一種熒光同步檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法及試劑盒的制作方法

專利名稱：一種熒光同步檢測肝炎及艾滋病毒核酸的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于診斷試劑一核酸診斷技術領域，具體涉及一種靈敏度高、特異性強、適合于常規血液核酸篩查的同步提取和同步實時檢測肝炎(包括乙型肝炎和丙型肝炎)和艾滋病毒核酸的方法和試劑盒。
背景技術：
據世界衛生組織(WHO)統計，超過一半國家沒有對獻血者獻出的血液進行徹底檢驗，導致艾滋病、肝炎、瘧疾和梅毒等疾病在很多地方泛濫。全球每年增加的560萬名艾滋病毒攜帶者中，有5% 10%的人是經由輸血或血液制品而感染的。在非洲兒童和婦女中病毒攜帶者的比例高達20% 25%。20世紀80年代以來，法國、日本、羅曼尼亞、美國、德國以及中國等國家都曾因血液篩查欠缺而導致過嚴重的后果。血液傳染病一旦在一個地方發生，往往會造出爆炸性傳播，因此輸血安全對人民的安全和社會的穩定有著極其特殊的意義。臨床血液檢測也面臨日益劇增的檢測壓力。據WHO估計，我國艾滋病感染人數到2010將達到1000萬，并持續高速增長。我國60%以上的人曾受到乙肝病毒的感染，最終有1/10左右的人發展成為乙肝表面抗原陽性。另外，在所有肝炎中慢性化程度最高的丙型肝炎，發病人數也達到4000萬左右。與血液安全的極端重要性相比，目前的檢測手段還遠遠滯后于社會的需要。目前對輸血安全性構成嚴重威脅的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV-1)主要采用酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)進行檢測。雖然經過了幾代的改良，在靈敏度、特異性、精密度以及穩定性等方面取得了長足的進步，但作為一種間接滯后的檢測方法，它所檢測的是病毒所引發的人體抗體而不是病毒本身，因此不能夠消除對“窗口期”標本的漏檢，所謂“窗口期”即在被感染早期，體內還未產生抗體或抗體在檢測限以下，此時的血清學檢測一般為陰性，而HBV、HCV、HIV-1病毒感染產生的抗體的窗口期又特別長，其中丙型肝炎病毒(HCV)的窗口期約為66 82天，乙型肝炎病毒(HBV)和人類免疫缺陷綜合癥病毒I型(即艾滋病毒I型，HIV-1)的窗口期分別為約59天和22天。另外，由于病毒的突變等原因也造成了部分免疫學方法檢測漏檢的可能。所以免疫學診斷方法存在固有的缺陷，不能杜絕漏檢——檢測方法的滯后已給輸血安全和臨床檢驗帶來嚴重威脅。近年來，核酸技術的發展和逐漸成熟為人們直接檢測病毒的存在提供了最有力的工具。核酸擴增技術(Nucleic acid Amplification Technology, NAT)就是這一類技術的統稱。核酸檢測的是病毒基因本身，是在最根本的層面上對病毒的檢測。核酸檢測大大縮短了病毒檢出的窗口期，并具有極高的靈敏度、特異性、精密度和穩定性。事實證明NAT檢測可將HBV、HCV和HIV-1感染的平均“窗口期”分別縮短25天、59天和11天，分別縮短“窗口期”45%、89%和50%。正因為如此，越來越多的國家認識到血液核酸檢測的重要性，在西歐等國家作為強制性指標在臨床輸血及血制品中執行，同時，美國、日本、歐盟已將NAT檢測納入獻血者的常規篩查 項目。國外已有多個單項核酸檢測產品投放市場。美國、澳大利亞、加拿大等國家相繼有產品問世。羅氏公司也開發了核酸診斷試劑盒。但這些試劑盒要么是開放性的PCR-ELISA檢測模式，要么操作繁瑣、易發生檢測污染，并且都是單個指標單次檢測，這些缺陷使之很難適應市場現狀的需要。分析這些核酸診斷試劑的現狀，主要存在以下幾點不足:I)試劑是開放式的，污染的可能性大；自動化程度低，而自動化和全封閉性事核酸檢測最關鍵的技術瓶頸。