專利名稱：一個具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達載體和應用的制作方法
一個具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達載體和應用技術領域
本發明屬于基因工程領域，公開了一個具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達載體和應用。
背景技術：
小麥(Triticum aestivum)的整個生育期受到多種病蟲的危害，其中由小麥條銹 M (Puccinia striiformis f. sp. tritic)侵染引起的條銹病發生部位主要是葉片，其次為葉鞘和莖上，穗部穎殼和芒上亦可發生。條銹病是威脅我國西北、西南、黃淮冬麥區和西北春麥區的最重要病害之一，在高緯度或高海拔的冷涼地區尤為嚴重。該病害常造成小麥嚴重減產，如中等流行年份減產10-20 %，大流行年份則減產30 %，特大流行年份可減產 50-60%,在少數地塊甚至顆粒無收。建國以來，我國曾發生16次中等規模、10次較大規模的小麥條銹病流行，2005年更是波及波及全國14個省區，發生面積達5700多萬畝。由于小麥條銹病具有流行頻率高、爆發性強、傳播速度快、發生范圍廣、預防難度大等特點，嚴重威脅著小麥高產與穩產，因此加強小麥條銹病的抗病研究，從而有效防治小麥條銹病大面積流行刻不容緩。
目前小麥條銹病的防治目前采取“以種植抗條銹品種為主，藥劑防治和栽培防治為輔”的綜合防治策略。選育并合理利用抗、耐條銹品種，并進行合理品種布局，可有效減少越冬越夏菌源，是防治小麥條銹病最為經濟、安全和有效的措施。我國培育出了大批抗銹小麥品種，這些品種在控制我國小麥條銹病的流行過程中起到了重要作用。小麥條銹菌生理小種具有高度變異性，目前小麥主栽品種中的抗病基因已逐漸被條中四、31、32號及新變異的生理小種所克服，還十分缺乏新的抗源，一旦條件適宜，條銹病將有可能再次大爆發， 從而造成重大經濟損失。因此，基于優良條銹病抗源，加快新型抗條銹病基因的發掘、克隆和利用，并利用轉基因技術育成優良抗病品種，是加快抗病基因利用和提高抗病育種進程的快捷途徑。
南京農業大學細胞遺傳研究所利用四倍體圓錐小麥與二倍體簇毛麥雜交，再與普通小麥回交多代后，選育出了普通小麥-簇毛麥易位系92R137，自1994年進入國內育種利用以來，在四川、云南、陜西等條銹病常發區進行了多年種植，對條銹病表現出了穩定的高度抗性，尤其是對小麥條銹菌優勢小種條中四、30、32表現高抗-免疫。遺傳分析表明， 92R137中的抗性由單基因控制，并呈顯性遺傳，該基因來自圓錐小麥，被國際小麥基因命名委員會命名為撲26。
Yr26是一個具有重要應用價值的抗條銹病基因資源，成功克隆該基因或其抗病途徑中的某些關鍵基因，則可以為利用轉基因手段培育出抗條銹病轉基因小麥新品種奠定堅實基礎。發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種具LRR結構域的跨膜蛋白基因 iTaLRI^。
本發明的另一目的是提供該基因的表達載體。
本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。
本發明的目的可通過如下技術方案實現
具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3，來自普通小麥(Triticum asetivum L. )92R137，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
該具LRR結構域的跨膜蛋白基因編碼的蛋白質TaLRR3，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
含有所述的具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體。
所述的含有所述的具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體優選以 PBI220為出發載體，將所述的TaLRR3基因插入pBI220的BamH I和I酶切位點間所得。
所述的具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3在培育抗條銹病小麥品種中的應用。
所述的含具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體在培育抗條銹病小麥品種中的應用。
有益效果
