專利名稱：一種提高粘紅酵母生物量的培養基及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物發酵領域，具體地，涉及一種提高粘紅酵母生物量的培養基及其應用。
背景技術：
粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)是產油微生物種類之一，其含油量25 % 40%以上。近年來，全球面臨應對氣候變化、能源危機的挑戰，生物燃料包括微生物油脂成為研究熱點之一，對于粘紅酵母的研究也倍受關注。粘紅酵母產油量的多少取決于兩個方面，一是粘紅酵母的含油量，二是其生物量。生物量的提高是粘紅酵母在發酵過程中細胞快速增殖的結果，說明培養基更適合其生長。粘紅酵母在實際應用中，如生產油脂或提取生理活性物質，只有高的生物量才有提取應用的物質基礎，如何提高粘紅酵母的生物量是研究者和產業界追求的熱點。因此，研究提高粘紅酵母生物量的方法對研究其生物學特性和生產應用均具有重要的價值。粘紅酵母傳統培養方法是應用葡萄糖培養基和麥芽汁培養基。葡萄糖培養基配制比較復雜，需要有機物和無機物十余種，而麥芽汁培養基配制簡單，即將麥芽浸粉水溶，離心后的上清液就是粘紅酵母培養基。以往將其離心沉淀部分廢棄，這不僅浪費了資源而且也增加了培養成本。這兩者培養基的共同特點是細胞增殖速率較慢，難以適應粘紅酵母的工業化生產，因此，研究一種提高粘紅酵母生物量的方法勢在必行，具有重要的實際意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種提高粘紅酵母生物量的培養基及其制備方法和應用；本發明的另一個目的在于提供一種提高粘紅酵母生物量的方法。粘紅酵母細胞圓形、卵形或長形。多邊芽殖，有明顯的紅色或黃色色素，很多種因生莢膜而形成粘質狀菌落。在麥芽汁斜面上培養一個月以上，菌苔顏色呈現珊瑚紅到橙紅或微帶橘紅色。常因由莢膜而形成粘質狀菌落，產胡蘿卜素和L-苯丙氨酸。空氣、水、 花、土壤、鱒魚腸道、泡菜水等處均可分離到粘紅酵母。本發明使用的粘紅酵母菌種購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為 CGMCC 2.704。本發明提供的粘紅酵母培養基，通過以下步驟制備(1)將麥芽浸粉溶于蒸餾水中，離心，取上清液進行高壓滅菌；(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過程中形成的沉淀物合并，用蒸流水攪拌或超聲波處理，再離心，取上清液與步驟(1)的上清液合并，調節溶液PH值5. 0-5. 5，經高壓再次滅菌，得到粘紅酵母培養基。具體地，所述步驟(1)麥芽浸粉與蒸餾水的質量體積比為100g/L。所述步驟(1)離心條件為3000 6000r/min離心15 20min。
所述步驟( 對合并的沉淀物用2-5倍體積量的蒸流水800 2600r/min攪拌 20min 60min 或 400 900W 超聲波處理 15_20min，3000 6000r/min 離心 15 20min
后的上清液與步驟(1)的上清液合并，得到粘紅酵母培養基。所述步驟( 對合并的沉淀物用4倍體積量的蒸流水1500r/min攪拌30min或 800W超聲波處理15min，4000r/min離心20min后的上清液與步驟(1)的上清液合并，調節溶液PH值5. 3，得到粘紅酵母培養基。在本發明的一個實施例中所用的超聲波細胞粉碎儀額定頻率為18 22KHz，本領域技術人員可以通過調節超聲波儀的功率來控制超聲處理的強度。本發明提供了一種提高粘紅酵母生物量的方法，是將粘紅酵母接種于本發明的粘紅酵母培養基上，置于搖床中進行培養。本發明提供的粘紅酵母培養基IL中接種濃度為50X IO6 80 X IO6個/ml的粘紅酵母50ml。本發明提供的粘紅酵母培養基IL中接種濃度為70X 106個/ml的粘紅酵母50ml。具體地，培養溫度為25 33°C ；搖床轉速為120 160r/min ；培養時間為96 192h。優選地，培養溫度為30°C。優選地，搖床轉速為140r/min。優選地，培養時間為144h。本發明提供了上述培養基在提高粘紅酵母生物量中的應用。本發明提供了上述發酵方法在提高粘紅酵母生物量中的應用。本發明還提供了上述培養基和培養方法在生物發酵中的應用。本發明是將傳統的麥芽汁培養基配制過程中，廢棄沉淀的部分經過高速攪拌和超聲波處理使其進一步的溶解。高速攪拌和超聲波處理是廣泛應用在化學等相關領域常用的方法，本發明的本質就是用最普通的方法處理傳統麥芽汁配制過程中廢棄的部分，使其培養基的營養組份更加全面，使原本沒有外力難以溶解的物質從而溶解出來，部分大分子轉化成小分子物質，更利于粘紅酵母的吸收和利用，獲得了粘紅酵母生長因子，從而達到了大幅度提高了其生物量的效果。本發明提供的粘紅酵母培養基和發酵方法能夠大幅度降低粘紅酵母規模化培養的成本，又能獲得大量的粘紅酵母生物量，利用本發明方法培養粘紅酵母的生物量比用傳統法方法培養的生物量增加70% 100%以上。
