專利名稱：一種檸檬明串珠菌發酵生產交替糖蔗糖酶的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檸檬明串珠菌SK24. 002發酵生產交替糖蔗糖酶的方法及應用， 屬于食品生物技術領域。
背景技術：
現今社會，人類生活節奏加快、社會競爭激烈、飲食結構改變、環境污染等，都嚴重威脅著人類的健康，使得大多數的人群都處于亞健康狀態。目前，廣大公眾對自身健康狀況日益關注，有越來越多的人選擇使用食物來改變這種狀況，從“治已病，，為主前移到“治未病”和養生保健，從“被動醫療”轉向“主動健康”。為了順應現代食品科技發展的方向并滿足消費者的健康需求，低血糖、低熱量的功能性碳水化合物已成為21世紀健康食品的發展潮流。葡聚糖蔗糖酶化111(^11811 ^%，63工(.2. 4. 1. _)，又稱葡糖基轉移酶，是催化葡糖基特異性轉移的酶，屬于淀粉水解酶GH70家族，反應類型主要有三類
(1)水角軍反應:sucrose+H20一 glucose+frucose
(2)聚合反應sucrose+glucannglucann+1+frucose
:sucrose+disaccharide/trisaccharide oligosaccharides+frucose 交替糖蔗糖酶(Alternansucrase)是一種新型的葡聚糖蔗糖酶，主要由植物細胞或微生物細胞產生，在糖代謝過程中參與蔗糖的轉移與利用。目前，交替糖蔗糖酶的研究機構主要集中在歐美國家，相關報道僅局限于酶分子核酸序列與生物學性質研究，國內在此領域研究并不多見。本發明人深入調查和研究了現有技術并對各種交替糖蔗糖酶生產方法進行了研究，最終我們發現檸檬明串珠菌發酵生產交替糖蔗糖酶的方法并能生物合成新型的功能性碳水化合物。基于上述發現提出了本發明。
發明內容
本發明的目的在于提供一種檸檬明串珠菌SK24. 002發酵生產交替糖蔗糖酶的方法及應用，屬于食品生物技術領域。本發明使用的檸檬明串珠菌是本發明人等先前從我國傳統發酵泡菜中分離得到， 其分類名為檸檬明串珠菌(Z^c0Z70lStoc citreum) SK 24. 002，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M 2011398，保藏日期2011年11月18日。本發明的技術方案一種用檸檬明串珠菌(ZemOZ7O1Stoc citreum) SK24. 002發酵生產交替糖蔗糖酶的方法，步驟為
(1)以檸檬明串珠菌(Zemo/^sioc citreum) SK24. 002為出發菌株，進行斜面、種子、 發酵三級培養；
斜面培養(g/L)葡萄糖廣5，酵母粉5 10，無水氯化鈣0. 02、. 025,磷酸氫二鉀10 15，七水合硫酸鎂0. 2 0. 5，一水合硫酸錳0. ΟΓΟ. 015，Vc 0. 03 0. 05，瓊脂20，ρΗ6· 8 7. 0，121°C滅菌20min。培養條件培養溫度30 37°C，培養時間l(Tl8h。種子培養(g/L)葡萄糖5 10，酵母粉10 20，無水氯化鈣0. 02 0. 025，磷酸氫二鉀10 15，七水合硫酸鎂0. 2 0. 5，一水合硫酸錳0. ΟΓΟ. 015，Vc 0. 03 0. 05，ρΗ6· 8 7. 0， 121°C滅菌20min。培養條件IOOmL三角瓶裝液40mL，將斜面培養后的斜面培養基按體積百分比59TlO%接入種子培養基中，培養溫度3(T37°C，搖瓶轉速160rpm，培養時間纊12h。發酵培養(g/L)蔗糖20 40，酵母粉10 20，無水氯化鈣0. 02 0. 025，磷酸氫二鉀 10 15，七水合硫酸鎂 0. 2 0. 5，吐溫 80 5 10mL/L，Vc 0. 03 0. 05，pH6. 8 7. 0，121°C 滅菌 20min。培養條件將種子培養后的種子培養基按體積百分比59TlO%接入發酵培養基中，培養溫度30 37°C，搖瓶轉速160rpm，培養時間12 24h。(2)從發酵液中分離純化得到交替糖蔗糖酶酶粉；