本發明從小麥中克隆得到了一個具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其所編碼的蛋白質TaLRR3，為小麥中首次報道。TaLRR3可用于基因工程育種，將其插入表達載體 PBI220，得到的該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感條銹病小麥品種對條銹病的抗性。
圖1利用Q-PCR分析TaLRR3在抗條銹病92R137和感條銹病揚麥158中的表達橫坐標0、6、12、24、72表示條銹菌誘導0小時、6小時、12小時、24小時、72小時的小麥葉片樣PΡΠ O
圖2TaLRR3超量表達載體的構建
A 植物表達載體 pBI220 ；B :pBI220 TaLRR3 表達載體。
圖3TaLRR3轉化揚麥158的Ttl代陽性植株的PCR分子鑒定
M :DL2000 ；1 水陰性對照；2 揚麥158陰性對照；3 質粒陽性對照；6，13 陽性植株；4-5，7-12，14 陰性植株。
圖4TaLRR3轉化揚麥158的Ttl代陽性植株的條銹病抗性鑒定
1 抗病對照92R137 ；2 感病對照揚麥158 ；3-11 陽性植株中的抗病植株。
具體實施方式
實施例1 92R137中受條銹菌誘導表達的具LRR結構域跨膜蛋白基因Ta-LRR的克隆
92R137是南京農業大學用四倍體圓錐小麥(Triticum turgitum)與二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa)雜交后的雙二倍體再與六倍體普通小麥多次回交后創造出的易位系(Chen, P. D. , Qi, L. L.，Zhou, B.，S. Z. Zhang, D. J. Liu. 1995Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. TAG, (91) :1125-1128.)。92R137 的 IB 染色體上含有抗小麥條銹病基因％^6，該基因對強毒性小種條中四、31、32等優勢小種的抗性達至丨J高抗-免疫水平(Chunmei Wang, Yiping Zhang, Dejun Han, Zhensheng Kang, Guiping Li,Aizhong Cao,Peidu Chen. SSR and STS markers for wheat stripe rust resistance gene Yr26. Euphytica, 2008，159 :359-366.)。
為了克隆抗病途徑中的抗病相關基因，本實驗室在前期研究中，采用基因芯片雜交法篩選抗條銹病小麥92R137與感條銹病小麥揚麥158中的差異表達基因。具體流程如下將抗條銹病小麥92R137的種子和感條銹病小麥揚麥158的種子播于培養皿中發芽，露白后移栽到盆缽，一葉期把從感條銹病小麥材料上搜集的條銹菌孢子接種到苗上進行誘導，并于接種后12和36小時取樣，分別提取RNA(用hvitrogen公司的Trizol試劑提取)，形成兩個實驗組R12 (92R137誘導12小時的樣品)、R36 (92R137誘導36小時的樣品)和兩個對照組S12 (揚麥158誘導12小時的樣品)、S36 (揚麥158誘導36小時的樣品)。兩個實驗組和兩個對照組的RNA樣品分別用Superscript 〗〗反轉錄成cDNA(試劑盒購自Gibco/BRL，Gaithersburg，MD, USA)，并進一步在體外轉錄成cRNA。2個實驗組和2 個對照組的cRNA樣品分別與四張小麥表達譜芯片GeneChip (Affymetrix小麥基因表達譜芯片，part number 900515)雜交，芯片雜交實驗在“上海國家生物芯片工程中心”完成，實驗步驟參照 Affymetrix 公司說明書"Expressed Analysis Technical Manual”(http:// www. affymetrix. com/support/technical/manual/expression_manual. affx)。以片 實驗組雜交信號與對照組雜交信號的比值大于2為標準，篩選抗條銹病材料92R137中的上調表達基因。其中一個差異表達基因為Ta. 22666，該基因是一個抗病基因類似物，并且在實驗組R12與對照組S12的相比以及在實驗組R36與對照組S36相比，該基因都存在差異表達，所以初步判斷該基因與條銹病抗性具有密切相關性。
