生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用。本發明所提供的基因工程菌是按照包括以下步驟的方法構建的：在出發釀酒酵母中引入外源的丹參柯巴基焦磷酸合酶基因(SmCPS)和丹參次丹參酮二烯合酶基因(SmKSL)得到生產次丹參酮二烯的重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母ZD-T-000和ZD-T-010。在此基礎上，提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶、萜類調控因子蛋白UPC2、牻牛兒牻牛兒基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶中的一種或幾種蛋白的活性，構建得到24株(ZD-T-001～ZD-T-008，ZD-T-011～ZD-T-018，ZD-T-021～ZD-T-028)高產次丹參酮二烯的重組釀酒酵母菌株。本發明所構建的釀酒酵母ZD-Tans-001在好養氧條件下，發酵6天時可生產487.91mg/L的次丹參酮二烯。
【專利說明】生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生產次丹參酮二烯的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]次丹參酮二烯(Miltiradiene)是重要藥用植物丹參中提取的脂溶性二萜成分，為丹參酮類化合物共同的前體物質(Wei Gao et al., 2009, Organic Letters, 11:5170-5173)。這類化合物(如隱丹參酮、丹參酮IIA、丹參酮IIB、二氫丹參酮)在抗炎，心腦血管，抗腫瘤等方面有非常好的應用前景，目前與其相關的產品中，已有復方丹參片、復方丹參滴丸等銷售額上數億人民幣的王牌產品上市。注射用丹參酮IIA磺酸鈉已廣泛用于治療冠心病、心肌梗死等疾病，就目前丹參酮IIA的原料市場情況來看，含量20 %的4500元/kg ;含量50%的8000元/kg ;含量為98%的高達3.6萬元/kg。可見整個與丹參酮類化合物相關的產業有巨大的市場需求，經濟效益也非常可觀。目前丹參酮類化合物的主要來源是通過中藥材丹參中直接提取，但隨著開墾荒地、荒山伐林丹參野生資源的生長環境遭到嚴重破壞，丹參資源日趨減少；人工種植過程中也遇到品種退化，大量的土地和人力成本等因素。丹參酮類化合物產量已經遠不能滿足社會的需求，嚴重影響了丹參的臨床應用和丹參酮類制藥原料中間體的開發和應用，亟待需要提供新的資源途徑。
[0003]目前利用合成生物學的原理，設計和改造微生物菌株來生產天然產物已被國際認為是一種最有潛力的方法，如在大腸桿菌中生產紫杉醇的前體紫杉二烯已達到1000mg/L(ParayiI Kumaran Ajikumar et al.,2010, Science, 330:70-74);銀杏內酯類(Ginkgolides)前體左旋海松二烯(Levopimaradiene),在改造后的大腸桿菌工程菌中達到 700mg/L 的 產量(EffendiLeonard et al.,2010, PNAS, 107(31):13654-13659);在酵母工程菌中生產青蒿素(Artemisinin)的前體青蒿酸(Artemisinic acid)最高達到IOOmg/L (Dae-Kyun Ro et al.,2006, Nature, 440:940-943);目前國內在青蒿素和紫杉醇等藥物分子的生物合成方面有相關研究。
[0004]次丹參酮二烯為植物丹參體內萜類合成途徑的產物，由丹參細胞中線粒體、細胞溶質和內質網存在的甲羥戊酸(MVA Pathway)代謝途徑與在質體中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛(MEP Pathway)代謝途徑共同合成。其中前體物質櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(GGPP)為異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)經過櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶(GGPS)催化得到，GGPP可以被丹參柯巴基焦磷酸合酶(SmCPS)和次丹參酮二烯合酶(SmKSL)共同催化為次丹參酮二烯，圖1。微生物大腸桿菌中存在丙酮酸/磷酸甘油醛途徑，在前面的研究中，高偉等人研究策略采用了文獻報道的大腸桿菌表達系統，以商用雙表達載體pACY⑶uet共同表達基因SmCPS和SmKSL，但效果不理想，只能獲得了毫克級的次丹參酮二烯(Wei Gao et al.，2009，Organic Letters，11:5170-5173)。然而，作為傳統發酵工藝中常用菌株:釀酒酵母，在其體內存在生產萜類成分的甲羥戊酸途徑，其中產萜類成分麥角甾酉享(Ergosterol)能達到生物量的 4.6% (Arnezeder, C.et al., 1990, Biotechnollett.,12:277-282) ;二萜香葉酰香葉酰醇(GGOH)也能達到 283mg/L (Tokuhiro，K.et al.，2009，Appl Environ Microbiol.,75:5536-5543)，由此利用酵母的優化的甲羥戊酸途徑生
產次丹參酮二烯具有很大潛力。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供高產次丹參酮二烯釀酒酵母工程菌株ZD-Tans-001。
[0006]本發明所提供的釀酒酵母工程菌株ZD-Tans-ΟΟΙ，其保藏號為CGMCC N0.5296。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種基因工程菌的構建方法。
[0008]本發明所提供的基因工程菌的構建方法，包括以下步驟:
[0009]在出發釀酒酵母中引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母I。
[0010]所述方法還包括以下步驟:
[0011]在所述重組釀酒酵母I中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母II。
