨基葡萄糖胺的同聚物，它是自然界中許多生物的結構性組分，主要存在于無脊椎動物、藻類、真菌等生物體中。昆蟲幾丁質是昆蟲表皮和圍食膜的重要組成成分，在昆蟲生長、發育的各個時期都需要一定量的幾丁質。昆蟲幾丁質酶是一種參與昆蟲幾丁質代謝的重要內切型蛋白酶，它通過破壞幾丁質的β-1，4-糖苷鍵初步將幾丁質降解成低分子量的寡聚物。昆蟲的幾丁質酶存在于中腸、蛻皮腺及某些昆蟲(如蜜蜂)的毒腺中，在昆蟲的消化、變態、侵染等生理活動中的發揮著重要的作用。在昆蟲的整個生命周期中，往往不只表達一種幾丁質酶基因，有的多達18種幾丁質酶類似基因。不同的幾丁質酶基因在昆蟲不同的生命階段發揮著相應的功能。利用 southern雜交、RT-PCR等技術對多種昆蟲幾丁質酶基因的時空表達進行系統研究，結果表明I型幾丁質酶基因在昆蟲整個生長發育階段都有一定水平的表達，是昆蟲體內最重要、 最基本一種幾丁質酶。I型幾丁質酶基因也是目前研究得最為深入、廣泛的一類幾丁質酶基因，迄今為止，已從鱗翅目、雙翅目、鞘翅目昆蟲中發現并報道了 50余種I型幾丁質酶基因。 昆蟲I型幾丁質酶的分子量在45 85kD之間，酶的活性范圍在pH 4. 0 8. 0之間，等電點在5. 0 7. 0之間，大多屬于18家族幾丁質酶，其蛋白質由4個結構域組成N端信號肽、 催化區、連接區和幾丁質結合區，在催化區和結合區各有一段保守氨基酸序列，是克隆基因時設計引物的重要依據。不同種類的昆蟲其I型幾丁質酶基因的結構特點基本相同，以最先發現的煙草天蛾I型幾丁質酶基因為例說明該基因全長M52bp，包含一個1662bp的開放閱讀框，編碼5M個氨基酸，由煙草天蛾基因組中的11個外顯子和9個內含子轉錄而來。由于昆蟲幾丁質酶在昆蟲各項生理活動中的重要作用，將其納入到害蟲防治上成為近幾年各國學者的研究熱點。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種被廣泛認可和使用的微生物殺蟲劑，Arora等報道，幾丁質酶Chi36的加入使得Bt對斜紋夜蛾幼蟲的半致死濃度降低了 30% ；桿狀病毒是昆蟲專一性的病原微生物，在農業害蟲的防治中有很大的應用前景，范曉軍等用重組有東亞鉗蝎昆蟲神經毒素基因和煙草天蛾幾丁質酶基因的雙價重組苜蓿銀紋夜蛾桿狀病毒和野生型桿狀病毒分別感染中國棉鈴蟲，結果表明重組病毒的半致死濃度比野生型病毒明顯減小；昆蟲幾丁質酶基因在轉基因植物中的組成型表達也獲得了較好的防治害蟲效果，Gatehous等將昆蟲幾丁質酶基因轉入馬鈴薯中表達，獲得的轉基因馬鈴薯增強了對蚜蟲的抗性。Ding等對來源于煙草天蛾、細菌、放線菌和植物的4種幾丁質酶轉基因煙草進行試驗，均以1 % 2 %的濃度加入到新生的甲蟲幼蟲食物中，結果發現來源于細菌和植物的幾丁質酶轉基因煙草對幼蟲的成活率及生長情況沒有產生明顯的影響，而取食了含昆蟲幾丁質酶轉基因煙草食物的幼蟲在卵孵化后的幾天內死亡。這說明昆蟲幾丁質酶對增強植物抗蟲效果更為有效。張宏斌等人分別在家蠶和棉鈴蟲體內提取幾丁質酶，在其最適條件下，和酵母、青霉菌一起在LB固體培養基上培養，抑菌圈實驗表明幾丁質酶對這種真菌的生長有明顯抑制作用。這些研究表明昆蟲幾丁質酶對害蟲和真菌的抑制的確有一定的效果。昆蟲和一些病原真菌的外殼作為物理化學屏障來抵抗不良環境和捕食者，其主要由幾丁質和蛋白質組成，將昆蟲幾丁質酶應用于害蟲防治和真菌防治中，利用幾丁質酶來分解昆蟲的外殼、真菌細胞壁等含幾丁質的組織來抑制其正常的生理活動，是一種安全、有效、可行的新型生物防治策略。
發明內容
本發明提供一種LrCHI基因克隆和重組原核表達質粒pRSET-LrCHI的構建方法， LrCHI為金紋細蛾幾丁質酶基因。本發明克隆得到的金紋細蛾幾丁質酶基因LrCHI是一種未知基因，其開放閱讀框由1737bp組成，編碼578個氨基酸，預測分子量為64. 4kDa,等電點pi為5. 49，其序列是 SEQ ID NO :1，應用NCBI上的Blast進行同源性分析，結果顯示與鱗翅目昆蟲幾丁質酶基因序列之間同源性較高，均超過75%。該基因為本發明人首次發現并報道，同時也是金紋細蛾的首個報道的基因。本發明提供一種金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)的重組質粒載體pRSET-LrCHI， 它包含pRSET載體片段和金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)SEQ ID NO :1。