專利名稱：一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法及其專用轉錄因子串聯結合序列的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中目的蛋白的富集分離方法，特別是涉及一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法及其專用轉錄因子串聯結合序列。
背景技術：
人類基因組中約6%的基因編碼轉錄因子，是人類基因組編碼的第二大類蛋白。轉錄因子不僅在基因表達調控中扮演重要的角色，而且是細胞內信號轉導網絡的關鍵節點， 細胞感受胞內、胞外刺激的各種信號通路通過轉錄因子相互交聯，從而形成一個復雜的信號網絡。因此，對轉錄因子及其復合物的研究一直受到極大的關注。然而，轉錄因子在細胞內的表達豐度極低(僅占細胞總蛋白的0.01-0. 001% )，使得對轉錄因子及其形成的復合物的純化及鑒定非常困難，如通過傳統色譜方法進行轉錄因子的純化通常需要抽提成百升細胞培養物，通過10，000-100，000倍的富集得到的蛋白也僅夠用于化學和功能的分析。采用特異性抗體進行親和純化是分離純化轉錄因子復合物的有效手段，然而，一方面抗體成本太高，另一方面，目前僅少量的轉錄因子及其調節分子存在抗體，這大大限制了抗體親和純化方法的應用。迄今為止，僅有不到5%的轉錄因子得以純化和鑒定，因此，迫切需要發展新的技術方法對轉錄因子及其復合物進行分離純化、鑒定、重構，以及對其各個組分進行功能解析。在基因表達調控過程中，轉錄因子通過與DNA順式元件結合發揮基因表達調控的作用。轉錄因子包括通用轉錄因子(如轉錄因子II (TF II)復合物的各個組分、TATA-結合蛋白等)和特異轉錄因子(如Spl、C/EBP、APl等)。在基因轉錄過程中，特異轉錄因子與啟動子結合，招募通用轉錄因子結合到轉錄起始位點上游或下游40-60bp的DNA序列上， 起始RNA的合成。近年來，越來越多的研究發現，DNA結合元件的結構特點會影響轉錄起始復合物的形成。換言之，當轉錄因子識別特定靶基因時，轉錄因子結合位點的核酸組成會影響輔調節子的招募，從而決定轉錄因子以激活子或抑制子影響靶基因的表達。為此，發展分離鑒定內源轉錄因子及其復合物的方法為解析與DNA結合后的轉錄因子復合物，進而了解特異轉錄因子對靶基因的轉錄調控至關重要。轉錄因子的表達水平往往很低，用傳統方法在蛋白質組水平上分析轉錄因子表達譜通常很困難。分析轉錄因子表達譜或其動態變化時，在樣品制備過程中，需要采用特定的試劑(如抗體)及免疫沉淀策略對轉錄因子進行富集分離，但是由于抗體的成本比較高，同時抗體的種類有限，采用抗體進行免疫沉淀來富集分離轉錄因子的應用受到很大的限制， 而且這種策略也僅能對個別轉錄因子進行分析，難以實現對所有轉錄因子的大規模富集分離和鑒定。
發明內容
本發明提供了一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法及其專用轉錄因子串聯結合序列。本發明所提供的轉錄因子串聯結合序列(concatenated transcription factorresponse elements，catTFRE)，是由 3_5bp 的接頭序列(Linker)串聯的轉錄因子 API、AR、BRCAl、CEBPA、CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRU ETSU EffSRl-FLIU FEV、FOXAl、 FOXCU FOXDU F0XF2、FOXIU FOXLU F0X03、Fra-U GATA2、GATA3、GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、MIZF, MYC: :MAX、Myf、 MZF11-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLH1、NKX3-1、 NR1H2::RXRA,NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、PPARG, PR、PXR-I:RXR-alpha、 RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA> REST、RFX1、RFX2、RFX3、 RFX5:RFXAP:RFXANK、R0RA_1、R0RA_2、RREBU RXR: :RAR DR5、RXRA: :VDR、S0X10、S0X9、 SPl、SPI1、SPIB、SRF, SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: :TCF3、TBP, TEADl、TFAP2A、 TLX1: :NFIC、TP53、USFU WTl_del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI_del2、WTlI-KTS, XBP-U YYl 和 ZNF3M⑶NA結合元件中的一個或多個后得到的DNA序列。