2)試劑為單項檢測的，沒有一個血篩試劑可以同步提取、同時實時檢測多種病毒核酸(如，HBV、HCV和HIV-1)，如FDA批準的羅氏血液篩查試劑均為單項操作，使用的擴增程序各不相同，檢測過程也不盡相同；FDA批準的另一家GEN-PR0BE公司所使用的TMA技術可以同時擴增HCV與HIV-1，但不能同時擴增HBV ;另外檢測要么是不同管操作，各測各的，要么是同管操作，但一旦測定結果為陽性時卻不能分辨是HCV還是HIV-1。迄今為止，美國FDA只批準過上述兩個產品可用于血液核酸篩查。3)操作繁瑣，重復性差，通量低，不適于臨床檢驗和大規模的血液篩查。4)兼容性差，大多提供核酸提取試劑的廠家往往不提供擴增檢測試劑或者二者不能很好的匹配，需要用戶調整甚至優化；有的能提供匹配試劑，卻又不一定適用于特定的核酸自動提取儀；及時上述條件得到滿足，用戶還要根據擴增檢測試劑的要求選用指定的儀器，如 COBAS AMPLIC0R 等。5)試劑往往不是即用型的，例如使用前需要溶解干粉、在一些瓶瓶罐罐中加入指定量的乙醇或異丙醇等有機試劑，有的試劑使用前還有復雜的配制工作，稍有不慎就造成試驗的徹底失敗。不同人員的操作還引入試劑準備這一步驟的操作誤差；并且某些試劑一旦開封后或復融后即使低溫保存有效期也只有幾天，尤其不適于標本量較少情況下的多批次反復使用，也不利于核酸檢測在大中型醫院檢驗科室的廣泛應用，成為血液篩查和臨床核酸檢驗方法發展的瓶頸之一。因此，本領域迫切需要開發適合于常規血液核酸篩查的自動化、高通量、多項目的同步核酸提取和實時擴增檢測技術平臺及可應用于規`模化生產的性能穩定、可操作性強、即用型試劑的試劑盒，并有相關的儀器、耗材與之匹配。聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，由高溫變性、低溫退火(復性)和適溫延伸等幾步反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點，不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA/RNA的地方。實時熒光定量PCR技術，即PCR熒光定量檢測是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術，于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，是一種在PCR反應體系中加入熒光基團標記的探針(TaqMan探針)，利用熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術具體為利用Taq DNA聚合酶5' —3' DNA聚合酶和5' —3'核酸外切酶活性，對目的片段進行擴增及對TaqMan探針進行切割進而產生熒光信號，實現對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、單管操作無污染、實時和準確的特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。
熒光定量PCR檢測技術有如下不足:DPCR熒光定量檢測需一對擴增引物和一條TaqMan熒光探針，三條寡核苷酸序列均需保守，擴增片段長度范圍100 150bp，且在引物及TaqMan探針設計方面有諸多要求和限制條件；2)PCR反應組分包括緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+濃度等諸多因素需優化；3) PCR反應耗時長；4)易產生PCR產物污染等。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5'-末端，而淬滅劑則在3'-末端。常用的熒光基團是FAM，TET, VIC和HEX等。本發明利用TaqMan探針報告熒光基團與淬滅熒光基團相互作用的機制，在不進行PCR反應的條件下，實現對肝炎和艾滋病毒的定性檢測。

發明內容