所述的重組質粒中的質粒片段pRSET是一種原核表達載體，由PUC質粒改造而來， 其包含的主要元件為=LrCHI與pRSET重組的多克隆位點；在IPTG的誘導下可高效表達外源基因LrCHI的T7啟動子；或便于后續的蛋白純化的6XHis ；或有利于重組子的篩選的氨芐青霉素抗性基因。本發明所述的重組質粒PRSET-LrCHI中，金紋細蛾幾丁質酶基因LrCHI 和質粒片段PRSET都有xho I和hindIII酶切位點。本發明提供一種金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)的重組質粒載體pRSET-LrCHI， 其外源基因金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)插入到載體pRSET的多克隆位點后，置于其T7 啟動子下。本發明提供一種金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)的重組質粒載體pRSET-LrCHI， 其重組質粒含氨芐青霉素抗性基因和6XHis蛋白標簽序列。本發明提供一種構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法，包括以下步驟(1)、取預蛹期金紋細蛾中腸，提取中腸總RNA ；(2)、金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)SEQ ID NO=I的克隆；(3)、將質粒載體pRSET與步驟2獲得的含SEQ ID NO=I的PCR產物酶切后連接。本發明提供一種構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法，利用cDNA末端快速擴增技術(RACE)從金紋細蛾體內擴增得到了金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)SEQ ID N0:1，并將其連接到質粒PRSET上，構建含金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)的原核表達載體。上述步驟還包括步驟4即對重組質粒進行酶切、PCR、測序鑒定。本發明提供構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法中，步驟1的金紋細蛾為實驗室人工飼養，飼料配方為玉米面300g，豆餅粉100g，酵母粉100g，維生素C IOg,復合維生素Bi. 5g，山梨酸1. 5g，檸檬酸2. 5g，丙酸5ml，瓊脂粉25g，水1300ml。飼養至預蛹期的金紋細蛾取幼蟲中腸備用。步驟1的中腸總RNA的提取方法包括將新鮮組織研磨成勻漿、離心、靜置，用溶劑進行分離。具體為離心管中分別加入氯仿后離心，取上清液再分別加入異丙醇，靜置離心， 棄去上清液，再加入乙醇，離心，棄去上清夜，沉淀中加入50 μ IDEPC滅菌水，用槍頭吸打混勻，65°C水浴加熱10分鐘，保存于液氮中。目前克隆一個未知基因的方法有很多，諸如RNA指紋技術、cDNA文庫刪選、cDNA末端快速擴張技術(RACE)等，本發明采用的是RACE來克隆LrCHI，RACE技術主要由以下幾步組成RNA的提取和反轉錄合成cDNA ；根據相對保守的氨基酸序列設計兼并引物克隆保守區之間的片段；依據得到的保守序列設計多條3’和5’ RACE引物，利用3’和5’ RACE方法分別克隆出基因的3’端和5’端。本發明提供構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法中，步驟2)的具體方法是預蛹期取金紋細蛾中腸，提取中腸總RNA ；以mRNA為底物，合成cDNA —鏈；以cDNA —鏈為模板，用PCR技術擴增金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)；用帶有Bio I和HindIII酶切位點的引物擴增金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)全長。