專利名稱：一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測方法與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種乙型肝炎病毒核酸定量檢測方法與試劑盒。
背景技術：
我國是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染和傳播發病的大國，近年來在我國一直呈高發趨勢，嚴重危害人民健康，臨床上HBV核酸的熒光定量PCR檢測是預防、診斷HBV感染和評價治療效果的有效手段。HBV核酸熒光定量PCR檢測首先需要進行樣品核酸提取，目前國內外臨床應用的核酸提取方法主要有:(I)堿裂解煮沸法，或同時先進行多聚糖濃縮沉淀HBV病毒，在沉淀中加入裂解液煮沸提取核酸；(2)硅膠膜吸附柱法，采用硅膠膜層析柱吸附、清洗、洗脫獲得核酸；(3)磁珠吸附法，采用磁珠吸附、清洗、洗脫獲得核酸。磁珠吸附法具有提取的核酸純度、效率較高的優點，且相對于傳統的堿裂解煮沸法更適合于自動化操作，是未來病原體核酸提取的發展方向。另一方面，在HBV熒光PCR檢測中需要防止結果的假陰性和假陽性，提高檢測準確性，前者可以通過引入內參照監測樣本提取過程中的誤操作與核酸丟失、反應中的PCR抑制物作用，從而避免檢測結果假陰性；后者可以在擴增體系中使用脫氧尿嘧啶核苷酸-尿嘧啶糖基化酶系統(dUTP-UNG)，降解擴增產物引起的污染，減少檢測結果假陽性。目前臨床上已經有一些HBV核酸定量檢測產品上市應用，采用堿裂解煮沸方法提取樣品HBV DNA者居多，也有采用硅膠膜吸附柱法和磁珠法提取，但所取的樣品在50 200 μ I之間、體積偏少，同時沒有使用內參照，結合熒光PCR技術檢測后存在結果準確性和靈敏度不足的缺點，試劑盒質量需要改進和提高。針對這些問題，本發明采用磁珠法提取大體積樣品中核酸，并在熒光PCR檢測時應用競爭性內參照和dUTP-UNG酶防污染系統，減少檢測結果的假陰性和假陽性，提高檢測的準確性和靈敏度。
發明內容
本發明的目的是提供一種HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，采用磁珠法提取400μ I Iml大體積樣品中的HBV和內參照核酸，并經熒光PCR定量檢測，采用的競爭性內參照和dUTP-UNG防污染系統可以減少檢測結果的假陰性和假陽性，從根本上解決了現有方法存在的檢測準確性差、靈敏度低的不足，適合在臨床HBV核酸定量檢測中應用。技術方案本發明的技術方案為:一種HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，采用磁珠法提取400 μ I Iml體積樣品中的HBV和內參 照核酸為模板，并基于熒光PCR技術完成HBV核酸定量檢測。試劑盒包含核酸提取試劑、擴增試劑、校準品、對照品和內參照，對照品包括陰性對照和臨界陽性對照。
所述的HBV核酸定量檢測方法與試劑盒，其中磁珠法提取和熒光PCR檢測HBV核酸的步驟為:取400μ I Iml血清或血漿樣品，加入等體積裂解緩沖液、5 μ I內參照、20 μ I磁珠混合保持IOmin ;磁吸Imin后棄上清，在磁珠中加入800 μ I清洗緩沖液W1，混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入800 μ I清洗緩沖液W2,混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入100 μ I洗脫緩沖液，混合5min，磁吸Imin后取洗脫的核酸20 μ I加入30 μ I PCR反應液做熒光PCR檢測。所述的HBV核酸定量檢測試劑盒，其核酸提取試劑部分包含裂解緩沖液、磁珠、清洗緩沖液W1、清洗緩沖液W2、洗脫緩沖液，其中裂解緩沖液含有50mMTris-HCl (pH8.0)、