具體來講，所述轉錄因子串聯結合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中的序列1由觀00個堿基組成，該序列包含上述100個轉錄因子的雙拷貝核心結合元件，每個轉錄因子的雙拷貝核心結合元件間隔3個堿基對(3個堿基對的核苷酸序列是任意的)。本發明的第二個目的是提供一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法。本發明所提供的富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法，包括以下步驟1)將上述轉錄因子串聯結合序列連接入目標載體的多克隆位點中，得到攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體；2)設計并合成一對生物素標記的引物，其正、反向引物可分別與目標載體多克隆位點上游及下游200bp處退火，以步驟1)中攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體為模板，在所述引物對的引導下進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的擴增片段，得到高純度生物素標記的DNA誘餌；3)將步驟2)獲得的高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上；4)內源轉錄因子的分離純化提取細胞核蛋白，將步驟3)獲得的固定有DNA誘餌的磁珠與細胞核蛋白進行孵育，洗滌，細胞核蛋白中的內源轉錄因子及其復合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上；在上述富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法中，所述步驟1)中的目標載體可為 pUC57、pET24a+、pGEX4T_2、pGEX4T_l、pCMV-Myc、pGH 或 pcDNA-Myc 等。步驟2)中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述100μ 1 PCR反應體系為10XExTaq Buffer 10μ 1, dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1，pUC57_sdTF 1 μ 1 (50ng)，上、下游引物各 1 μ 1 (Inmol)，ExTaq 0. 5 μ 1，H2O 87. 5μ 1 ；PCR 反應條件為先 94°C 2min，然后 94°C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 2min, 共；35 個循環，再 72°C 7min,最后 4°C 30min。步驟3)中將高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上的方法為
(1)取120 μ 1磁珠到一干凈的EP管內，置于磁力架上吸附磁珠，然后移走上清，用 500 μ 1 IXDNA Binding Buffer 洗滌磁珠；(2)加入 15 pmol(278y g)biotin-sdTF DNA，用 5XDNA Binding Buffer 將結合體系調節到 IXDNA Binding Buffer ；(3) 4°C搖動孵育20分鐘；(4)用BC150洗滌兩次，吸走所有上清。所述步驟4)中細胞核蛋白的提取采用Doimce勻漿的方法，先用低鹽溶液破細胞膜，離心分離得到的細胞核經doimce勻漿及高鹽溶液溶解，高速離心分離出核蛋白，經 BC150透析恢復內源蛋白及其復合物的天然屬性。具體操作為1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用IXPBS重懸細胞沉淀，再次1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用10倍沉淀體積的低滲溶液重懸細胞沉淀，置冰上10分鐘，1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用1/4沉淀體積的低滲溶液重懸細胞沉淀，用Doimce勻漿器勻漿15下，4000Xg、4°C離心15分鐘， 用1/2細胞體積的低鹽溶液重懸沉淀，4°C用Doimce勻漿器勻漿10次，勻漿后溶液轉移到一離心管內，加入攪拌子與攪拌器上輕輕攪動，并逐滴加入1/2細胞體積的高鹽溶液，4°C 垂直混勻30分鐘，4°C、25，000 X g離心20分鐘，上清用BC150溶液4°C透析30分鐘，所得核蛋白分裝后用液氮速凍，最后存儲于-80°C備用；在分離純化內源轉錄因子時，取4-8mg核蛋白與步驟幻得到的磁珠孵育，孵育溫度為4°C，孵育時間為2小時，用NETN(50mM NaCl, 0. 