以92R137經條銹菌誘導12小時的葉片提取出的RNA反轉錄成cDNA為模板、 以根據芯片探針 Ta. 22666 設計的引物 Pl (CAGCTGACATCTCTGGATCT, SEQ ID N0. 3)和 P2 (GAAGCAGTGCGGAAGTAG, SEQ ID N0. 4)為引物進行 RT-PCR，獲得了 92R137 中 Ta. 22666 基因的同源片段，并進一步利用RACE方法獲得了該基因的全長序列。該基因全長IlMbp的序列，序列如SEQ ID NO. 1所示，序列分析顯示該序列包含一個全長0RF，其中5，-UTR(非翻譯區)99bp、3，-UTR 254bp、0RF(開放閱讀框)80Ibp，編碼266個氨基酸，序列如SEQ ID N0. 2 所示。經 SMART 軟件(http://smart, embl-heidelberg. de/)分析，該基因編碼了一種跨膜蛋白，N端包含LRR結構域，近C端有一個由M個氨基酸組成的疏水跨膜區域，所以該基因為一個具有LRR結構域的跨膜蛋白(LRR containing transmembrane protein)，將該基因命名為TaLRR3。
實施例2TaLRR3基因受條銹菌誘導的表達特征
為了研究TaLRR3在抗感條銹病材料中的表達模式，利用抗病材料92R137和感病材料揚麥158經條銹菌誘導0、6、12、24、72小時的RNA反轉錄cDNA為模板，利用Pl和P2 為引物進行實時熒光定量PCR(Q-PCR)分析。PCR程序為PCR反應在實時熒光定量PCR儀 (MylQ, Bio-Rad公司，美國)上擴增并檢測熒光。20uL PCR反應體系中含2 X STOR GreenPCR Master Mix 10uL，0. 5 μ M引物Pl和P2，反轉錄cDNA模板2uL，用水補充至20uL。擴增參數為95°C 10分鐘，然后95°C 15秒、60°C 30秒，72°C 1分鐘，共40個循環。反應結束后， 進行熔解曲線的測定。檢測基因表達水平用MyiQ系統軟件進行分析。結果表明，在92R137 中，TaLRR3受條銹菌誘導上調表達，12小時上調顯著，24h后表達水平最高，72小時表達已下降；在揚麥158中，TaLRR3各個時間段的表達量均低于在92R137中的表達量，尤其在接種12小時和M小時這兩個關鍵時間段差異最顯著(圖1)。
實施例3TaLRR3超表達載體構建及其轉化普通小麥揚麥158及抗條銹病鑒定
以來自92R137的cDNA為模板，以利用RACE方法獲得的TaLRR3的基因全長序列設計橫跨 ORF 的弓丨物 P3 (CGCGGATCCATGGCTGATGATACCAAG, SEQ ID NO. 5)和 P4 (CGAGCTCTCATATCCGGACGACGTA, SEQ ID NO. 6)，且P3 帶有 BamHI 的酶切位點，P4 帶有 McI 的酶切位點。使用引物對P3和P4進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和McI對擴增產物進行雙酶切，將酶切產物插入到BamHI和McI雙酶切后的載體pBI220 (Jefferson RA, Kavanagh ΤΑ, Bevan Mff.GUS fusions :beta_glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987,6 :3901-3907.)中， 將TaLRR3置于35S啟動子后面的多克隆位點處，替換掉載體本身帶有的⑶S基因。由此將目標基因TaLRR3克隆到強啟動子35S的下游，獲得表達載體pBI220 TaLRR3 (圖2)。
利用基因槍轉化方法TaLRR3轉入感條銹病受體的轉化方法如下1、挑取預培養7 天約2000塊揚麥158幼胚愈傷組織，在高滲培養基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/ L+2，4-D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，ρΗ5· 8)上預處理4-5小時；2、將攜有目的基因TaLRR3的過量表達載體pBI220 TaLRR3通過基因槍轟擊法轉化到揚麥158愈傷組織，轟擊后在高滲培養基上繼續培養16小時。3、將愈傷組織轉移至恢復培養基(1/2MS+水解酪蛋白500mg/L+2，4-Dang/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養2周；4、將愈傷組織轉移至含有除草劑的篩選培養基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2，4-Dlmg/L+蔗糖 30g/L+4mg/LBialaphos, pH5. 8)篩選培養2周；5、將具有除草劑抗性的愈傷組織轉移到分化培養基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 lmmol/L+水解酪蛋白 200mg/L+KT lmg/L+IAA 0. 5mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%，pH5. 8)進行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉移至生根培養基 (l/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%，pH5. 8)中。6、至再生苗長約8cm、根系較健壯時，即可開管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帶的培養基殘渣便可移栽入盆缽。獲得再生植株共307棵。