本發明提供構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法中，根據相對保守的氨基酸序列設計兼并引物克隆保守區之間的片段；依據得到的保守序列設計多條3’和5’RACE引物， 利用3’和5’ RACE方法分別克隆出基因的3’端和5’端。步驟2的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)SEQID NO 1的克隆分為保守域、3’端和5’端三個部分分別先后克隆，保守域擴增使用的兼并引物為SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3，3，端克隆使用的反轉錄引物為SEQ ID NO :4，3，端克隆使用的PCR擴增引物為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，5，端克隆使用的反轉錄引物為SEQ ID NO :7，5’端克隆使用的PCR擴增引物為SEQ ID NO 8禾P SEQ ID NO :9。本發明提供構建重組質粒載體pRSET-LrCHI的方法中，步驟3采用Bio I.Hindlll 對質粒和PCR產物片段進行雙酶切。本發明通過下述步驟構建并表達重組質粒pRSET-LrCHI (1)、金紋細蛾的飼養；(2)、預蛹期取金紋細蛾中腸，提取中腸總RNA ；(3)、以mRNA為底物，合成cDNA —鏈；(4)、以cDNA —鏈為模板，用PCR技術擴增金紋細蛾幾丁質酶基因；(5)、用帶有Β ο I和HindIII酶切位點的引物擴增LrCHI全長；(6)、用Xho I和HindIII雙酶切質粒pRSET和LrCHI全長，連接兩個酶切片段；(7)、對重組質粒進行酶切、PCR、測序鑒定；(8)、原核表達 pRSET-LrCHI。本發明提供的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)可應用于降解幾丁質來完成昆蟲消化、變態、侵染生理功能中。本發明提供的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)可應用于抑制真菌。本發明提供的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)可應用于抑制青霉菌。本發明構建的重組質粒pRSET-LrCHI可成功表達，并應用于降解幾丁質來完成昆蟲消化、變態、侵染生理功能中。本發明構建的重組質粒pRSET-LrCHI可應用于抑制真菌。本發明構建的重組質粒pRSET-LrCHI可應用于抑制青霉菌。本發明所述重組質粒pRSET-LrCHI主要應用于真菌的抑制，pRSET-LrCHI在大腸桿菌中表達出幾丁質酶后，將其進行青霉菌生長抑制實驗，研究抑菌效果。為實現上述目的，本發明采用下述技術方案1、轉化大腸桿菌B21。2、IPTG 誘導下表達 LrCHI。3、檢測蛋白粗提液對青霉菌的抑制效果。
圖1為重組質粒pRSET-LrCHI圖譜圖2為預蛹期金紋細蛾幼蟲蟲態圖3為PCR產物瓊脂糖凝膠電泳4為酶切檢測瓊脂糖凝膠電泳5IPTG誘導pRSET-LrCHI的表達結果圖6表達產物對青霉菌的生長抑制效果圖
具體實施例方式以下內容為本發明的進一步說明，不應理解為對本發明的限制。在沒有違背本發明所涉及的技術方法實質下，對本發明中的方法、條件和步驟進行簡單的改動均屬于本發明要求保護的范圍。本發明通過提取預蛹期金紋細蛾中腸的總RNA，以反轉錄后的cDNA為模板克隆 LrCHI基因的全長。通過雙酶切和末端連接重組到質粒片段pRSET上，構建含LrCHI的原核表達載體。實施案例中所采用的生化酶、分子純化試劑盒、受體菌DH5a、質粒pRSET以及相關的生化試劑均為市場購買，所涉及到的PCR擴增、反轉錄、酶切、連接、轉化等有關實驗操作技術參照王欣的《基因分子生物學實驗指導》。實施例1金紋細蛾幼蟲的飼養為給基因克隆提供最佳的實驗蟲體材料，本發明對金紋細蛾的蟲卵進行人工飼養。1)飼料配方玉米面300g豆餅粉IOOg酵母粉IOOg維生素CIOg復合維生素B1.5g山梨酸1.5g檸檬酸2.5g丙酸5ml瓊脂25g水1300ml具體配置過程為①將玉米面、豆餅粉、酵母粉、瓊脂和蒸餾水混勻，121°C高壓滅菌20min左右。②將維生素C，復合維生素B，山梨酸，檸檬酸，紅霉素，丙酸混合后加到滅菌后的培養基中。