本發明的目的在于提供一種能同步提取HBV、HCV、HIV-1病毒的核酸、同步實時檢測HBV、HCV、HIV-1病毒的核酸的試劑盒，以克服傳統蛋白質檢測和熒光定量PCR檢測固有的缺陷和不足，同時彌補現有國內外同類產品的諸多不足乃至方法學上無法解決的致命缺陷。本發明提出一種能同步提取并同步實時檢測血清或血漿中HIV-1、HBV、HCV病毒核酸是否存在的方法和試劑盒。按照本發明所述的方法包括以下三項相對獨立又相互關聯的內容，并且提供了可選的組合以提供完整實現本發明所述的試劑盒。1、本發明提供了一種基于核酸雜交特異性同步捕獲提取HBV、HCV、HIV-1核酸的方法，其特征是選用了 HBV、HCV、HIV-1各自保守序列特異性的生物素修飾的寡核苷酸序列作為核酸提取試劑的捕獲探針，保守序列的選擇不受傳統方法后續PCR檢測所用特異性引物的限制，因此作為捕獲探針的保守序列可選擇范圍更為廣泛。2.本發明提供了一種變通的通用捕獲核酸的方法，即設計一段中間探針，無修飾的普通寡核苷酸其3'-端連接有一段polyA序列01igo(dA)18 25,作為中間雜交的主干探針，使用生物素修飾的Oligo(ClT)25作為通用捕獲探針；中間探針的5'-端核酸序列作為特異性識別檢測項目中病毒核酸的“識別臂”，雜交并捕獲病毒核酸，而3'-端的Oligo (dA) 25作為生物素化的Oligo (dT) 25的識別位點，為其捕獲,最后雜交形成雜交復合體為鏈親合素包裹的磁珠所吸附，經洗滌液Wl和W2的洗滌，出去非特異性雜交物如變性蛋白和糖類等雜質，最后磁珠進入洗脫液，經加熱操作，核酸模板從雜交復合體洗脫下來進入洗脫液，而仍吸附著生物素化Oligo (dT)25的廢磁珠經儀器自動移走，洗脫液即可作為熒光互補探針雜交檢測的模板。該方法的優點是生物素標記的Oligo (dT) 25是一致的，結合效率僅取決于設計的中間探針的雜交效率。主干探針是包含有HBV、HCV、HIV-1特異性探針序列的線性排列的寡核苷酸片段，作為一條三聯體探針，HBV、HCV、HIV-1特異性探針序列之間間隔有連接臂如3 8個T或A，生物素修飾通用捕獲探針的5,-端，這樣可省去一些鏈親和素包裹磁珠的量，相應可以提高磁珠的量，有利于檢測靈敏度的進一步提高。
3、本發明通過了一種基于熒光互補探針雜交同步檢測肝炎和艾滋病毒的方法，其技術原理為:
根據目的基因保守區設計一條探針序列( 30bp)，分別在5'-和3'-端標記發射熒光基團(如，FAM)和淬滅熒光基團(NFQ)，當單條探針存在時，由于其兩端兩個熒光基團距離較遠而不會引起熒光淬滅效應，即有熒光產生(類似分子信標〈molecular beacon)與目的基因結合時發射熒光的原理)；并以該探針序列的反義鏈作為另一條探針序列，分別在5'-和3'-端標記另一種發射熒光基團(如，HEX)和淬滅熒光基團(NFQ)，同樣，當單條探針存在時，由于其兩端兩個熒光基團距離較遠而不會引起熒光淬滅效應。當兩條互補探針發生配對，由于一條探針的發射熒光基團與另一條探針的淬滅熒光基團相互靠近而發生熒光淬滅效應，則兩條探針均不產生熒光信號；當一條探針與某條目的基因核酸片段發生配對，其互補鏈探針無法與該探針結合而失去對該探針的熒光淬滅效應，則可產生一個熒光信號。理論上，一條目的基因DNA雙鏈可產生兩個熒光信號。經變性與復性操作后，可定量檢測目的基因片段數量、濃度等。假設FAM探針量多于HEX探針量，FAM本底熒光值為FfamI，HEX本底熒光值為0，當探針與模板發生配對，此時FAM熒光值為Ffam2(Ffam2 > FfamI), HEX熒光值為FtexI。由于探針與模板之間配對幾率遠大于模板間配對幾率，因此模板在變性解鏈后，所有DNA/RNA單鏈與探針配對。無論Ffam2如何增加，模板量即Fhra￡l。本發明將基于熒光互補探針雜交法同步檢測肝炎和艾滋病毒的試劑盒中的HBV、HCV, HIV-1各自特異性互補探針中的FAM探針量均略高于HEX探針量，使得檢測結果均以HEX熒光值為準，故可將HEX探針稱為檢測探針，并以此實現對肝炎和艾滋病毒的快速定性檢測。綜上所述，本發明在于提出了一種檢測HBV、HCV、HIV-1病毒核酸的試劑盒，包括同步提取HBV、HCV、HIV-1核酸的磁珠提取試劑及一次性耗材和核酸檢測試劑及相關耗材，其中含有去抑 制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液W1、洗滌液W2、洗脫液和內對照等。