25%NP-40)洗滌兩次，再用PBS洗滌3次，洗滌時間為IOs/次，此時，磁珠上便富集了大量的內源性轉錄因子。以上所述方法中，根據不同的應用目的，還進一步包括對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物洗脫以從固體磁珠脫離得到蛋白產品的過程；該步驟用于獲取內源轉錄因子及其復合物。或者，包括對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物進行后續鑒定的過程，包括將磁珠上富集的內源性轉錄因子及其復合物用胰酶進行酶解，取上清干燥得到內源轉錄因子及其復合物的酶解肽段混合物以用于質譜鑒定。酶解方法為向洗滌后的磁珠中加入45 μ 1 50mM NH4HCO3 (ρΗ8· 0)，再加入10 μ 1預先配好的胰酶(Promega公司)工作液(100 μ g/mL)，37°C消化過夜，再加入5 μ 1預先配好的胰酶工作液，37°C消化1小時，加入200 μ 1 50%乙腈和0. 甲酸溶液，劇烈振蕩10分鐘，用磁力架吸住磁珠，將上清轉移到一干凈的EP管內，重復一次，合并所得上清，將所得上清置于真空壓縮泵內干燥得到內源轉錄因子及其復合物的酶解肽段；再將干燥好的內源轉錄因子及其復合物的酶解肽段進行質譜鑒定并搜庫確定待測樣品中所含的轉錄因子，用LTQ-Orbitrap-Velos質譜儀檢測樣品的質譜鑒定條件如下色譜條件色譜柱DionexC18 PePMap300，3um，300A。； ID 75um，Length 15cm ；流動相:八，2%乙腈+98%水+0. 甲酸；B，98%乙腈+2%水+0. 甲酸;流速380nl/min；洗脫條件時間05757637075B%510123080800質譜條件數據采集時間75min，噴霧電壓(spray voltage) 1. 8KV ；碰撞能量 (normalized collision energy) 35 ；采集質量范圍300_1300Da ；數據庫搜索采用Proteome Discovery version 1· 2平臺，利用MASCOT搜索，分子量精度設為母離子lOppm，二級碎片離子0. 5Da。當然，還可采用Western、ELISA等方法對特定轉錄因子或輔調節蛋白進行鑒定。上述的轉錄因子串聯結合序列在富集分離內源轉錄因子及其復合物中作為生物素標記的DNA誘餌的應用也屬于本發明內容。本發明還一目的在于提供一種內源轉錄因子的檢測芯片或ELISA檢測試劑盒，其中包裝有以上所述的轉錄因子串聯結合序列作為生物素標記的DNA誘餌。以上，本發明富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法利用轉錄因子與序列特異性DNA元件結合的特點，設計合成串聯各種轉錄因子的多拷貝雙鏈DNA結合元件，然后通過分子克隆技術在DNA結合元件兩端各加入生物素標記的雙鏈DNA手臂，形成“DNA誘餌”，在進行內源轉錄因子及其復合物的分離純化時，將純化好的生物素化DNA誘餌偶聯到鏈親和素包被的磁珠上，然后與預先制備好的核蛋白一起孵育，經過洗滌后從核蛋白中分離純化內源轉錄因子及其復合物。最后，根據不同的應用目的后續可進一步進行轉錄因子的質譜鑒定及功能解析。本發明還包括“DNA誘餌”的設計，通過全基因合成或體外連接等策略，將多拷貝DNA反應元件連接到一目的載體上，然后在該載體多克隆位點兩端設計合成一對生物素標記的引物，然后通過PCR擴增及凝膠回收獲得生物素標記的“DNA誘餌”。該設計使得“DNA誘餌”在固定到磁珠上時形成更利于轉錄因子結合的空間結構。本發明采用轉錄因子能和DNA結合的特性進行內源轉錄因子及其復合物的分離純化。由于轉錄因子與保守結合位點的親和力要比非特異DNA高幾個數量級，因此，使用轉錄因子保守結合位點的雙鏈寡核苷酸是一個相對直接的純化特定轉錄因子及其結合蛋白的方法；另外，DNA比抗體更容易獲得，而且能保持轉錄因子在形成多蛋白復合物時的天然構象，因此，用DNA保守元件對轉錄因子及其復合物進行親和純化具有更大的優勢，為解析轉錄因子復合物的組成及分析轉錄復合物的動態變化打開了廣闊的前景。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為本發明分離鑒定內源轉錄因子及其復合物的方法的流程圖