③將混勻的液體培養基倒在瓷盤中(基本鋪滿就可)，冷卻凝固后就可以使用了。2)飼養條件將金紋細蛾蟲卵在下孵育兩天，幼蟲孵出后用毛筆刷入準備好的盤子中，并在盤子中放入配制的飼料。用保鮮膜將盤口封住，并用針頭在上面扎些小孔。將其放入生化培養箱中恒溫培養，每天光照12小時。3)預蛹期蟲體形態經過幾天的培養蟲體開始由透明色變成黑色，大部分蟲體長度約2厘米，6天后大多蟲體體態明顯增大，背部開始長出黑色斑紋，腹部還為青色并可明顯看出其觸角，蟲子進食的速度比較快，為防止成蟲互相撕咬，將其轉入飼養盒中分開飼養。10天左右大部分蟲子進入預蛹期，預蛹期的表現為行動遲緩、基本不動、腹部易往上翻，朝天，從尾部開始化蛹、 足部開始收縮，顏色由青色一環環從尾部開始發紅，腹部發胖、膚色光澤呈油亮狀。預蛹期金紋細蛾幼蟲蟲態見圖2，將進入預蛹期的成蟲提中腸取RNA，其余繼續飼養。實施例2總RNA的提取1)取中腸昆蟲幾丁質酶基因的表達具有時空和組織特異性，研究表明預蛹期的中腸是該基因表達量的最適組織。中腸是消化道的中段，一般呈管狀，前端連接前胃，后端以馬氏管著生處與后腸分界。將饑餓處理四個小時的蟲子進行解剖，因為大腸、中場、小腸過度不明顯， 為防止丟失，故整條腸子均提取，然后再使用顯微鏡確定中腸部位，然后開始解剖提取，將提取好的中腸暫泡至生理鹽水中。2)抽提 RNA由于RNA酶是無處不在的，因此在提取過程中要格外注意防止RNA酶的污染，實驗用品的預處理特別重要。具體RNA提取步驟1用0. 1 %的DEPC水對實驗材料進行預處理。2取提取好的新鮮組織在液氮中放入玻璃研磨器中研磨成勻漿。3將研磨好的新鮮組織分別加入1. 5ml離心管中，再各加入ImlTrizoI試劑，用力震蕩10秒，室溫靜置5分鐘。4往離心管中分別加入0.2ml氯仿，震蕩15秒，靜置2分鐘。溶液產生分層，分三層，上層透明，中層有少量乳白色沉淀，下層為紅色。5將離心管放入離心機中，在4°C，12000rpm條件下離心20分鐘。6取上清液加入另外的EP管中，再分別加入0. 5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻， 室溫靜置10分鐘。7 40C，12000rpm條件下離心20分鐘，棄上清液。8加入Iml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4°C，7500rpm條件下離心5分鐘，棄上清。9往沉淀中加入50 μ 1 DEPC滅菌水，用槍頭吸打混勻。65°C水浴加熱10分鐘。10保存于液氮中。實施例3 cDNA 一鏈合成以提取的RNA為模板，用Oligo dT為引物合成cDNA —鏈。20ul的反轉錄體系
Oligo dTΙμΙRNA2μΙH2O6μΙ2xTs bufferΙΟμΙEnzyme MixΙμΙ反應條件為42°C孵育45min后85 °C使蛋白質變性5min。實施例4幾丁質酶基因的克隆及結構分析目前克隆一個未知基因的方法有很多，諸如RNA指紋技術、cDNA文庫刪選、cDNA末端快速擴張技術(RACE)等，本發明采用的是RACE來克隆LrCHI，RACE技術主要由以下幾步組成RNA的提取和反轉錄合成cDNA ；根據相對保守的氨基酸序列設計兼并引物克隆保守區之間的片段；依據得到的保守序列設計多條3’和5’ RACE引物，利用3’和5’ RACE方法分別克隆出基因的3’端和5’端。1)保守域的擴增通過對已發表公布的幾十種昆蟲幾丁質酶氨基酸序列進行同源性分析，結果表明在其序列內部存在兩段高度保守的序列，YDFDGLDLDffEYP和GAMTWAIDMD，依此設計兼并引物 5，-GGMTGGGARCTGACTGCTGC-3，(SEQ ID NO 2)和 5，-CCTTGTARGCGTAGGGGCAYTTGCC-3，( SEQ ID NO 3)，并以反轉錄而成的cDNA為底物PCR擴增金紋細蛾幾丁質酶的保守域，電泳結果如圖3的1泳道所示，得到了大約450bp的片段。2)3，端擴增根據真核生物mRNA所特有的poly(A)結構，設計含一段已知序列的接頭引物5’_TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC (T) 18-3‘ (SEQ ID NO 4)作為反轉錄引物，再根據已獲得的保守域序列設計3’race的上游引物CCACGTACCTGATCTTTGCCAGGAGC (SEQ ID NO :5)，利用下游接頭引物 5，-TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC-3，(SEQ ID NO :6) PCR 擴增幾丁質酶基因的 3 端。 