匹配儀器可使用上海復星長征醫學科學有限公司制造的SuperPure System-32等。上述提到的裂解液為裂解血清、血漿等體液標本中病毒顆粒的異硫氰酸胍溶液，具體為 4 6M 異硫氰酸胍，20 50mM Tris, PH6.0 8.0，I % 20% NP-40，1% 20%Triton X-100,0.1% 10% SDS，0.01 I μ M捕獲探針，1% 10%聚合物；其中捕獲探針對 HBV 為〈SEQ ID N0.9>，對 HCV 為〈SEQ ID N0.10>，對 HIV-1 為〈SEQ ID N0.11>，純度為PAGE或HPLC ;所述磁珠懸液為含有TWEEN 20的超順磁材料的磁珠，表面包有均勻一層親和素，直徑為0.1 10 μ m,含有BSA> NaN3成分，如Invitrogen公司、Promega公司、Roche公司等生產的磁珠；所述洗滌液Wl和W2為含氯化鈉的溶液，具體為洗滌液Wl:LiCl, TrisPH7.0，十二烷基磺酸鋰，防腐劑及TWeen20等分散劑，色素如品紅或其它燃料等，其中LiCl的濃度范圍為0.15 3M，Tris的濃度范圍為10 100M，pH范圍為6.0 8.0，十二烷基磺酸鋰濃度為1%，防腐劑為NaN3^ProClin 300等，Tween20的濃度范圍為0.001%— 0.1% ；洗滌液W2:成分與洗滌液Wl相仿但不含十二烷基磺酸鋰和色素，LiCl濃度范圍為0.1 IM ;所述去抑制劑為含有蛋白酶和甘油的醇溶液；所述洗脫液為DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20分散劑和EDTA、NaN3和DTT。本發明中，標本提取所用的中間探針(存在于裂解液中)為〈SEQ ID N0.12>和〈SEQ ID N0.13>。所述核酸捕獲探針為:HBV檢測探針針對HBV核心區(C區)的編碼基因中的一段基因片段〈SEQID N0.9>
5' -Biotin-ACC ACC AAA TGC CCC TAT—3'；HCV檢測探針針對HCV基因序列中5 '-非轉錄區(UTR區)的一段序列〈SEQIDN0.10>5' -Biotin-AGT ACC ACA AGG CCT TTC G-3/ ；HIV-1檢測探針針對HIV-1gag區基因序列〈SEQ ID N0.11>5' -Biotin-CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TC-3/ 。所述探針為TaqMan探針，包括內標探針和三種病毒的檢測探針，其中，三種病毒的互補檢測探針均采用相似的熒光基團標記形式:一條探針采用FAM熒光基團標記，其互補探針采用HEX基團標記；內標互補探針中一條探針采用FAM熒光基團標記，其互補探針采用ROX基團標記，且每一對互補的熒光標記探針，均為FAM探針量稍多于非FAM探針量。本發明所用探針為TaqMan-MGB非熒光淬滅基團探針，由于常規TAMARA淬滅基團為熒光淬滅基團，自身帶有熒光，故在多重反應中匯產生熒光相互疊加干擾，而且其本身為以熒光基團占據了儀器的一個檢測通道，故選用非熒光淬滅基團NFQ作為淬滅基團；本發明中所采用的探針序列為:HBV的互補Taqman探針為:<SEQ ID N0.1>5' -FAM-CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA A-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.2>5' -HEX-TTC TTC TAG GGG TCC TGC CTC GTC G-NFQ-3;；HCV的互補Taqman探針為:<SEQ ID N0.3>5' -FAM-CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC-NFQ-3'，<SEQ ID N0.4>5' -HEX-GTG TAC TCA CCG GTT CCG CAG-NFQ-3'；HIV-1的互補Taqman探針為:<SEQ ID