具體實施例方式實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1、小鼠肝臟細胞核蛋白轉錄因子及其復合物的分離鑒定用本發明的方法分離鑒定小鼠肝臟細胞核蛋白轉錄因子及其復合物，如圖1所示，具體方法包括以下步驟一、轉錄因子串聯結合序列的獲得根據表1所示的100個轉錄因子及其DNA結合元件設計并合成本發明用于富集分離內源轉錄因子及其復合物的轉錄因子串聯結合序列(concatenated transcriptionfactor response elements, catTFRE),該序列是由 3_5bp 的接頭序列 (Linker)串聯轉錄因子 API、AR、BRCAl、CEBPA、CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRl、ETSl、 EffSRl-FLI 1、FEV, FOXAl、FOXCl、FOXDl、F0XF2、FOXI1、FOXLl、F0X03、Fra-I、GATA2、GATA3、 GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、 MIZF、MYC: :MAX、Myf, MZFl 1-4, MZF15-13、NF_kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、 NFKBl、NFYA, NHLHl、NKX3-1、NR1H2: : RXRA, NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、 PPARG> PR、PXR-I: RXR-alpha、RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA, REST、RFXl、RFX2、RFX3、RFX5: RFXAP: RFXANK, R0RA_1、R0RA_2、RREBl、RXR: : RAR DR5、 RXRA: : VDR、S0X10、S0X9、SPl、SPI1、SPIB、SRF、SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: : TCF3、 TBP, TEADU TFAP2A、TLXl: :NFIC、TP53、USFU WTl-del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI-del2、 WTlI-KTS,XBP-UYYl和ZNF354C DNA結合元件中的一個或多個后得到的DNA序列，相鄰轉錄因子之間都有34bp的接頭序列，各轉錄因子的串聯順序為任意的。其中，包含有上述 100個轉錄因子的雙拷貝DNA結合元件的轉錄因子串聯結合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。序列表中的序列1由觀00個堿基組成，該序列包含上述100個轉錄因子的雙拷貝核心結合元件，以增加對目的轉錄因子的親和力，每個轉錄因子的雙拷貝核心結合元件間隔3個堿基對。表1串聯DNA結合元件序列包含的轉錄因子及其DNA結合元件— 轉錄因子DNA結合元件
APITGACTCA
ARAGAACACATTGTTCT
BRCAlACAACAC
CEBPATTTCGCAAT
CREBlTGACGTCA
E2F1TTTGGCGC
ELKlGAGCCGGAAG
ELK4ACCGGAAGT ESRlGGCCCAGGTCACCCTGACCT
ETSlTTTCCG
EWSRI-FLIlGGAAGGAAGGAAGGAAGG
FEVCAGGMAT
FOXAlTGTTTACTTTG
FOXClGGTMGTA
FOXDlGTAMCAT
F0XF2CAAACGTAAACAAT
FOXIlGGATGTTTGTTT
FOXLlTATACATAF0X03TGTAAACA
Fra-ITTACTGACTCACCACAT
GATA2GGATA
GATA3AGATAG
GRAGAACACATTGTTCT
HIFlA::ARNTGGACGTGC
HLFGGTTACGTAATG
HNFlBTTMTATTTAAC
HNF4AAGGCCAAAGGTCA
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INSMlTGTCAGGGGGCG
IRFlGAAAGTGAAACC
IRF2GGAMGTGMAGCAAMC
JunBTTACTGACTCACCACAT
JunDCCCCTTTCTGACTCAC
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MEF2ACTATTTATAG
MIZFTAACGTCCGC
MYC::MAXGAGCACGTGGTMyfCAGCAGCTGCTG
MZFl_l-4TGGGGA