[0012]在所述重組釀酒酵母I中提高櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母III。
[0013]所述方法還包括以下步驟:`[0014]在所述重組釀酒酵母III中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母IV。
[0015]所述方法還包括以下步驟:
[0016]克隆及人工改造萜類合成途徑中功能基因:釀酒酵母3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因I (tHMGl)、釀酒酵母萜類調控因子蛋白UPC2基因(UPC2.1)、釀酒酵母櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因(BTSl)和釀酒酵母法呢基焦磷酸合酶基因(ERG20);全人工合成嗜酸熱硫化葉菌的櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因(SaGGPSsyn)。克隆營養缺陷型篩選標記:亮氨酸營養缺陷篩選基因元件LEU2、組氨酸營養缺陷篩選基因元件HIS3、尿嘧啶營養缺陷篩選基因元件URA3 ;抗生素型篩選標記基因素(G418)抗性基因元件KanMX和潮霉素抗性基因元件hphNTl等功能元件。
[0017]所述方法還包括以下步驟:
[0018]克隆調控元件釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶啟動子(PGKl)、釀酒酵母的翻譯延伸因子I啟動子(TEFl)、釀酒酵母的乙醇脫氫酶I啟動子(ADHl)、釀酒酵母的半乳糖激酶I啟動子(GALl)、釀酒酵母細胞色素C終止子(CYClt)和釀酒酵母的乙醇脫氫酶I終止子(ADHlt)。
[0019]所述引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶是通過轉化入攜帶外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因。
[0020]所述提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性是通過轉化入攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因。[0021]所述提高櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性是通過轉化入攜帶櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因。
[0022]所述在釀酒酵母染色體上整合基因是整合在SDNA位點。
[0023]所述攜帶柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質粒，復制位點為2MICR0N,篩選標記為尿嘧啶營養缺陷篩選標記URA3，柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的啟動子均為釀酒酵母的半乳糖激酶I啟動子GAL1。
[0024]所述攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因的質粒，復制位點為2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標記為亮氨酸營養缺陷篩選標記LEU2和基因素(G418)抗性篩選標記KanMX中的一種，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶I啟動子ADH1，萜類調控因子蛋白UPC基因的啟動子為釀酒酵母的翻譯延伸因子I啟動子TEF1。
[0025]所述攜帶櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質粒，復制位點為2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標記為組氨酸營養缺陷篩選標記HIS3和潮霉素篩選標記hphNTl中的一種。一種櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因和法呢基焦磷酸合酶基因融合在一起，啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶I啟動子ADH1，另一種櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因的啟動子為釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶啟動子PGK1。
[0026]所述柯巴基焦磷酸合酶為丹參的柯巴基焦磷酸合酶。
[0027]所述次丹參酮二烯合酶為丹參的次丹參酮二烯合酶。
[0028]所述萜類調控因子蛋白UPC2為釀`酒酵母固醇調控因子蛋白UPC2的突變。
[0029]所述3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶為釀酒酵母的3-羥基_3_甲基戊二酰輔酶A還原酶I截取5’部分序列的功能蛋白。
[0030]所述櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶一種為釀酒酵母的櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶；另一種為密碼子優化的嗜酸熱硫化葉菌的櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶，其編碼基因為序列表中序列I所示DNA。所述法呢基焦磷酸合酶為釀酒酵母的法呢基焦磷酸合酶。
[0031]所述出發釀酒酵母為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。
[0032]由所述方法構建得到的重組釀酒酵母也屬于本發明的保護范圍。
[0033]所述釀酒酵母菌ZD-Tans-OOl或所述釀酒酵母菌在生產次丹參酮二烯中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0034]本發明的又一個目的是提供一種生產次丹參酮二烯的方法。