N0.5>5' -FAM-CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA-NFQ-3'，<SEQ ID N0.6>5' -HEX-TAT CCC ATT CTG CAG CTT CCT CAT TGA TGG-NFQ-3'；內標的互補Taqman探針為:〈SEQ ID N0.7>5' -FAM-AAT GTA ACA GAA AAC TTT AAC ATG TGG AAA-NFQ-3'，<SEQ ID N0.8>5' -ROX-TTT CCA CAT GTT AAA GTT TTC TGT TAC ATT-NFQ-3'，
且，每一對互補的熒光標記探針，均為FAM探針量稍多于非FAM探針量；并將4對探針等濃度等體積混合，制成探針混合液，每條探針濃度約為5 μ M0所述2XAnnealing Buffer 為退火緩沖液，具體為含 30mM Tris.HCl (ρΗ8.4),50mM KCl,2mM MgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺。所述陽性對照為:含有部分HBV DNA, HCV RNA、HIV-1RNA片段的混合物，均為與待測項目的熒光探針序列互補的一段基因DNA或RNA，并在3 '-端連接有polyA序列Oligo (dA)18 25以被通用雜交探針捕獲，其中HBV陽性對照為一段DNA序列，HCV陽性對照為一段RNA序列，HIV-1陽性對照為一段RNA序列，三者混合物適當稀釋后保存于核酸穩定液中作為試劑盒的陽性對照；所述內對照為一段RNA序列，與檢測項目的探針結合區不同，不能結合檢測探針，只能結合特異性的內標探針，并在3 '-端連接有polyA序列Oligo(ClA) 18 25以被通用雜交探針捕獲；所述的內標探針為一段人工合成的與檢測項目無關的寡核苷酸序列，其檢測探針的報告熒光基團與待測項目的報告熒光基團不同，以便區分同一份標本的檢測結果和內對照結果，為避免實驗假陰性，須在每個檢測管中設立對照，即內對照，且內對照的檢測結果必須為陽性；所述陰性對照為正常獻血員的血漿。本發明試劑盒的標本處理所采用的是磁珠提取法。該技術使用鏈親合素磁珠(基于核酸雜交原理)，由于DNA和RNA均有相同的雜交性能,所以以便認為該方法對DNA和RNA有相似的提取效果，通過多次洗滌后除去雜質，最后將核酸在低鹽或水中洗脫下來作為核酸擴增檢測的模板。該技術一方面避免了傳統方法中使用酚、氯仿、異戊醇等有毒試劑，另一方面引入了機械化操作，高通量自動化操作或半自動化操作，減少了人為操作因素對實驗結果的影響；且相關技術人員可通過短時間培訓即可掌握其操作流程并掌握其技術要領。本發明的試劑盒組成中使用內對照質控系統，即在裂解液中加入特定序列的內對照RNA，與待測項目共同經過裂解、純化、檢測等步驟。該內對照序列含有與待測項目無關的核苷酸片段，所用內對照探針為該核苷酸片段序列特異性的TaqMan探針。如果試驗結果為待測項目與內對照均為陰性，則表明試驗失敗，試驗效果無效。不含內對照的試驗方案盡管缺少了一道質控標準，但不影響試劑盒的正常使用。本發明的試劑盒作為一種定性檢測的試劑，但不排除可以作為定量檢測的試劑:血液篩查的意義在于定性分析，側重于試劑的靈敏度和特異性；臨床檢測及藥物療效側重于定量分析。

本發明的試劑盒需配合核酸磁珠提取儀及熒光定量PCR儀使用。本發明具有以下幾方面的優勢:I)自動化程度高，減少了人工操作，避免了可能的污染及人為誤差；2)多種核酸病毒同時提取，同步實時檢測；3)無需PCR反應，避免了 PCR產物污染；4)封閉性檢測、靈敏度高、特異性好、精密度高、穩定性好、便于操作；5)適用于大規模高通量的血液篩查，如血液中心和血液制品生產企業等開展核酸篩查；6)整個流程時間短、效率高。


:圖1為磁珠法提取核酸操作步驟示意圖；圖2為熒光互補探針雜交法原理示意具體實施方式