擴增結果見圖3的2泳道。3)5，端擴增因為已經得到了 LrCHI的3’端序列，可依此設計特異引物 5，-TCCTTGATCCAGTTCATCTTG (SEQ ID NO :7)ATCT_3，作為 5，端擴增的反轉錄引物，不難發現該引物的A/T含量較高，使得其在反轉錄的溫度條件下易于與模板結合。由于真核生物 mRNA的5’端沒有寡聚尾，因此5’ race的擴增需要在其cDNA的3’端人為地加上一段同聚核苷酸尾，在此基礎上進行擴增其5’端擴增。本發明實施過程中是對純化后金紋細蛾的 cDNA進行同聚胞嘧啶加尾，再以上游接頭引物5，-TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC (G) 10-3，(SE Q ID NO 8)和下游依據保守序列設計的特異引物5’-GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’ (SEQ ID NO 9)進行PCR擴增，得到金紋細蛾幾丁質酶基因的5’端。擴增結果見圖3的3泳道。4)結構分析對實施例4中的基因序列拼接后獲得SEQ ID NO 1 (LrCHI)的序列全長，由1737bp 組成，編碼578個氨基酸，預測其蛋白質的分子量和等電點分別為64. 2kDa、5. 42。利用NCBI 中的blast程序對本發明中發現的LrCHI進行同源相似性分析，結果顯示其核酸序列與其他昆蟲幾丁質酶的同源性較高(均在75%以上)，與棉鈴蟲幾丁質酶基因的同源性更是高達98 %，這說明本發明的確是克隆得到了一種新的昆蟲幾丁質酶序列。 實施例5重組質粒pRSET-LrCHI的構建1、PCR擴展全長以cDNA為底物，用帶有酶切位點)(ho KHindIII的引物擴增LrCHI全長。PCR條件為
95 "C3min95 "C30s η55 "C40s72 "C2mirJ72 "CIOmn2、雙酶切、連接及轉化用購買于生工生物工程有限公司的Sanpr印質粒小量抽提試劑盒提取質粒 pRSET，具體操作步驟參見其生產說明書。用限制性內切酶)(ho I,HindIII酶切質粒pRSET 及PCR擴增產物LrCHI全長，酶切條件為25°C水浴30min。用DNA純化試劑盒對酶切產物進行純化，具體步驟參見Omega公司Microelute cycle-pure kit試劑盒說明書。將酶切、純化后的質粒和PCR片段用T4連接酶進行連接，連接體系為20ul 質粒片段 Iul，PCR 產物片段;3ul，buffer 2ul，T4 連接酶 lul，dH20 13ul。22°C連接 1 小時。取5ul的連接體系，加到50ul的感受態T細胞中，42°C熱激30s后立即冰浴aiiin， 加入LB營養液后37°C、200rpm孵育一小時。取200ul的菌液均勻地途到含X_gal、IPTG、 Ampr的固體培養基上，培養過夜。挑取白色重組子進行鑒定。
3、陽性重組子的鑒定對重組質粒進行Β ο I、HindIII雙酶切鑒定，結果見圖4對重組質粒進行PCR鑒定，結果見圖3的4泳道將重組質粒送到生工生物工程有限公司北京測序部進行測序，以確保LrCHI以正確、完整的序列方向插入到PRSET的T7啟動子下面。實施例6重組質粒PRSET-LrCHI在BL21中的表達1、pRSET-LrCHI 轉化 BL21從_70°C中取出50ulBL21感受態(BL21感受態的制備參見經典分子生物學操作)，將5ul的重組質粒pRSET-LrCHI加入，輕彈混勻，冰浴25min，42°C熱激30s，立即置于冰上2min，加250 μ L平衡至室溫的LB液體培養基，200轉/min，37°C孵育1小時，取IOOul 菌液均勻地涂于含50ug/ulAmp的平板上，37°C正放30min后倒置過夜培養。2、IPTG 誘導下表達 LrCHI在上述步驟下挑取單菌落至LB中，200轉/min 37 °C下孵育至0D600 = 0. 4-0. 6。 取Iml的菌液作為空白對照保存于-20°C，往剩余的菌液中加入終濃度為ImM的IPTG，誘導表達4小時。