專利名稱：無網格bac文庫的建立方法及該無網格bac文庫陽性克隆的篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種簡便基因文庫的建立與篩選。
背景技術：
BAC(細菌人造染色體)克隆對于整個分子生物學的發展，特別是現代基因組學的發展作出了巨大的貢獻。雖然，現在高通量測序技術降低了 BAC文庫的利用率，但是BAC克隆對于基因克隆及基因資源的保存有著重要的作用。制取BAC克隆，一般放入96孔板或 384孔聚乙烯樣品板中，但是所要的超低溫(_80°C )儲藏空間巨大；而且，利用BAC克隆篩選還要制作有關的三維篩選體系或轉移至纖維素或尼龍雜交膜中，需一系列的篩選過程來獲得陽性克隆。無網格(混合克隆品)基因文庫已經展現出所需勞動力少，貯存所需的空間小，但從陽性克隆混合體中獲取其所需個體較為復雜。雖然已有人進行過BAC文庫的篩選，但是程序復雜，且操作規程不明確。目前的常規方法是將混合樣品涂布平板后，待菌落生長后，轉移到纖維素膜上，進行有關雜交，來鑒定相應的陽性克隆。由于DNA雜交技術程序復雜，花費時長，還存在假陽性等問題，特別是難以獲得單個陽性克隆。
發明內容
本發明的是為了解決現有無網格BAC文庫陽性克隆技術中DNA雜交技術程序復雜，花費時長，存在假陽性，而且難以獲得單個陽性克隆的問題，而提供的一種無網格BAC 文庫的建立方法及該無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法。本發明無網格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養皿，用LB液體培養基或SOB液體培養基進行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網格BAC文庫管，即實現無網格BAC文庫的建立。按以下步驟篩選上述無網格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進行PCR，取陽性 pool所對應的無網格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養；三、將步驟二振蕩培養的菌液取出一部分進行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進行PCR，選取滴度最大的菌液進行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96孔板或384孔板中振蕩培養，取少量振蕩培養物再次進行PCR反應，將陽性克隆pool 進行再次涂板，選取單個克隆進行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本發明無網格BAC文庫的建立方法簡單易行，具有用時短，所需超低溫儲藏空間小的優點。本發明無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法巧妙地利用PCR體系，快速簡易地獲得陽性克隆，并且有效的排除了假陽性克隆的干擾。
圖1是具體實施方式
六步驟四中PCR的部分凝膠電泳圖，其中第1泳道和第18泳道標樣為DNA對照樣品，其余泳道標樣為DNA提取篩選管樣品。圖2是具體實施方式
六步驟六中單個陽性克隆驗證結果圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式無網格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養皿，用LB液體培養基或SOB液體培養基進行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網格BAC文庫管，即實現無網格BAC文庫的建立。本實施方式BAC克隆的懸浮液中的LB液體培養基或SOB液體培養基(含10%的甘油)可作為冷凍用媒介，將BAC克隆的懸浮液置于_80°C環境中儲藏。BAC克隆載體的制備及大片段DNA的制備采用現有常規方法。本實施方式含有陽性克隆1000 3000個的培養皿數量為50 100皿。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中大片段 DNA片段的平均長度> 70Kb。其它步驟及參數與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式按以下步驟篩選無網格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進行PCR，取陽性 pool所對應的無網格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養；三、將步驟二振蕩培養的菌液取出一部分進行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進行PCR，選取滴度最大的菌液進行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96孔板或384孔板中振蕩培養，取少量振蕩培養物再次進行PCR反應，將陽性克隆pool 進行再次涂板，選取單個克隆進行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本實施方式步驟三有效的提高了陽性克隆占總克隆的比率，從理論角度分析將陽性克隆占總克隆的比率提升至最高。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟二中振蕩培養時間為10 12小時。其它步驟及參數與實施方式三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
三或四的不同點是步驟二中置于轉速為200r/min、溫度為37度環境中振蕩培養。其它步驟及參數與實施方式三或四相同。
具體實施方式
六本實施方式用來篩選無網格大豆基因組BAC基因文庫以獲得陽性克隆一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備，片段DNA片段的長度為75Kb ；三、連接及轉化，然后選擇含BAC克隆2000 3000個的培養皿(其中白色的陽性克隆占總克隆的95%以上)，用5mL LB液體培養基進行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網格BAC文庫管；四、用待篩選序列的特異性引物 Sat_312 (GCGCCTCCCATTACTTCGGATTAGTTA/ GCGAACGCAACAAATAATCAAACATC)對大豆BAC文庫中的DNA提取篩選管進行PCR，取陽性 pool (圖1中的第3、9、10、15、16和17泳道為陽性pool)所對應的無網格BAC文庫管(本實施方式選取第9泳道所對應的無網格BAC文庫管)，并吸取200 μ L菌液，進行梯度稀釋；五、將步驟四制備的梯度稀釋液振蕩培養；六、將步驟五振蕩培養的菌液取出一部分進行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體進行PCR，選取滴度最大的原始菌液進行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取約10個左右克隆放入96孔板中振蕩培養，取少量振蕩培養物再次進行PCR反應，將陽性克隆pool進行再次涂板，選取單個克隆進行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本實施方式所獲得的單個陽性克隆如圖2中箭頭所示。
權利要求
1.無網格BAC文庫的建立方法，其特征在于無網格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養皿，用LB液體培養基或 SOB液體培養基進行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為 DNA提取篩選管，另一組管為無網格BAC文庫管，即實現無網格BAC文庫的建立。
2.根據權利要求1所述的無網格BAC文庫的建立方法，其特征在于步驟二中大片段 DNA片段的平均長度彡70Kb。
3.如權利要求1所述無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于按以下步驟篩選無網格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進行PCR，取陽性pool 所對應的無網格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養；三、將步驟二振蕩培養的菌液取出一部分進行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進行PCR，選取滴度最大的菌液進行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96 孔板或384孔板中振蕩培養，取少量振蕩培養物再次進行PCR反應，將陽性克隆pool進行再次涂板，選取單個克隆進行驗證，即可獲得單個陽性克隆。
4.根據權利要求3所述的無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于步驟二中振蕩培養時間為10 12小時。
5.根據權利要求4所述的無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于步驟二中置于轉速為200r/min、溫度為37度環境中振蕩培養。
全文摘要
無網格BAC文庫的建立方法及該無網格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，它涉及一種簡便基因文庫的建立與篩選。它解決現有無網格BAC文庫陽性克隆技術中DNA雜交技術程序復雜，花費時長，存在假陽性，而且難以獲得單個陽性克隆的問題。文庫建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉化。陽性克隆篩選一、PCR取陽性pool進行梯度稀釋；二、振蕩培養；三、用菌體離心PCR，選取滴度最大的菌液進行涂板，然后挑取8～15個克隆振蕩培養，進行PCR反應，將陽性克隆pool進行再次涂板，選取單個克隆進行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本發明用于BAC文庫的建立和陽性克隆的篩選。
文檔編號C12N15/10GK102560689SQ20111045995
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者吳紅艷, 夏正俊, 翟紅 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所