專利名稱：一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法
技術領域：
本發明涉及一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法，具體涉及利用犢牛睪丸細胞系將山羊口瘡病毒連續傳代培養使其毒力弱化的方法。背景技術：
羊傳染性膿皰俗稱羊口瘡(Orf virus)，是綿羊和山羊的一種由口瘡病毒所致的人獸共患傳染病，世界動物衛生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。本病幾乎分布于世界所有養羊國家，自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發。本病常呈群發性流行，3飛月齡羔羊最易感染，成年羊發病較少，病羊和帶毒羊是本病的傳染源。病毒可隨病羊的唾液、膿皰和水皰分泌物以及脫落的痂皮排出，其傳播途徑主要是經損傷的皮膚或黏膜而感染。健康羊與病羊直接接觸，或接觸被病羊污染的飼槽、飼料、飲水、用具、墊草、牧場及廄舍等而感染。目前，在羊口瘡的高發區，并沒有商品化的羊口瘡疫苗進行生產和銷售。在上世紀 80年代，蘭州畜牧獸醫研究所曾經選育出毒力弱化的羊口瘡病毒毒株，達到了很好的保護率。但是隨著羊口瘡的流行，大量的地方株被鑒定，羊口瘡病毒出現了諸多的血清型，原來的弱毒株并不能為所有的山羊提供有效的保護。而且以前的弱毒株的弱化是利用的羊口瘡野毒株在原代犢牛睪丸細胞進行連續培養，獲得細胞培養物，加入適當的保護劑后加工而成的，這樣就需要大量的犢牛睪丸進行分離培養，耗費時間和財力。同時，在利用犢牛睪丸細胞進行傳代時，由于犢牛的睪丸來源不穩定，容易造成批次間的差異性。同時犢牛來源的檢疫不完善會造成疫苗生產的污染。
發明內容
本發明為了解決上述背景技術中的不足之處，提供一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法， 其利用犢牛睪丸細胞系，通過羊口瘡病毒的連續傳代培養，致使羊口瘡病毒毒力致弱，為羊口瘡病毒弱毒疫苗的制備與生產提供了穩定可靠的方法，用以獲得大量的穩定的疫苗。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細胞系連續傳代培養直到毒力弱化。步驟1)中，羊口瘡病毒的初步培養采用犢牛睪丸細胞系培養，犢牛睪丸細胞系的培養液為M199、DMEM (高糖)、RPMI_1640培養基。(此三類培養基皆可以用于犢牛睪丸細胞系的培養。完全培養基含10%的犢牛血清，犢牛睪丸細胞系在37°C，5%0)2培養2 3天可以用于接種病毒)
步驟1)中，羊口瘡病毒分離于患病山羊的口唇部結痂。步驟2)中，犢牛睪丸細胞系是通過導入端粒酶逆轉錄基因(hTERT)方法制備的。步驟2)中，羊口瘡病毒連續傳代到85代以后直到毒力弱化。現有的羊口瘡病毒毒力弱化，需要以新生犢牛睪丸為原料，采用常規的原代細胞制備方法制備出睪丸原代細胞，用以增殖羊口瘡病毒，經80余代次才能達到毒力弱化目的。然而，原代細胞有制備程序復雜、批次間細胞質量數量差異等缺點。
本發明具有的優點和效果如下不需要采集制備睪丸原代細胞，直接用本種子細胞系，進行羊口瘡病毒傳代弱化毒力。傳代細胞生物學性能穩定，批次間細胞質量穩定，批次之間差異很小。細胞系用于弱化病毒更適于實驗室操作相對于制備原代睪丸細胞，其技術操作程序簡單、省時，價格便宜。四、附圖表說明
圖1為未接種羊口瘡病毒細胞系細胞圖； 圖2為接種4 后病變，細胞變圓，脫落圖； 圖3為接種后大量細胞變圓，出現空斑圖。五具體實施例方式
本發明為一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細胞系連續傳代培養直到毒力弱化。羊口瘡病毒的初步培養采用犢牛睪丸細胞系培養，犢牛睪丸細胞系的培養液為M199、DMEM (高糖)、 RPMI-1640培養基。(此三類培養基皆可以用于犢牛睪丸細胞系的培養。完全培養基含10% 的犢牛血清，犢牛睪丸細胞系在37°C，5%0)2培養2 3天可以用于接種病毒。羊口瘡病毒分離于患病山羊的口唇部結痂。犢牛睪丸細胞系是通過導入端粒酶逆轉錄基因(hTERT)方法制備的。羊口瘡病毒連續傳代到85代以后直到毒力弱化。以下實施例用于說明本發明，但不限制本發明的使用范圍(參見圖1-3)。1、山羊口瘡病毒的分離與初步培養
采集患病奶山羊的口唇結痂，加入8 IOml的無菌PBS緩沖液進行浸泡，同時加入3 5倍正常用量的青鏈霉素。M 3 后研磨，把懸濁液置于4°C過夜。第二天取出懸濁液 4000rpm,離心lOmin，取上清液0. 22 m濾膜過濾除菌，300 L 500 L接種犢牛睪丸細胞系，連續盲傳5代后，再接種犢牛睪丸細胞系后的48h、％h可觀察到細胞病變。2、羊口瘡病毒在犢牛睪丸細胞系連續傳代培養直到毒力弱化
當細胞病變達到809Γ90%后或細胞變圓，-20°C冰凍細胞培養液Mh以上，反復凍融3 次，然后無菌收集細胞培養物。同時以此代病毒接種細胞系，進行病毒傳代，病毒傳代到第 85代，細胞產生病變變慢(7 10天)。利用此羊口瘡病毒對山羊進行口唇劃痕接種，觀察產生病變情況，此病毒的接種組產生了明顯輕于強毒株的病變，并且口唇部病變的持續時間短于強毒株(參見表1)表1為羊口瘡病毒毒力弱化效果測定，即此細胞系可以用于羊口瘡病毒弱毒制備。
權利要求
1.一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細胞系連續傳代培養直到毒力弱化。
2.根據權利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟 1)中，羊口瘡病毒的初步培養采用犢牛睪丸細胞系培養，犢牛睪丸細胞系的培養液為M199、 DMEM高糖、RPMI-1640培養基；完全培養基含10%的犢牛血清，犢牛睪丸細胞系在37°C，5% CO2培養5-7天可以用于接種病毒。
3.根據權利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟1)中，羊傳染性膿皰病毒分離于患病山羊的口唇部結痂。
4.根據權利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟2)中，犢牛睪丸細胞系是通過導入端粒酶逆轉錄基因(hTERT)方法制備的。
5.根據權利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟 2)中，羊口瘡病毒連續傳代到85代以后直到毒力弱化。
全文摘要
本發明涉及一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其利用犢牛睪丸細胞系，通過羊口瘡病毒的連續傳代培養，致使羊口瘡病毒毒力致弱，為羊口瘡病毒弱毒疫苗的制備與生產提供了穩定可靠的方法，用以獲得大量的穩定的疫苗。本發明包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細胞系連續傳代培養直到毒力弱化。步驟1)中，羊口瘡病毒的初步培養采用犢牛睪丸細胞系培養，犢牛睪丸細胞系的培養液為M199、DMEM(高糖)、RPMI-1640培養基。步驟1)中，羊傳染性膿皰病毒分離于患病山羊的口唇部結痂。步驟2)中，犢牛睪丸細胞系是通過導入端粒酶逆轉錄基因(hTERT)方法制備的。
文檔編號C12N7/08GK102533681SQ20111045283
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者尚川川, 田婷婷, 羅軍, 陳德坤 申請人:西北農林科技大學