將步驟(1)制得的發酵液經離心或板框過濾分離發酵上清液與微生物菌體，其中發酵上清液經超濾去鹽和雜蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，離心得到沉淀1 ；微生物菌體懸浮于8M、pH5.4的脲-醋酸鈉緩沖液中，25°C下振搖廣4h，離心得到上清液，透析處理后再用 50%的聚乙二醇沉淀，離心得到沉淀2，最后將上述兩步驟所得沉淀合并冷凍干燥得到交替糖蔗糖酶酶粉。所得產品交替糖蔗糖酶酶活力達到10U/mg以上，可應用于生物合成新型具有益生元功效的新型碳水化合物，其催化底物受體包括蔗糖、乳糖、塔格糖、阿洛酮糖、雙果糖酐、麥芽糖醇、龍膽糖、異麥芽酮糖、蜜二糖、棉籽糖等中的一種或多種。本發明中交替糖蔗糖酶的活力是以生物催化產生果糖的量定義的。IU為每min產生Iymol果糖的量。酶活測定方法反應產生的果糖采用DNS (3，5 二硝基水楊酸)方法測定。本發明的有益效果檸檬明串珠菌最初來源于傳統的發酵泡菜，安全性高，且其本身為益生菌。通過液體發酵，發酵時間短，成本低，產量高。發酵產物交替糖蔗糖酶安全可靠，可直接用于合成多種具有益生元功效的新型碳水化合物。生物材料樣品保藏檸檬明串珠菌(Z洲co/rasioc citreum) SK 24. 002，保藏單位名稱中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011398，保藏日期2011年11月18日。
具體實施例方式下面結合實例進一步闡明本發明的內容，但本發明所保護的內容不僅僅局限于下面的實例。實施例1:檸檬明串珠菌發酵產酶
斜面培養葡萄糖ι g，酵母粉5g，無水氯化鈣0. 025g，磷酸氫二鉀10g，七水合硫酸鎂 0. 3g，一水合硫酸錳0. 01g, Vc 0. 05g，瓊脂20g，蒸餾水定容至IOOOmL,調節pH至6. 9。30°C 下培養1池。種子培養葡萄糖10 g，酵母粉15g，無水氯化鈣0.025g，磷酸氫二鉀10g，七水合硫酸鎂0. 3g, 一水合硫酸錳0. 01g, Vc 0. 05g,蒸餾水定容至IOOOmL,調節pH至6. 9。 IOOmL三角瓶裝液40mL，斜面培養基按5% (ν/ν)接入種子培養基中，用牛皮紙包住，30°C下 160rpm，搖床 12h。
發酵培養蔗糖20 g，酵母粉15g，無水氯化鈣0.025g，磷酸氫二鉀10g，七水合硫酸鎂0. 3g，吐溫80 10mL/L，Vc 0. 05g，蒸餾水定容至IOOOmL,調節pH6. 9。種子培養基按5% (ν/ν)接入發酵培養基中，30°C，160rpm，培養17h。測定發酵液的酶活為0. 8U/mL。實施例2 交替糖蔗糖酶酶粉的制備
將發酵液在10000g，4°C下離心IOmin收集上清液和菌體細胞，上清液用分子截留量為 30KDa的超濾膜超濾，去除鹽與雜蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，離心得到沉淀1 ；菌體細胞用PH5. 4的醋酸鈉緩沖溶液清洗兩次，加入IOmL pH5. 4，8M的脲-醋酸鈉緩沖溶液25°C 下振搖3h，經分子截留量為IOKDa的透析袋除去殘留的脲，用50%的聚乙二醇沉淀使最終聚乙二醇的濃度達到20%，離心得到沉淀2 ；沉淀1和沉淀2直接冷到干燥，即得交替糖蔗糖酶酶粉，酶活力達到18U/mg。實施例3交替糖蔗糖酶的應用