4 6M 鹽酸胍、I 5% (w/v)SDS、10 30% (v/v) TritonX-100，清洗緩沖液 Wl 含有 IOmMTris-HCl (ρΗ8.0)、30% 乙醇，清洗緩沖液 W2 含有 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、80% 乙醇，洗脫緩沖液含有I IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)溶液。所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，核酸擴增試劑部分包含PCR緩沖液、HBV引物探針、Taq酶，每個測試分別取PCR緩沖液15 μ 1、HBV熒光探針10 μ 1、Taq酶5μ I以及模板20μ I共50μ I反應體系進行擴增反應，由此組成的反應體系中含有IOmMTris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mM (1階卩8(包括(^1 、(《^1\(101\(1^13等比例)、1.5 51111MgCl2、各0.2 0.5μΜ HBV引物和HBV熒光探針以及內參照熒光探針、I 5U Taq DNA聚合酶和0.01 IU UNG酶。所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，擴增試劑部分中的引物探針經過特異性設計和篩選獲得，包括一對HBV特異性引物、一條HBV熒光探針和一條內參照探針，且一對引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；HBV熒光探針具有SEQ ID NO:3序列且其5’端標記FAM熒光基團、3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團；內參照熒光探針具有SEQID NO:4序列且其5’端標記HEX或JOE或VIC熒光基團、3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團；引物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。上述引物探針詳細核苷酸序列(5’ -> 3’ )如下:`
HBV 上游引物(SEQ ID NO:1):CATAT TCCTC TTCAT CCTgC TgHBV 下游引物(SEQ ID NO:2):gACAAACggg CAACATACCHBV 熒光探針(SEQ ID NO:3) =TgCCT CATCT TCTTg TTggT TCT，5，端標記 FAM 熒光基團，3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團。內參照熒光探針(SEQID NO:4) =TTCTC CTACT CgCCTTCACC gTC，5’端標記 HEX 或JOE或VIC熒光基團，3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團。所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒采用競爭性內參照，擴增模板具有和HBV擴增產物相同長度的核苷酸序列，但HBV熒光探針位置序列用內參照熒光探針序列取代，內參照模板(SEQ ID NO:5)詳細序列為(5，- > 3’):CATATTCCTCTTCATCCTgCTgCTATTCTCCTACTCgCCTTCACCgTCTCTggACTATCAAggTATgTTgCCCgTTTgTC通過人工合成上述內參照模板序列，并克隆到腺病毒載體中獲得含有內參照模板的假病毒，最后用HBV陰性血清稀釋后制得試劑盒內參照。所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒還包括定量校準品4個、對照品2個，定量校準品為含有HBV擴增片段的假病毒血清，濃度為5.0xl06IU/ml、5.0xl05IU/ml、5.0xl04IU/ml、5.0xl03IU/ml，對照品包括陰性對照和臨界陽性對照，前者為HBV陰性血清，后者為HBV陽性血清且濃度在1.0 5.0xl02IU/ml。
有益效果本發明根據上述設計的技術方案，所具有的技術優點和在用于HBV核酸定量檢測時產生的有益效果如下:(I)靈敏:本發明采用磁珠法提取大樣本提取樣品中的核酸作為模板，并經特異性引物探針熒光PCR檢測，HBV檢測靈敏度可達到10IU/ml。(2)準確:本發明采用競爭性內參照，可以避免樣品提取加樣中的核酸丟失或誤操作、以及可能的PCR抑制物引起的檢測結果假陰性；采用dUTP-UNG酶防污染系統可以解決PCR擴增產物污染的問題，降低了交叉污染的可能性，減少檢測結果假陽性，從而提高HBV檢測結果的準確性。(3)自動化:本發明操作簡便快速，不僅適合通常規模血液樣品檢測，也可以通過自動化實現大規模樣品的高通量檢測。試劑盒的上述特點，均為采用磁珠法提取大體積樣品中核酸、并結合競爭性內參照的雙波長熒光PCR檢測方法實現，獲得的檢測結果可以用于判斷HBV感染病情、預測抗病毒治療效果、為臨床病毒載量檢測和治療藥物篩選提供參考依據，具有廣闊的應用前景。