將對照組和經IPTG誘導后的菌液在4000rpm下離心5min，棄掉上清，在菌體沉淀中加入IOOul的Tris-HCL buffer，使用超聲波破碎儀對菌體進行破碎，13000rpm/min 離心lOmin，分離上清和沉淀，在沉淀中加入500ul的尿素使其溶解。分別取25ul上清和尿素溶解的沉淀與5ul的6X SDS混合，沸水浴變性lOmin，瞬間離心，取15ul的樣品進行 SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結果見圖5，從圖中可看出大腸桿菌表達了大約65kDa的目的蛋白。實施例7抑菌效果的檢測取三個8 X 6 X IOmm的空心圓柱體，輕輕固定到固體培養基上，往三個圓柱體中分別加入IOOul無菌水、IOOul含LrCHI原核表達的上清液、IOOul的大腸桿菌破碎液，最后再往圓柱體中分別加入IOOul的青霉菌(0D = 0. 3)，37°C恒溫培養20小時。實驗結果顯示青霉菌在含LrCHI原核表達的上清液中的生長菌圈的直徑約為0. 8cm，而在菌液中只加入無菌水對照組的菌圈直徑達1. 5cm，加入大腸桿菌破碎液對照組的菌圈直徑也約為1. 5cm，青霉菌在含LrCHI原核表達的上清液中的生長相對于其他兩種環境明顯受到抑制，這一結果表明大腸桿菌的破碎液對青霉菌的生長沒有顯著的影響，而原核表達的LrCHI則可以抑制青霉菌的生長，原因可能是LrCHI催化水解了青霉菌細胞壁上的幾丁質，破壞了其正常的生理結構，結果見圖6。
權利要求
1.一種金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)，其序列是SEQ ID NO :1。
2.如權利要求1所述的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)，其特征是金紋細蛾幾丁質酶基因全長由1737bp組成，編碼578個氨基酸。
3.一種金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)的重組質粒載體pRSET-LrCHI，其特征是包含 pRSET載體片段和SEQ ID NO :1。
4.如權利要求3所述的重組質粒載體pRSET-LrCHI，其特征是外源基因金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)插入到載體pRSET的多克隆位點后，置于其T7啟動子下。
5.如權利要求4所述的重組原核表達質粒載體pRSET-LrCHI，其特征是重組質粒含氨芐青霉素抗性基因和6XHis蛋白標簽序列。
6.一種構建權利要求3重組質粒載體pRSET-的LrCHI方法，包含以下步驟(1)、取預蛹期金紋細蛾中腸，提取中腸總RNA ；O)、金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)SEQ ID NO=I的克隆；(3)、將質粒載體pRSET與步驟2獲得的含SEQ ID NO=I的PCR產物酶切后連接。
7.權利要求1或2所述的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)在降解幾丁質來完成其消化、變態、侵染生理功能中的應用。
8.權利要求1或2所述的金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)在抑制真菌中的應用。
9.權利要求3-5任一項所述的重組質粒pRSET-LrCHI在降解幾丁質來完成其消化、變態、侵染生理功能中的應用。
10.權利要求3-5任一項所述的重組質粒PRSET-LrCHI在抑制真菌中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種新的金紋細蛾幾丁質酶基因LrCHI，涉及昆蟲幾丁質酶基因的重組質粒載體及其構建和應用。金紋細蛾幾丁質酶基因(LrCHI)可以抑制真菌，pRSET-LrCHI可以降解幾丁質來完成其消化、變態、侵染等生理功能。
文檔編號C12N15/66GK102517308SQ20111046006
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者仙笑笑, 宋志芳, 李瑤, 范曉軍, 趙秋勇 申請人:太原理工大學