專利名稱：兩條單標記引物檢測技術及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種采用兩條分別標記報告基團和猝滅基團的引物進行核酸擴增PCR檢測的方法及試劑盒。
背景技術：
近年來，核酸擴增技術特別是聚合酶鏈反應(PCR)在實驗檢測和臨床診斷中迅速發展，特別是實時熒光PCR技術，可以采用自動化儀器進行擴增和結果判斷，提高了檢測的
靈敏度。目前采用的實時熒光PCR檢測技術主要是兩種方法，一種是在PCR反應體系中加入熒光染料，如sybgreen等，隨著PCR的進行，熒光染料滲入雙鏈擴增產物而發光。但這種方法的特異性存在缺陷，染料本身的背景熒光和許多非特異擴增產物帶來了干擾信號，影響了結果的判斷。另外一種方法是Taqman探針法(U.S.Pat.Nos.5，210, 015and5，487，972) ，這種方法PCR中增加了一條雙熒光基團標記的熒光探針，探針的5’端標記報告基團，3’端標記猝滅基團。探針未參與反應時，報告基團的熒光被猝滅基團猝滅不產生熒光信號。當遇到靶核酸序列探針參與反應時，探針被DNA聚合酶的水解作用降價，報告基團離開猝滅基團發出熒光信號。Taqman探針法特異性好，但雙標記探針對寡核苷酸合成技術要求高、得率低，導致Taqman探針成本高出普通引物數十倍以上，單一組分成本往往占到整個檢測成本的60%以上，提高了臨床診療費用，影響了這項技術的進一步普及。因此，本發明提供一種單標記雙引物方法和試劑盒，能大幅度降低熒光標記的技術要求和成本，同時保持實時熒光PCR技術的優勢，適合推廣使用。
發明內容
本發明的目的是提供一種雙引物單標記的擴增方法和試劑盒，可以明顯降低熒光PCR方法的成本，同時保持熒光PCR靈敏、特異的特征。本發明的技術內容如下:首先，提供一種用核酸擴增技術檢測靶核酸序列的方法，在這個擴增體系中，包括有兩條引物，這兩條引物分別標記了報告基團和猝滅基團。所述核酸擴增技術是指聚合酶鏈式反應(PCR)。兩條引物的序列符合通常PCR技術要求，分別與靶核酸序列的正鏈與負鏈序列互補，在擴增體系中能進行鏈式聚合反應，產生雙鏈擴增產物。在雙鏈擴增產物中，一條引物攜帶的報告基團進入擴增產物的一條鏈，另一條引物攜帶的猝滅基團進入擴增產物的另一條鏈。當報告基團和猝滅基團處于同一個雙鏈產物中時，報告基團的熒光會被猝滅基團猝滅而不發出或減弱熒光信號。當PCR反應開始前，兩條單標記引物處于分離狀態，報告基團未被猝滅，在熒光PCR儀器上能被檢測到報告基團的熒光信號。當PCR反應開始后，如果反應體系中包含了靶核酸序列，兩條單標記引物就會與靶核酸配對延伸形成雙鏈擴增產物，報告基團的熒光被猝滅基團所猝滅，熒光信號會減弱。隨著反應的不斷進行，雙鏈擴增產物越來越多，熒光信號會越來越弱，其信號的減弱程度反映了雙鏈擴增產物的數量。反之，如果反應體系中不包含靶核酸序列，兩條單標記引物不會發生配對延伸反應，不形成雙鏈擴增產物，報告基團的熒光信號會保持不變。由此，根據熒光信號的變化可以對反應體系中的靶核酸進行檢測。在雙鏈擴增產物中，報告基團和猝滅基團的距離會影響猝滅效果，本發明發現，距離不超過40個堿基對時猝滅效果較好。所述報告基團是熒光基團，例如常用的FAM、HEX、J0E、VIC等。所述猝滅基團可以是熒光基團，例如TAMRA，也可以是非熒光猝滅基團，例如BHQ。其次，本發明涉及一個檢測靶核酸序列的試劑盒，它含有包括有兩條引物，這兩條引物分別標記了報告基團和猝滅基團。試劑盒中還包括DNA聚合酶、脫氧核苷酸、氯化鎂等核酸擴增所需其余各常用組分。
圖1為引物結構示意圖。圖2為擴增曲線。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的技術方案進行詳細說明。實施例1:引物的設計根據乙型肝炎病毒序列設計引物，正向引物是序列表中的SEQ ID N0.1，第16位堿基dG上標記熒光報告基團FAM;反向引物是序列表中的SEQ ID N0.2，第16位堿基dA上標記熒光猝滅基團TAMRA。兩條引物委托商業序列合成公司合成，HPLC純化。實施例2:擴增體系的組成PCR 擴增體系由 Tris-HCl (pH8.3) IOmM, KCl 50mM、dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各
0.2mM、MgCl2 3mM、引物各0.15 ii M組成，并含有IU的Taq DNA聚合酶和IO4拷貝的HBV DNA模板，總反應體積為30 ii I。實施例3:反應程序設定和結果判斷將配制好的反應體系管放到實時熒光PCR儀器上，預變性94°C 2min，然后按照940C 15sec、60°C 30sec循環40次的程序運行，在60°C時檢測FAM通道的熒光信號。運行結束后根據FAM通道熒光信號的減弱來判斷反應體系中含有靶核酸序列。
權利要求
1.一種用核酸擴增技術檢測靶核酸序列的方法，其特征在于擴增體系的兩條引物分別標記有報告基團和猝滅基團。
2.如權利要求1所述，所述兩條引物分別與靶核酸序列的正鏈與負鏈互補，在擴增體系中經過聚合酶鏈式反應能產生雙鏈擴增產物。
3.如權利要求2所述，雙鏈擴增產物的一條鏈中帶有報告基團，另外一條互補鏈中帶有猝滅基團。
4.如權利要求1所述，報告基團是熒光基團，猝滅基團是熒光基團或非熒光基團，當報告基團與猝滅基團處于一個雙鏈產物中時，報告基團的熒光會被猝滅基團猝滅。
5.如權利要求4所述，在雙鏈產物中的熒光基團與猝滅基團的距離不超過40個堿基對。
6.一種檢測試劑盒，其特征在于，它含有權利要求1所述的兩條引物，DNA聚合酶及核酸擴增所需其余各常用組分。
全文摘要
兩條單標記引物檢測技術及試劑盒，屬于生物技術領域，包括有兩條引物，分別標記了報告基團和猝滅基團，用于檢測乙型肝炎病毒。本發明可以明顯降低熒光PCR方法的成本，同時保持熒光PCR靈敏、特異的特征。
文檔編號C12Q1/68GK103184273SQ20111044855
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者夏懿 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司