[0035]本發明所提供的生產次丹參酮二烯的方法，包括以下步驟:
[0036]發酵所述釀酒酵母ZD-Tans-OOl或所述釀酒酵母，得到次丹參酮二烯。
[0037]所述發酵的溫度為25°C -37°C或25°C或30°C或32°C或37°C ；
[0038]所述發酵的體系的pH值為3.0-8.0或3.0或4.0或5.0或6.0或7.0或8.0 ;
[0039]所述發酵的時間為24-168小時或24小時或48小時或72小時或96小時或120小時或144小時或168小時；
[0040]所述發酵的接種量的體積百分比為0.01% -10%或0.01%或0.3%或I %或10% ；
[0041]所述發酵的培養基由以下成分組成:[0042]酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、基因素(G418)、潮霉素
[0043]以上成分在所述發酵培養基中的濃度分別為:
[0044]酵母膏l-20g/L、蛋白胨 l_40g/L、葡萄糖 5_50g/L、G41810_500mg/L、潮霉素10_600mg/L。
[0045]本發明所構建的釀酒酵母ZD-Tans-OOl在好養氧條件下，發酵6天時可生產487.91mg/L的次丹參酮二烯。
保藏說明
菌種名稱:釀酒酵母
拉丁名:Saccharomyces cerevisiae
菌株編號:ZD-Tans-OO I
保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏機構簡稱=CGMCC
地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所 保藏日期:2011年9月28日 保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.5296
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]圖1次丹參酮二烯生物合成途徑
[0047]圖2攜帶基因元件的質粒示意圖(營養缺陷型篩選標記)
[0048]圖3攜帶基因元件的質粒示意圖(抗生素型篩選標記)
[0049]圖4次丹參酮二烯GC-MS分析圖A:次丹參酮二烯標準品TIC圖(Rt =19.922min) ；B:樣品TIC圖(Rt = 19.919min) ；C:次丹參酮二烯標準品MS圖；D:次丹參酮二烯樣品MS圖
[0050]圖5菌株發酵結果:與ZD-T-OOO相關菌株
[0051]圖6菌株發酵結果:與ZD-T-010及轉入營養缺陷篩選標記型功能質粒相關菌株
[0052]圖7菌株發酵結果 與ZD-T-010及轉入抗生素篩選標記型功能質粒相關菌株
[0053]圖8ZD-Tans_001菌株高密度發酵結果
【具體實施方式】
[0054]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0055]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0056]實施例1、基因元件的克隆
[0057]基因元件的克隆分為以下五個步驟:
[0058](I)酵母DNA提取
[0059]挑取菌斑(Saccharomycescerevisiae BY4742)于 YPD 液體培養基(配方:1%Yeast Extract (酵母膏)，2% Peptone (蛋白腺)，2% Dextrose (葡萄糖)中，3CTC, 200rpm,培養24h。10000g，5分鐘收集菌體于1.5ml離心管中，水清洗兩次，菌體重懸于酵母破壁液中(25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇緩沖液，5ul β -ME)，30°C溫浴Ih后離心；菌體用500ulTENTS 緩沖液(IOmM Tris_HCl，pH 7.5 ；ImM EDTA，pH8.0 ；IOOmMNaAc ；2% triton-100 ；1%SDS)重懸，60°C水浴Ih ;酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍體積的EtOH，1/10倍體積的3MNaAc，-20°C冰箱放置2h ; 13000g，4°C，離心lOmin，倒掉上清，沉淀用70% EtOH,洗劑沉淀2次后吹干，雙蒸水溶解，_20°C保存備用。
[0060](2) PCR擴增及克隆
[0061]以酵母基因組DNA為模板，用引物列表1中引物，擴增tHMGl、UPC2、δ DNAUδ DNAl ；以質粒YES2.0DNA為模板擴增營養缺陷型篩選標記URA3 ；以質粒pRS313DNA為模板擴增營養缺陷型篩選標記HIS3 ；以質粒pRS42?NA為模板擴增營養缺陷型篩選標記LEU2 ；以質粒pRS41KDNA為模板擴增抗生素型篩選標記KanMX ；以質粒pRS42HDNA為模板擴增抗生素型篩選標記hphNTl。擴增體系為:NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP (IOmM each dNTP) lul、DNA 模板 20ng、弓丨物(IOuM)各 Iul、Phusion High-FidelityDNA Polymerase (2.5U/ul) 0.5ul、補加蒸懼水至總體積 50ul。
[0062]引物列表1
[0063]
【權利要求】
1.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae BY4742)ZD-Tans_001,其保藏號為 CGMCCN0.5296。