實施例1生物素修飾捕獲探針及陰陽性對照的制備I生物素修飾通用雜交捕獲探針的構建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成以下序列:<SEQ ID N0.12>5' -ACC ACC AAA TGC CCC TAT TTT TTT AGT ACC ACA AGG CCT TTCG AAA AAACTA TGT TTC CCC TTG GTT CTC TC AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA-3'和<SEQ ID N0.13>51 -Biotin-Oligo (dT) 25。2陽性對照的構建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成以下序列:HBV DNA陽性對照序列:<SEQ ID N0.14>5' -CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA AM MA MA AM AMMA AM AM-3,；HCV RNA陽性對照序列:<SEQ ID N0.15>5' -CUG CGG AAC CGG UGA GUA CAC AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA-3,；HIV-1 RNA陽性對照序列:<SEQ ID N0.16>5' -CCA UCA AUG AGG AAG CUG CAG AAU GGG AUA AAA AAA AAMAA AM AM MAAAA-3;。3內對照的構建:委托生工生物工程(上海)有限公司合成包含以下序列的質粒:<SEQ ID N0.17>5' -AAU GUA ACA GAA AAC UUU MC AUG UGG AM AM MA AAAMA AAA AAA AMAAA-3;。實施例2標本處理:核酸提取的磁珠法及試劑配制I基于核酸雜交原理的標本處理試劑組成:裂解液:5M異硫氰酸胍，50mM Tris, PH8.0,10% NP-40,10% Triton X-100,6%SDS，I μ M捕獲探針，5%聚合物等；其中捕獲探針對HBV為〈SEQ ID N0.9>，對HCV為〈SEQID N0.10> 為〈SEQ ID N0.11>。磁珠懸液:lmg/mL鏈親合素包裹的磁珠,含有防腐劑及Tween20等分散劑；洗滌液Wl:LiCl，Tris ρΗ7.0，十二烷基磺酸鋰，防腐劑及TWeen20等分散劑，色素如品紅或其它燃料等；洗漆液W2:LiCl, Tris ρΗ7.0,防腐劑及Tween20等分散劑等；去抑制劑:含有蛋白酶和甘油的醇溶液；洗脫液:DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20分散劑和EDTA、
NaN3 和 DTT 等；
內參照:約含有40000copies/mL內參照的RNA溶液，使用時將其以1: 20比例加入到裂解液中，在裂解液中內參照的濃度約為2000COpieS/mL，美國測試加入100 μ L裂解液參與提取。2操作流程:I)取專用96孔槽(試劑盒核酸純化專用)，用排槍分別向96孔槽各列內提取試齊U，如下:第I列和第7列加入20 μ L去抑制劑、100 μ L裂解液、100 μ L磁珠懸液、待測標本血清100 μ L和10 μ L內參照，96孔槽孔壁避免有液滴附著，并反復吸打數次使混勻；第2列和第8列加入200 μ L洗漆液Wl ;第3、4、9和10列加入200 μ L洗漆液W2 ;第6列和第12列加入100 μ L洗脫液；第5列和第11列為空白。2)啟動SuperPure System-32,在提取儀中裝入梳子,執行核酸抽提程序,運行大約I小時，結束后取出96孔槽，并將第6孔內RNA核酸提取液轉移至EP管內，-20°C保存。