圖1為試劑盒4個定量校準品擴增曲線，從高到低濃度分別為5.0xl06IU/ml、
5.0xl05IU/ml、5.0xl04IU/ml、5.0xl03IU/ml。圖2為試劑盒HBV DNA定量標準曲線，橫坐標是HBV DNA定量值的對數(Log CO)，縱坐標是PCR循環數值(Ct)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以通過技術常識對本發明作各種技術性改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發明中所涉及的主要試劑說明:鹽酸胍、KC1、Tris, MgCl2、無水乙醇等化學藥品為分析純，SDS和TritonX-100為生物級純度，上述化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；dNTPs和Taq酶購自上海宏誼生物技術公司；磁珠購自臺塑生醫科技股份有限公司；乙型肝炎病毒(HBV)核酸熒光定量PCR檢測試劑盒為上海克隆生物高技術有限公司產品。實施例1:HBV核酸定量檢測試劑盒的制備按照發明內容和技術方案，HBV核酸定量檢測試劑盒中的核酸提取部分、擴增部分、定量校準品、對照品以及內參照各組分配制過程如下:(I)裂解緩沖液含有50mM Tris-HCl (ρΗ8.0)、6M 鹽酸胍、I % (w/v) SDSUO % (v/v) Triton X-1OO0(2)清洗緩沖液Wl
含有IOmM Tris-HCl (pH8.0)、30% 乙醇。(3)清洗緩沖液W2含有IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、80% 乙醇。(4)洗脫緩沖液為IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)溶液。(5)磁珠(6) PCR 緩沖液含有33.33mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、166.67mM KCl、0.67mM dNTPs、IOmMMgCl2、
0.2-0.5 μ M HBV引物、HBV熒光探針以及內參照熒光探針。(7) HBV引物探針含有一對HBV上下游引物(SEQ ID NO:1和2)、一條HBV熒光探針(SEQID NO:3)以及一條內參照熒光探針(SEQ ID NO:4)，濃度均為1.5mM。(8) Taq 酶含有Taq DNA 聚合酶 0.4U/ μ 1、UNG 酶 0.0IU/ μ I。(9)定量校準品定量校準品共有 4個，為含有HBV擴增片段人工假病毒的稀釋血清，濃度分別為
5.0X103IU/ml、5.0X104IU/ml、5.0X105IU/ml、5.0X106IU/ml。(10)臨界陽性對照臨界陽性對照有I個，為HBV陽性血清，濃度為1.0 X 102IU/ml。(11)陰性對照陰性對照有I個，為HBV陰性血清。(12)內參照為含有SEQ ID NO:5內參照模板序列的人工假病毒經過HBV陰性血清稀釋，內參照濃度為103copy/ml。上述配制的試劑盒各組分中，核酸提取部分(I) (5)置于室溫保存；核酸擴增部分(6) ⑶和定量校準品、對照品以及內參照置于_20°C保存。核酸擴增部分使用時，每個測試取PCR緩沖液15 μ 1、HBV引物探針10 μ 1、Taq酶5 μ I混于PCR反應管中共30 μ 1，并加入磁珠法處理血清提取的模板20 μ 1，反應體積共為50 μ 1，體系中含有 IOmM Tris-HCl (ρΗ8.3)、50mM KC1、0.2mMdNTPs、3mM MgCl2、各 0.3μΜHBV引物和HBV熒光探針以及內參照熒光探針、2U Taq DNA聚合酶和0.05U UNG酶。反應管置于熒光PCR儀上的擴增程序為:50°C 2min、94°C 5min后按照94°C 10sec、60°C 45sec循環45次，并在60°C時采集FAM和JOE通道熒光信號，擴增結束后用儀器軟件分析定量檢測結果。實施例2:試劑盒檢測靈敏度的測定(I)血清樣品HBV DNA提取采用中國藥品生物制品檢定所乙肝病毒(HBV)核酸定量標準品標定的已知濃度HBV DNA陽性血清3個稀釋梯度為待測定樣品(濃度各為1.0X lOhU/mlU.0X 102IU/ml、1.0X103IU/ml)，測定實施例1中配制的試劑盒檢測HBV DNA的靈敏度。樣品HBV DNA提取操作步驟如下:
①取上述三種濃度血清樣品，與試劑盒4個定量校準品、臨界陽性對照以及陰性對照一起各800 μ 1，分別加入800 μ I裂解緩沖液、20 μ I磁珠以及5 μ I內參照，置于2ml離心管均勻混合,室溫放置lOmin。②將上述樣品裂解混合液分別磁吸Imin后棄上清，在磁珠中分別加入800 μ I清洗緩沖液Wl,混合Imin,磁吸Imin后棄上清。③在磁珠中分別加入800 μ I清洗緩沖液W2,混合Imin ;磁吸Imin后棄上清。④在磁珠中分別加入100 μ I洗脫緩沖液，混合5min，磁吸Imin后取洗脫的核酸用于20 μ I加入30 μ I PCR反應液做熒光PCR檢測。(2)熒光PCR檢測取PCR緩沖液15μ lXn、HBV引物探針10μ lXn、Taq酶5 μ I Xn混于一離心管中(η為待擴增樣品數)，旋渦振蕩器上振蕩混勻10秒，按每個反應管30 μ I分裝。分別加入(I)中提取的試劑盒陰性對照、臨界陽性對照、4個定量校準品、以及3個血清樣品模板各20 μ I, 3個血清樣品模板每個做5個重復測定。每個反應管體積為50 μ I,將上述反應管放到ΑΒΙ7500熒光PCR儀上，先在50°C反應2分鐘，然后94°C保溫5分鐘，再按94°C 10秒—600C 45秒循環45次。60°C采集FAM和JOE熒光通道的信號，擴增結束后用儀器軟件分析定量檢測結果。(3)結果分析試劑盒對1.0X 102IU/ml、l.0X 103IU/ml濃度的樣品分別檢測5次結果均為陽性，
1.0X IO1IUAiI濃度樣品檢測5次中有I次陰性，因此可以確定試劑盒檢測靈敏度可以達到10IU/ml。
本發明試劑盒熒光PCR檢測HBV DNA定量校準品擴增曲線和標準曲線分別如附圖1和2所示。 實施例3:試劑盒在血清HBV DNA提取檢測中的應用(I)血清樣本HBV DNA提取取5例已知濃度HBV DNA陽性血清，采用實施例1配制的本發明試劑盒進行提取檢測，并選擇上海克隆生物高技術有限公司的HBV核酸熒光定量PCR檢測試劑盒作對照進行提取檢測。本發明血清HBV DNA提取步驟同實施例2，取洗脫的核酸做熒光PCR檢測。上海克隆生物高技術有限公司對照試劑盒樣本核酸提取方法為:取50 μ I血清，分別加入50 μ I核酸提取液Α,振蕩混勻IOsec, 13，OOOrpm離心IOmin,棄上清；分別加入50 μ I核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻IOsec, 100°C保溫IOmin, 13, OOOrpm離心2min,取上清做突光PCR檢測。(2)熒光PCR檢測本發明血清HBV DNA提取后進行試劑盒組分配制、加樣和熒光PCR檢測的步驟同實施例2。對于對照試劑盒，按照說明書配制檢測試劑，取HBV PCR緩沖液30 μ I Xn、MgCl2 5 μ I Xn、突光探針5 μ I Xn、Taq酶3 μ IXn混于一離心管中，旋潤振蕩器上振蕩混勻10SeC，按每個反應管43μl分裝。分別加入試劑盒陰性對照和定量校準品、以及提取血清樣品模板各7 μ I。每個反應管體積為50 μ I，將上述反應管放到ΑΒΙ7500熒光PCR儀上，反應管先在50°C反應2分鐘，然后94°C保溫5分鐘，再按93°C 30秒一60°C 90秒循環40次。60°C采集FAM熒光通道的信號。擴增結束后按照試劑盒說明書分析判斷實驗結果。(3)結果分析本發明試劑盒與對照試劑盒檢測5例已知濃度HBV陽性血清樣本結果如表I所示，可知本發明試劑盒對5.0xl02IU/ml以下的HBV陽性血清樣本能檢出陽性，而對照試劑盒沒有檢出陽性，說明本發明的HBV核酸定量檢測試劑盒靈敏度高于對照試劑盒。表I兩種試劑盒熒光PCR檢測HBV陽性血清結果
權利要求
1.本發明為一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，采用磁珠法提取400 μ I Iml體積樣品中的HBV和內參照核酸為模板，并基于熒光PCR技術完成HBV核酸定量檢測；試劑盒包含核酸提取試劑、擴增試劑、定量校準品、對照品和內參照。