2.一種基因工程菌的構建方法，包括以下步驟: 在出發釀酒酵母中引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母I。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法還包括以下步驟: 在所述重組釀酒酵母I中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母II。 在所述重組釀酒酵母I中提高櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母III。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述方法還包括以下步驟: 在所述重組釀酒酵母III中提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性，得到重組釀酒酵母，記作重組釀酒酵母IV。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述引入外源的柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶是通過轉化入攜帶外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合外源柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因。 所述提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2的活性是通過轉化入攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因。 所述提高櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性是通過轉化入攜帶櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質粒，或在釀酒酵母染色體上整合櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于: 所述在釀酒酵母染色體上整合基因是整合在SDNA位點。 所述攜帶柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的質粒，復制位點為2MICR0N，篩選標記為尿嘧啶營養缺陷篩選標記URA3，柯巴基焦磷酸合酶和次丹參酮二烯合酶基因的啟動子均為釀酒酵母的半乳糖激酶I啟動子GAL1。 所述攜帶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶和萜類調控因子蛋白UPC2基因的質粒，復制位點為2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標記為亮氨酸營養缺陷篩選標記LEU2和基因素(G418)抗性篩選標記KanMX中的一種，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶I啟動子ADH1，萜類調控因子蛋白UPC基因的啟動子為釀酒酵母的翻譯延伸因子I啟動子TEFl。 所述攜帶櫳牛兒櫳 牛兒基焦磷酸合酶和法呢基焦磷酸合酶基因的質粒，復制位點為2MICR0N和CEN6/ARSH4中的一種，篩選標記為組氨酸營養缺陷篩選標記HIS3和潮霉素篩選SEhphNTl中的一種。一種櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因和法呢基焦磷酸合酶基因融合在一起，啟動子為釀酒酵母的乙醇脫氫酶I啟動子ADH1，另一種櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶基因的啟動子為釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶啟動子PGK1。
7.根據權利要求2-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述柯巴基焦磷酸合酶為丹參的柯巴基焦磷酸合酶。 所述次丹參酮二烯合酶為丹參的次丹參酮二烯合酶。 所述萜類調控因子蛋白UPC2為釀酒酵母固醇調控因子蛋白UPC2的突變。 所述3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶為釀酒酵母的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶I截取5’部分序列的功能蛋白。 所述櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶一種為釀酒酵母的櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶；另一種為密碼子優化的嗜酸熱硫化葉菌的櫳牛兒櫳牛兒基焦磷酸合酶，其編碼基因為序列表中序列I所示DNA。所述法呢基焦磷酸合酶為釀酒酵母的法呢基焦磷酸合酶。 所述出發釀酒酵母為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。
8.由權利要求2-7中任一所述的方法構建得到的重組釀酒酵母。
9.權利要求1所述的釀酒酵母或權利要求8所述重組釀酒酵母在生產次丹參酮二烯中的應用。
10.一種生產次丹參酮二烯的方法，包括以下步驟:發酵權利要求1所述的釀酒酵母或權利要求8所述重組釀酒酵母，得到次丹參酮二烯。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于: 所述發酵的溫度為25°C -37°C或25°C或30°C或32°C或37°C ； 所述發酵的體系的PH值為3.0-8.0或3.0或4.0或5.0或6.0或7.0或8.0 ; 所述發酵的時間為24-168小時或24小時或48小時或72小時或96小時或120小時或144小時或168小時； 所述發酵的接種量的體積百分比為0.01% -10%或0.01%或0.3%或I %或10% ; 所述發酵的培養基由以下成分組成: 酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、基因素(G418)、潮霉素 以上成分在所述發酵培養基中的濃度分別為: 酵母膏 l_20g/L、蛋白胨 l_40g/L、葡萄糖 5-50g/L、G41810-500mg/L、潮霉素 10_600mg/L0
【文檔編號】C12N1/19GK103820344SQ201110453388
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2011年12月30日 優先權日:2011年12月30日
【發明者】張學禮, 黃璐琦, 戴住波, 劉怡 申請人:天津工業生物技術研究所, 中國中醫科學院中藥研究所