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實施例3核酸檢測:熒光互補雜交探針檢測體系模式及試劑配制I熒光互補探針雜交反應液的配制:2 X Annealing Buffer:退火緩沖液中含 30mM Tris.HCl (pH8.4), 50mM KCl, 2mMMgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺；熒光探針混合液:含5μΜ HBV、HCV、HIV-1和內標熒光互補探針，穩定劑及緩沖液。每一對互補的熒光標記探針，均為FAM探針量稍多于非FAM探針量；并將4對探針等濃度等體積混合，制成探針混合液，每條探針濃度約為5 μ M0試劑配比及配制:將2XAnnealing Buffer和熒光探針混合液按照25 μ L:5μ L的比例混合，并加入20 μ L核酸樣本,反應液體積為50 μ I,上機進行熒光互補雜交探針檢測。
權利要求
1.一種檢測艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎核酸的試劑盒，為一種同步提取并熒光互補探針雜交同步檢測肝炎和艾滋病毒的方法及試劑盒，其特征在于包含去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗漆液、洗脫液、內對照、2 X Anneal ing Buffer、突光探針、陽性對照、陰性對照,其中，所述的去抑制劑為含蛋白酶的醇溶液；所述裂解液為裂解血清、血漿樣本中病毒顆粒的異硫氰酸胍溶液，并含有由生物素修飾的寡核苷酸作為核酸提取的捕獲探針；所述洗滌液為含氯化鈉的溶液；所述洗脫液為低鹽緩沖液；所述磁珠懸液含鏈親和素包裹磁珠；所述2X Anneal ing Buffer為退火緩沖液；所述熒光探針為HBV、HCV、HIV-1和內標特異性的各自兩條互補的Taqman探針；所述陽性對照為含有與HBV、HCV、HIV-1熒光探針序列對應互補的一段DNA或RNA ;所述陰性對照為正常獻血員的血漿；所述內對照為不同于HBV、HCV,HIV-1熒光探針序列的一段內標RNA，可于內標探針特異性結合；其中: HBV的互補Taqman探針為:〈SEQ ID N0.1>5' -FAM-CGA CGA GGC AGG ACC CCT AGA AGA A-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.2>5' -HEX-TTC TTC TAG GGG TCC TGC CTC GTC G-NFQ-3;； HCV的互補Taqman探針為:〈SEQ ID N0.3>5' -FAM-CTG CGG AAC CGG TGA GTA CAC-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.4>5' -HEX-GTG TAC TCA CCG GTT CCG CAG-NFQ-3'； HIV-1的互補Taqman探針為:〈SEQ ID N0.5>5' -FAM-CCA TCA ATG AGG AAG CTG CAG AAT GGG ATA-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.6>5' -HEX-TAT CCC ATT CTG CAG CTT CCT CAT TGA TGG-NFQ-3'； 內標的互補Taqman探針為:〈SEQ ID N0.7>5' -FAM-AAT GTA ACA GAA AAC TTT AAC ATG TGG AAA-NFQ-3'，〈SEQ ID N0.8>5' -ROX-TTT CCA CAT GTT AAA GTT TTC TGT TAC ATT-NFQ-3;， 且，每一對互補的熒光標記探針，均為FAM探針量稍多于非FAM探針量；并將4對探針等濃度等體積混合，制成探針混合液，每條探針濃度約為5 μ M0