MZF1_5-13GTAGGGGGAA
NF-kappaBGGGAATTTCC
NFATC2TTTTCCA
NFE2L2ATGACTCAGCA
NFICTTGGCA
NFIL3TTATGTAACGT
NFKB丄GGGGATTCCCC
NFYAACCAGCCAATCAGCG
NHLHlCGCAGCTGCGT
NKX3-1ATACTTA
NR1H2::RXRAAAAGGTCAAAGGTCAAC
NR2F1TGACCTTTGAACCT
NR3C1GGGAACATTATGTCCTGT
NR4A2AAGGTCAC
PaxBTTCACGCATGAGTT
PBXlCCATCAATCAAA
PDXlCTAATT
PLAGlGGGGCCCAAGGGGG
PPARG PR
PXR-I:RXR-alpha
RAR-alpha
RAR-alpha:RXR-gam
RAR-beta:RXR-alpha
REL
RELA
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RFX2
RFX3
RFX5:RFXAP:RFXANK
R0RA_1
R0RA_2
RREBl
RXR::RAR_DR5
RXRA::VDR
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S0X9
SPl
SPIl
SPIB
SRF
SRY
STATl
STAT5A
T3R-bctal
TALI::TCF3
TBP
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TLXl::NFIC
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USFl
WTl-del 2
WTl-KTS
WTlI
WTlI-del2
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AGAACACATTGTTCT
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TGGAAGGGCAGACCCAGGACACTCTCACCA
TGGAAGGGCAGACCCAGGACACTCTCACCA
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CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
CTTCACCCAGCAACAGATGAGGC
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TATAAGTAGGTCAA
CCCCAAACCACCCACAACCA
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GCCTTGGGC
TGGCACCATGCCM
CCGGACATGCCCGGGCATGT
CACGTGG
CACACACACACACAACCA CACACACACACACAACCA CACACACACACACAACCA CACACACACACACAACCAWTII-KTSCACACACACACACAACCA
XBP-IATGACGYYlGCCATC
ZNF354C_ATCCAC_二、構建攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體將步驟一獲得的轉錄因子串聯結合序列連接入目標載體pUC57的多克隆位點中，得到攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體，具體方法為合成2. 81Λ全長 catTFREDNA(序列表中序列1)，用限制性內切酶EcoR I和Hind III將全長DNA構建到 PUC57載體中。最后在大腸桿菌Dffia克隆菌株中擴增表達，質粒提取后作為catTFRE生產 PCR的模板。三、高純度生物素標記的DNA誘餌的獲得設計并合成一對生物素標記的引物，其正、反向引物可分別與目標載體多克隆位點上游及下游200bp處退火，上游引物的核苷酸序列為5，-CATTCAGGCTGCGCAACTGTTG-3’ (序列表中序列2)，下游引物的核苷酸序列為5’-GTGAGTTAGCTCACTCATTAGG-3’ (序列表中序列3)，以步驟二中攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體為模板，在該引物對的引導下進行PCR 擴增，所述 100 μ 1 PCR 反應體系為 JOXExiTaq Buffer 10 μ 1, dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1， pUC57-sdTF 1μ 1(約 50ng)，上、下游引物各 1μ l(lnmol)，ExTaq 0. 