2.如權利要求1所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，磁珠法提取和熒光PCR檢測HBV核酸的步驟為:取400 μ I Iml血清或血漿樣品，加入等體積裂解緩沖液、5 μ I內參照、20 μ I磁珠混合保持IOmin ;磁吸Imin后棄上清，在磁珠中加入800 μ I清洗緩沖液Wl,混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入800 μ I清洗緩沖液W2,混合Imin ;磁吸Imin后在磁珠中加入100 μ I洗脫緩沖液,混合5min,磁吸Imin后取洗脫的核酸20 μ I加Λ 30 μ I PCR反應液做熒光PCR檢測。
3.如權利要求1所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，試劑盒核酸提取試劑部分包含裂解緩 沖液、磁珠、清洗緩沖液W1、清洗緩沖液W2、洗脫緩沖液，其中裂解緩沖液含有 50mM 1^8-!1(:1化!18.0)、4 61鹽酸胍、1 5% (w/v) SDS、10 30% (v/v)Triton X-100，清洗緩沖液Wl含有IOmM Tris-HCl (pH8.0)、30%乙醇，清洗緩沖液W2含有IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)、80% 乙醇，洗脫緩沖液含有 I IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0)溶液。
4.如權利要求1所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，試劑盒核酸擴增試劑部分包含PCR緩沖液、HBV引物探針、Taq酶，每個測試分別取PCR緩沖液15 μ 1、HBV熒光探針10 μ l.Taq酶5 μ I以及模板20 μ I共50 μ I反應體系進行擴增反應，由此組成的反應體系中含有 IOmM Tris-HCl (pH8.3)、50mM KC1、0.2mM dNTPs、1.5 5mM MgCl2、各0.2 0.5μΜ HBV引物和HBV熒光探針以及內參照熒光探針、I 5U Taq DNA聚合酶和0.01 IU UNG 酶。
5.如權利要求1所述的HBV核酸定量檢測的方法與試劑盒，其特征在于，試劑盒擴增部分中的引物探針包含有一對HBV特異性引物、一條HBV熒光探針和一條內參照探針，且一對引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；HBV熒光探針具有SEQ ID NO:3序列且其5’端標記FAM熒光基團、3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團；內參照熒光探針具有SEQ IDNO:4序列且其5’端標記HEX或JOE或VIC熒光基團、3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團；弓I物探針序列也可以是和上述序列同源性大于85 %以上的序列。
全文摘要
本發明為一種乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量檢測的方法與試劑盒，包括采用磁珠法提取樣品中的HBV與內參照核酸為模板，基于熒光PCR技術完成HBV核酸定量檢測，引入的內參照可以用于監測操作過程中核酸模板的丟失、誤操作或存在的PCR抑制物，避免結果假陰性；采用的dUTP-UNG酶系統可以減少擴增產物交叉污染，防止結果假陽性。試劑盒包含核酸提取試劑、擴增試劑、定量校準品、對照品和內參照。本發明從根本上解決了現有方法存在的檢測準確性差、靈敏度低的不足，適合在臨床HBV核酸定量檢測中應用。
文檔編號C12Q1/70GK103184295SQ20111044854
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者吳大治, 夏懿, 韓倩, 吳梅 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司