圖1為不同培養基對粘紅酵母生物量的影響圖，其中橫坐標1為麥芽汁培養基，2 為葡萄糖培養基，3為實施例1制得的培養基，4為實施例2制得的培養基，5為實施例3制得的培養基，縱坐標代表培養基發酵粘紅酵母結束后測得的粘紅酵母生物量。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1粘紅酵母培養基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中，4000r/min離心15min，濾紙過濾，將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌15min ；(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過程中形成的沉淀物合并，用4倍體積量的蒸流水進行高速2600r/min攪拌30min，離心4000r/min 20min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并，調節溶液pH值5. 0，然后經1 X IO5Pa高壓再次滅菌15min，得到粘紅酵母培養基。實施例2粘紅酵母培養基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中，3000r/min離心15min，濾紙過濾，將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌30min ；(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過程中形成的沉淀物合并，用2倍體積量的蒸流水超聲波800W處理15min，3000r/min離心15min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并，調節溶液PH值5. 5，然后經IX 105 高壓再次滅菌30min，得到粘紅酵母培養基。實施例3粘紅酵母培養基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中，6000r/min離心15min，濾紙過濾，將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌20min ；(2)將步驟1)中的離心沉淀物和滅菌過程中形成的沉淀物合并，用5倍體積量的蒸流水進行高速800r/min攪拌60min，6000r/min離心15min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并，調節溶液pH值5. 3，然后經1 X IO5Pa高壓再次滅菌20min，得到粘紅酵母培養基。實施例4粘紅酵母菌種的發酵培養1、從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買的粘紅酵母菌種(編號 CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態，在實驗之前需要恢復菌種活性。在超凈工作臺中，用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，將安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端，加入0.3mL 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. ImL菌體懸浮液加至斜面培養基中，33°C恒溫培養40h。2、粘紅酵母菌種擴大培養在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實施例1制得的培養基，用接種針接種一環已恢復活性的粘紅酵母，約(1 X IO8 2 X IO8個/ml)個粘紅酵母菌，在溫度25°C，120r/min 條件下振蕩培養Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養方法取擴大培養的粘紅酵母50X IO6個/ml，約為IOmL分別加入到實施例1制得的 200mL培養基中，在溫度25°C、pH值5. 0的培養基，在160r/min的搖床轉速條件下培養 192h。實施例5粘紅酵母菌種的發酵培養1、從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買的粘紅酵母菌種(編號 CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態，在實驗之前需要恢復菌種活性。在超凈工作臺中，用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，將安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端，加入0.5mL 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. 2mL菌體懸浮液加至斜面培養基中，30°C恒溫培養48h。2、粘紅酵母菌種擴大培養在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實施例2制得的培養基，用接種針接種一環已恢復活性的粘紅酵母，約(1 X IO8 2 X IO8個/ml)個粘紅酵母菌，在溫度30°C，140r/min 條件下振蕩培養Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養方法取擴大培養的粘紅酵母70X IO6個/ml，約為IOmL分別加入到實施例2制得的 200mL培養基中，在溫度30°C、pH值5. 0的培養基，在140r/min的搖床轉速條件下培養 144h。