提取所有再生植株基因組DNA，對轉化植株利用啟動子內部引物 P5 (GTTATGCTGGAGGTTGAGGAGA, SEQ ID N0. 7)和基因內部引物 P6 (GACCAAAGGGCAATTGAGAC， SEQ ID N0. 8)進行PCR擴增，以鑒定陽性植株。PCR程序10-50ng基因組DNA模板，10 μ M 的 Ρ5 禾口 Ρ6 各 0· 5μ 1 ;2· 5μ 1 IOXbuffer ；2. 5μ 1 2. 5mM 的 dNTP ;1. 5 μ 1 25mM 的 Mg2+; 0. 25 μ 1 (5U/ μ l)Taqpolymerase (TaKaRa)，加水至 25 μ 1。PCR 反應條件為:94°C 預變性 3 分鐘；94°C 45秒，550C 45秒，72°C 2分鐘，33個循環；72°C延伸10分鐘。PCR產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。其中沈株可以擴增約1200bp的目的條帶，鑒定為陽性植株。圖3 所示為Ttl代陽性植株的PCR分子鑒定，從11株轉基因植株中鑒定出2株陽性植株。
對部分鑒定的陽性植株、陰性植株、抗病對照植株92R137和感病對照植株揚麥 158，在一葉期接種條銹菌，15天后進行表型統計和抗病性鑒定。抗病對照植株92R137對條銹菌表現高抗，葉片上產生過敏性壞死斑，無孢子生長；感病對照植株揚麥158對條銹菌表現高感，無過敏性壞死斑，葉片上布滿條銹菌孢子；轉基因Ttl代陽性植株與未轉化揚麥 158相比，條銹菌抗性水平得到顯著提高，葉片上只有少量孢子，而且葉片上產生了與抗病 92R137相似的過敏性壞死斑，這是葉片對條銹菌產生抗性的標志(圖4)。
權利要求
1.一種具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.權利要求1所述具LRR結構域的跨膜蛋白基因編碼的蛋白質TaLRR3，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.含有權利要求1所述的具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的含有具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體是以pBI220為出發載體，將權利要求1所述的TaLRR3基因插入 PBI220的BamH I和&ic I酶切位點間所得。
5.權利要求1所述的具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3在培育抗條銹病小麥品種中的應用。
6.權利要求3或4所述的含具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的表達載體在培育抗條銹病小麥品種中的應用。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，公開了一個具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3及其表達載體和應用。具LRR結構域的跨膜蛋白基因TaLRR3的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來自普通小麥(Triticum asetivum L.)92R137，為在小麥中首次報道。TaLRR3在抗條銹病小麥品種92R137中受條銹菌誘導表達增強，且表達水平遠高于在感病小麥品種揚麥158中的表達水平。將該基因插入pBI220獲得過量表達載體，并轉化感條銹病小麥品種揚麥158，T0代抗條銹病鑒定結果表明TaLRR3的過量表達可以提高感條銹病小麥品種對條銹病的抗性。
文檔編號C12N15/29GK102505016SQ20111044845
公開日2012年6月20日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者康振生, 徐磊, 曹愛忠, 王曉杰, 王秀娥, 葛帥, 蔣正寧, 邢莉萍, 陳佩度, 韓德俊 申請人:南京農業大學