5μ 1, H2O 87. 5 μ 1 ； PCR 反應條件為先 94 °C 2min，然后 94°C 45s, 60 °C 45s, 72 °C 2min,共；35 個循環，再 72°C 7min，最后4°C 30min，反應結束后，對PCR擴增產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，回收 3000bp的目的擴增片段，得到高純度生物素標記的DNA誘餌(biotin-sdTF)。四、將高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上將步驟三獲得的高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠 Dynabeads M-280streptavodin (Invitrogen)上，具體操作為1)取120 μ 1磁珠到一干凈的EP管內，置于磁力架上吸附磁珠，然后移走上清；2)用 500 μ 1 IXDNA Binding Buffer 洗滌磁珠；3)加入 15pmol 078 μ g)biotin-sdTF DNA，用 5XDNA Binding Buffer 將結合體系調節到 IXDNA Binding Buffer ；4) 4°C搖動孵育20分鐘；5)用BC150洗滌兩次，吸走所有上清。五、內源轉錄因子的分離純化提取小鼠肝臟細胞核蛋白，具體方法為1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用 IXPBS重懸細胞沉淀，再次1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用10倍沉淀體積的低滲溶液(IOmM Tris · HCl ρΗ7· 3，1. 5mM MgCl2, IOmM KCl，用前加入 IOmM β -ME 和 ImMPMSF)重懸細胞沉淀，置冰上10分鐘，1000Xg、4°C離心10分鐘收集細胞，用1/4沉淀體積的低滲溶液重懸細胞沉淀，用Doimce勻漿器勻漿15下，4000Xg、4°C離心15分鐘，用1/2細胞體積的低鹽溶液(20mM Tris · HCl pH7. 3,1. 5mM MgCl2, 20mM KC1,0. 2mM EDTA,25% glycerol, 用前加入IOmM β -ME和ImM PMSF)重懸沉淀，4°C用Dounce勻漿器勻漿10次，勻漿后溶液轉移到一離心管內，加入攪拌子與攪拌器上輕輕攪動，并逐滴加入1/2細胞體積的高鹽溶液 QOmM Tris ‘ HCl pH7. 3,1. 5mM MgCl2,1. 2M KC1,0. 2mM EDTA，25 % glycerol,使用前加 IOmM β-mercaptoethanol，0. 5XProteininhibitors)，4°C 垂直混勻 30 分鐘，4°C、 25，OOOXg 離心 20 分鐘，上清用 BC150 溶液 QOmM Tris · HCl pH7. 3,0. 15mM KC1,0. 2mM EDTA,20% glycerol，使用前加IOmMβ -ME，ImM PMSF)4°C透析30分鐘，所得核蛋白分裝后用液氮速凍，最后存儲于-80°C備用。取200-800 μ 1 上述備用 NE (4-8mg), 4°C > 100, OOOXg 離心 20 分鐘；將 NE 上清移入一干凈EP管內，加入ImM EDTA、50mM NaCl和0. 5mmol PMSF，待用。用Bradford法測定 H印G2/小鼠肝細胞核蛋白提取物(NE)的濃度，結果濃度大于10mg/mL。然后，將準備好的待用NE加入步驟四獲得的固定有DNA誘餌的磁珠中進行共孵育取與15pmol Biotin-DNA (生物素標記DNA)等量的str印avidin-coated beads (親合素包被磁珠)，用磁力架吸附，移走上清，加入500μ 1 IXDNA Binding Buffer洗一次，再加入 15pmol Biotin-DNA，用 5XDNA Binding Buffer 將結合體系調至 1 XDNABinding Buffer。 于4°C搖動孵育20分鐘，孵育后用BC150溶液進行洗滌，洗滌時間為IOs/次，共洗滌2次， 小鼠肝臟細胞核蛋白中內源轉錄因子及其復合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上。六、對被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物進行酶解及質譜鑒定為了評價該發明技術對內源性轉錄因子的富集分離能力，對被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物進行酶解及質譜鑒定，方法為向洗滌后的磁珠中加入45μ 150mM NH4HCO3 (pH8. 