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于使用熒光互補探針雜交體系單管一步法同時對肝炎和艾滋病毒進行檢測，檢測項目包含DNA及RNA病毒；含有內對照作為每個測試的全程監測質控。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于使用生物素及寡聚核苷酸修飾的捕獲探針快速純化內對照RNA、陽性對照DNA/RNA及樣本核酸。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所說的裂解液中含有標本提取所用的捕獲探針:對于HBV為:〈SEQ ID N0.9>.5' -Biotin-ACC ACC AAA TGC CCC TAT-3'； 對于HCV為:〈SEQ ID N0.10>.5' -Biotin-AGT ACC ACA AGG CCT TTC G-3/ ； 對于HIV-1為:〈SEQ ID N0.11>.5' -Biotin-CTA TGT CAC TTC CCC TTG GTT CTC TC-3/ 。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所說裂解液中含有標本提取所用的中間探針:〈SEQ ID N0.12>5' -ACC ACC AAA TGC CCC TAT TTT TTT AGT ACC ACA AGG CCT TTCG AAA AAA CTATGT TTC CCC TTG GTT CTC TC AAA AAA AAA AAA AAAAAA AAA AAA-3;和〈SEQ ID N0.13>5' -Biotin-Oligo (dT) 25。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于裂解液的組成為:4 6M異硫氰酸胍，20 50mM Tris, PH6.0 8.0，I % 20% NP-40，1% 20% Triton X-100,0.1% 10%SDS，0.01 I μΜ捕獲探針，1% 10%聚合物；其中捕獲探針對HBV為〈SEQ ID N0.9>，對HCV 為〈SEQ ID N0.10>為〈SEQ ID N0.11>，純度為 PAGE 或 HPLC ;所述磁珠懸液為含有TWEEN 20的超順磁材料的磁珠，表面包有均勻一層親和素，直徑為0.1 10 μ m，含有BSA、NaN3成分；所述洗滌液為含氯化鈉的溶液；所述洗脫液為DEPC處理過的純化水配制的Tris緩沖液，加有Tween 20分散劑和EDTA、NaN3和DTT。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述2XAnnealingBuffer為緩沖液中含 30mM Tris.HCl (pH8.4), 50mM KCl,2mM MgCl2, 5mM DTT 和 1.5% 甲酰胺。
8.如權利要求1中所述的一種熒光互補探針雜交同步檢測肝炎和艾滋病毒的試劑盒，其特征在于:所述的雜交反應液的配制和檢測程序如下: a、熒光互補探針雜交反應液的配制: 將2XAnnealing Buffer和熒光探針混合液按照25 μ L: 5μ L的比例混合，并加入20 μ L核酸樣本,反應液體積為50 μ L ; b、熒光互補探針雜交檢測反應程序: [1]95°C2min [2]94°C2min[3]經20min 冷卻至 25°C IOmin 于第三步25°C，每隔30s采集一次熒光[4]End。
全文摘要
本發明屬于核酸診斷技術領域，具體為一種同步提取并熒光互補探針雜交同步檢測肝炎和艾滋病毒的方法及試劑盒。該方法包括以磁珠作為自動化介質，通過生物素及寡聚核苷酸修飾的捕獲探針特異性同步捕獲HBV、HCV、HIV-1核酸的方法和實時同步多項檢測的基于Taqman探針的熒光互補探針雜交法。相應的試劑盒包括去抑制劑、裂解液、磁珠懸液、洗滌液、洗脫液、內對照、2×Annealing Buffer、熒光探針、陽性對照、陰性對照。本發明的特點是無需PCR反應、單管操作、封閉性檢測、自動化程度高、多種病毒核酸同步提取，同步實時檢測；靈敏度高、特異性好、精密度高；適用于大規模血液篩查、臨床檢驗及科研單位使用。
文檔編號C12Q1/70GK103184297SQ20111044859
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者遲大利, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司