實施例6粘紅酵母菌種的發酵培養1、從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買的粘紅酵母菌種(編號 CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態，在實驗之前需要恢復菌種活性。在超凈工作臺中，用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，將安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端，加入0.4mL 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. 2mL菌體懸浮液加至斜面培養基中，30°C恒溫培養48h。2、粘紅酵母菌種擴大培養在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實施例3制得的培養基，用接種針接種一環已恢復活性的粘紅酵母，約(1 X IO8 2 X IO8個/ml)個粘紅酵母菌，在溫度，160r/min 條件下振蕩培養Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養方法取擴大培養的粘紅酵母80X IO6個/ml，約為IOmL分別加入到實施例3制得的 200mL培養基中，在溫度33 °C、pH值5. 0的培養基，在120r/min的搖床轉速條件下培養96h。實施例7粘紅酵母生物量測定對實施例4-6中分別采用實施例1-3制得的培養基進行發酵獲得的粘紅酵母進行生物量測定。取實施例4-6發酵結束后的粘紅酵母菌液40mL，在4000r/min的條件下離心lOmin，除去上清液，將沉淀物在80°C的溫度下真空干燥至恒重，在干燥器中冷卻至室溫后稱重。即得單位體積菌液干物質的重量為粘紅酵母的生物量。按著該生物量測定方法，測定結果見圖1，結果發現用實施例2制得的培養基比麥芽汁培養基的生物量增加約為100. 08%、實施例1、3制得的培養基比麥芽汁培養基的生物量增加約為83. 33%和 71. 43%，也比葡萄糖培養基發酵粘紅酵母的生物量增加明顯。選用本發明實施例1、實施例2、實施例3制得的培養基進行相同的粘紅酵母培養實驗，結果說明使用本發明提供的的粘紅酵母培養基進行粘紅酵母的發酵培養，能夠有效提高粘紅酵母的生物量。
權利要求
1.一種提高粘紅酵母生物量的培養基，通過以下步驟制備1)將麥芽浸粉溶于蒸餾水中，離心，取上清液進行高壓滅菌；2)將步驟1)中的離心沉淀物和滅菌過程中形成的沉淀物合并，用蒸流水攪拌或超聲波處理，再離心，取上清液與步驟1)的上清液合并，調節溶液PH值5. 0-5. 5，經高壓再次滅菌，得到粘紅酵母培養基。
2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述步驟1)麥芽浸粉與蒸餾水的質量體積比為100g/L。
3.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述步驟1)離心條件為3000 6000r/ min 離心 15 30min。
4.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述步驟2)對合并的沉淀物用2-5倍體積量的蒸流水800 ^00r/min攪拌20min 60min或400 900W超聲波處理15_20min， 3000 6000r/min離心15 20min后的上清液與步驟1)的上清液合并，得到粘紅酵母培養基。
5.如權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述步驟2)對合并的沉淀物用4倍體積量的蒸流水1500r/min攪拌30min或800W超聲波處理15min，4000r/min離心20min后的上清液與步驟1)的上清液合并，調節溶液PH值5. 3，得到粘紅酵母培養基。
6.一種提高粘紅酵母生物量的方法，其特征在于，在權利要求1-5任一所述的粘紅酵母培養基上接種粘紅酵母，置于搖床中進行培養。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，IL權利要求1-5任一所述的培養基中接種濃度為50 X IO6 80 X IO6個/ml的粘紅酵母50ml。
8.如權利要求6所述的方法，其培養條件為溫度為25 33°C，搖床轉速為120 160r/min，培養時間為96 192h。
9.如權利要求6-8任一所述的方法，其培養溫度為30°C，搖床轉速為140r/min，培養時間為144h。
10.權利要求1-5任一所述的培養基在提高粘紅酵母生物量中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種提高粘紅酵母生物量的培養基及其發酵粘紅酵母的方法，是將麥芽汁培養基離心后，保留上清液，再將沉淀部分重新溶解，將溶解部分與前一步離心后的上清液合并作為粘紅酵母的培養基，在溫度25-33℃、轉速120-160r/min條件下培養96-192h，發酵粘紅酵母，結果發現粘紅酵母的生物量比傳統方法的生物量增加70％～100％，本發明方法具有很高的應用價值。
文檔編號C12R1/645GK102559521SQ201110459378
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優先權日2011年12月31日
發明者李博生, 王政 申請人:北京林業大學