0)，再加入10 μ 1預先配好的胰酶(ftOmega)工作液(100 μ g/mL)，37°C消化過夜，再加入5μ 1預先配好的胰酶工作液，37°C消化1小時，加入200 μ 1 50%乙腈和0. 1% FA溶液，劇烈振蕩10分鐘，用磁力架吸住磁珠，將上清轉移到一干凈的EP管內，重復一次， 合并所得上清，將所得上清置于真空壓縮泵內干燥樣品，最后將干燥好的樣品進行質譜鑒定并搜庫確定，其中質譜鑒定條件如下色譜條件色譜柱DionexC18 PePMap300，3um，300Α。； ID 75um, Length 15cm ； 流動相A，2%乙腈+98%水+0. 甲酸；B，98%乙腈+2%水+0. 甲酸；流速380nl/ min ；洗脫條件
時間05757637075B%510123080800質譜條件數據采集時間75min，噴霧電壓(spray voltage) 1. 8KV ；碰撞能量 (normalized collision energy) 35 ；采集質量范圍300_1300Da ；數據庫搜索采用Proteome Discovery version 1. 2平臺，利用MASCOT搜索，分子量精度設為母離子lOppm，二級碎片離子0. 5Da。結果在本次實驗中，樣品中共鑒定到多達391個內源轉錄因子(表2)。表明小鼠肝臟細胞核蛋白中大量的內源轉錄因子被DNA誘餌捕獲。因此，該發明技術可廣泛應用于樣品中大規模轉錄因子鑒定、特定轉錄因子確證和定量。更重要的是，轉錄因子特別是其中的核受體家族(nuclear receptor)是目前藥物設計的熱門靶點，現有的藥物也往往通過激活/抑制轉錄因子來發揮其藥效。另一方面，藥物以其機理的復雜性和靶點的多樣性為特點。藥物因多靶點性，其真正效果往往和當初設計思想不一致，或者帶來毒副作用，或者具有治療其它疾病的“意外”效果。全景式掃描轉錄因子動態變化在藥物機理和副作用研究中格外重要。本發明技術平臺利用轉錄因子應答元件(TFRE)大規模富集分離細胞中內源性轉錄因子，結合后續鑒定和定量手段可檢測在藥物刺激下細胞內源性轉錄因子動態變化， 發現⑴藥物發揮作用的靶點和藥理機制⑵藥物潛在的應答靶標，預測藥物的副作用。需要說明的是，由于轉錄因子的各家族成員往往識別較為相似的DNA序列，如核受體家族(共48個成員)偏向于結合序列為AGGTCA的DNA單元，因此單個轉錄因子DNA 結合元件往往可以富集某轉錄因子家族的多個成員。這也解釋了為何上述實驗在肝臟中檢測到的391個轉錄因子數目要多于catTFRE的設計富集轉錄因子數。本發明所提供的轉錄因子串聯結合序列除了可用于富集分離內源性轉錄因子以檢測生物機體、組織或細胞內所有內源性轉錄因子的表達譜外，還可用于開發內源性轉錄因子篩查用的檢測試劑盒或檢測芯片，如將結合序列包被到96孔板上或固體片基表面，與待檢樣品細胞裂解液孵育，可開發內源性轉錄因子的ELISA檢測試劑盒或檢測芯片。表2對被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物進行酶解及質譜鑒定結果
權利要求
1.一種轉錄因子串聯結合序列，是由3^bp的接頭序列(Linker)串聯的轉錄因子 API、AR、BRCAl、CEBPA, CREBl、E2F1、ELKl、ELK4、ESRl、ETSl、EffSRl-FLIU FEV, FOXAl、 FOXCU FOXDU F0XF2、FOXIU FOXLU F0X03、Fra-U GATA2、GATA3、GR、HIF1A: :ARNT、HLF, HNF1B、HNF4A、H0XA5、INSMU IRFU IRF2、JunB, JunD, MAX、MEF2A、MIZF, MYC: :MAX、Myf、 MZFl 1-4、MZF15-13、NF-kappaB、NFATC2、NFE2L2、NFIC、NFIL3、NFKB1、NFYA、NHLHl、NKX3-1、 NR1H2::RXRA,NR2F1、NR3C1、NR4A2、Pax6、PBXl、PDXl、PLAGl、PPARG, PR、PXR-I:RXR-alpha、 RAR-alpha、RAR-alpha: RXR-gam、RAR-beta: RXR-alpha、REL> RELA> REST、RFX1、RFX2、RFX3、 RFX5:RFXAP:RFXANK、R0RA_1、R0RA_2、RREBU RXR: :RAR DR5、RXRA: :VDR、S0X10、S0X9、 SPl、SPI1、SPIB、SRF, SRY, STATU STAT5A、T3R_betal、TALI: :TCF3、TBP, TEADl、TFAP2A、 TLX1: :NFIC、TP53、USFU WTl_del2、WTl-KTS, WT1I、WTlI_del2、WTlI-KTS, XBP-U YYl 和 ZNF354C等DNA結合元件中的一個或多個后得到的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的轉錄因子串聯結合序列，其特征在于所述轉錄因子串聯結合序列的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.權利要求1或2所述的轉錄因子串聯結合序列在富集分離內源轉錄因子及其復合物中作為生物素標記的DNA誘餌的應用。
4.一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法，包括以下步驟1)將權利要求1或2所述的轉錄因子串聯結合序列連接入目標載體的多克隆位點中， 得到攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體；2)設計并合成一對生物素標記的引物，其正、反向引物可分別與目標載體多克隆位點上游及下游200bp處退火，以步驟1)中攜帶有轉錄因子串聯結合序列的重組載體為模板， 在所述引物對的引導下進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的擴增片段，得到高純度生物素標記的DNA誘餌；3)將步驟幻獲得的高純度生物素標記的DNA誘餌固定到鏈親和素包被的磁珠上；4)內源轉錄因子的分離純化提取細胞核蛋白，將步驟3)獲得的固定有DNA誘餌的磁珠與細胞核蛋白進行孵育，洗滌，細胞核蛋白中內源轉錄因子及其復合物被DNA誘餌捕獲到固體磁珠上。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中的目標載體為PUC57、 pET24a+、pGEX4T-2、pGEX4T_l、pCMV-Myc、pGH 或 pcDNA-Myc。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述步驟幻中上游引物的核苷酸序列如序列表中序列2所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟2)中ΙΟΟμΙPCR反應體系為 IOXExTaq Buffer 10 μ 1，dNTPs (2. 5mM/dNTP) 10 μ 1，pUC57_sdTF 1 μ 1 (50ng)，上、下游引物各 1 μ I(Inmol)，ExTaq 0. 5μ 1, H2O 87. 5 μ 1 ;PCR 反應條件為先 94°C aiiin，然后 94°C 45s, 60°C 45s, 72°C 2min,共；35 個循環，再 72°C 7min,最后 4°C 30min。
8.根據權利要求4至7任一所述的方法，其特征在于所述步驟4)中細胞核蛋白的提取采用Doimce勻漿的方法，先用低鹽溶液破細胞膜，離心分離得到的細胞核經doimce勻漿及高鹽溶液溶解，高速離心分離出核蛋白，經BC150透析恢復內源蛋白及其復合物的天然屬性。
9.根據權利要求4至8任一所述的方法，其特征在于所述方法中還進一步包括對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物洗脫以從固體磁珠脫離得到蛋白產品的過程；或對步驟4)被DNA誘餌捕獲的內源轉錄因子及其復合物進行后續鑒定的過程，包括用胰酶進行酶解，取上清干燥得到內源轉錄因子及其復合物的酶解肽段混合物以用于質譜鑒定。
10. 一種內源轉錄因子的檢測芯片或ELISA檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求1 或2所述的轉錄因子串聯結合序列DNA。
全文摘要
本發明公開了一種富集分離內源轉錄因子及其復合物的方法及其專用轉錄因子串聯結合序列。該方法利用轉錄因子與序列特異性DNA元件結合的特點，設計合成串聯各種轉錄因子的多拷貝雙鏈DNA結合元件，然后通過分子克隆技術在DNA結合元件兩端各加入生物素標記的雙鏈DNA手臂，形成“DNA誘餌”，在進行內源轉錄因子及其復合物的分離純化時，將純化好的生物素化DNA誘餌偶聯到鏈親和素包被的磁珠上，然后與預先制備好的核蛋白一起孵育，從而從核蛋白中分離純化內源轉錄因子及其復合物，后續可進一步進行轉錄因子的質譜鑒定及功能解析。
文檔編號C12N15/10GK102517282SQ201110457108
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者丁琛, 劉萬霖, 劉明偉, 劉瓊明, 宋雷, 秦鈞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所, 美國貝勒醫學院