將獲得的交替糖蔗糖酶酶粉溶解于PH5. 4的醋酸鈉緩沖溶液中，使其活力達到8U/mL， 以10%的蔗糖為底物，30°C下進行酶反應48h，煮沸滅酶后，離心獲得上清液，冷凍干燥得到新型葡聚糖，產量達32 mg/mL,經NMR測定其結構為-[α -Glcp (1 — 3)- α -Glcp (1-6)]_n， 能被雙歧桿菌、乳桿菌等腸道益生菌高效增殖。本文所描述的具體實施例僅作為對本發明精神和部分實驗做舉例說明。本發明所涉領域的技術人員可以對所描述的具體實施案例做出各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發明的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。
權利要求
1.一種用檸檬明串珠菌(Zem0Z70lStoc Ciire腫)SKM. 002發酵生產交替糖蔗糖酶的方法，其特征在于(1)以檸檬明串珠菌(ZemOZ7O1Stoccitreum) SK24. 002為出發菌株，進行斜面、種子、發酵三級培養；斜面培養基以g/L計葡萄糖廣5，酵母粉5 10，無水氯化鈣0. 02、. 025，磷酸氫二鉀10 15，七水合硫酸鎂0. 2 0. 5，一水合硫酸錳0. ΟΓΟ. 015，Vc 0. 03 0. 05，瓊脂20， ρΗ6· 8 7. 0，121°C滅菌20min ；培養條件培養溫度30 37°C，培養時間l(Tl8h ；種子培養基以g/L計葡萄糖5 10，酵母粉1(Γ20，無水氯化鈣0. 02、. 025，磷酸氫二鉀10 15，七水合硫酸鎂0. 2 0. 5，一水合硫酸錳0. ΟΓΟ. 015，Vc 0. 03 0. 05，ρΗ6· 8 7. 0， 121°C滅菌20min ；培養條件100mL三角瓶裝液40mL，將斜面培養后的斜面培養基按體積百分比59TlO%接入種子培養基中，培養溫度3(T37°C，搖瓶轉速160rpm，培養時間8 1池；發酵培養基以g/L計蔗糖20 40，酵母粉10 20，無水氯化鈣0. 02、. 025，磷酸氫二鉀10 15，七水合硫酸鎂0. 2 0. 5，吐溫80 5 10mL/L，Vc 0. 03 0. 05，pH6. 8 7. 0，121°C滅菌 20min ；培養條件將種子培養后的種子培養基按體積百分比59TlO%接入發酵培養基中，培養溫度30 37°C，搖瓶轉速160rpm，培養時間12 24h ；(2)從發酵液中分離純化得到交替糖蔗糖酶酶粉；將步驟(1)制得的發酵液經離心或板框過濾分離發酵上清液與微生物菌體，其中發酵上清液經超濾去鹽和雜蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，離心得到沉淀1 ；微生物菌體懸浮于8M、pH5. 4的脲-醋酸鈉緩沖液中，25°C下振搖廣4h，離心得到上清液，透析處理后再用 50%的聚乙二醇沉淀，離心得到沉淀2，最后將上述兩步驟所得沉淀合并冷凍干燥得到交替糖蔗糖酶酶粉。
2.權利要求1所述方法生產的產品交替糖蔗糖酶，其特征在于該產品交替糖蔗糖酶酶活力達到10U/mg以上。
3.權利要求1所述方法生產的產品交替糖蔗糖酶的應用，其特征在于產品交替糖蔗糖酶應用于生物合成具有益生元功效的碳水化合物，其催化底物受體包括蔗糖、乳糖、塔格糖、阿洛酮糖、雙果糖酐、麥芽糖醇、龍膽糖、異麥芽酮糖、蜜二糖、棉籽糖中的一種或多種。
全文摘要
一種檸檬明串珠菌發酵生產交替糖蔗糖酶的方法及應用，屬于食品生物技術領域。本發明利用一株交替糖蔗糖酶產生菌檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)SK24.002進行斜面、種子、發酵三級培養，從發酵液與菌體細胞分離純化得到一種交替糖蔗糖酶酶粉。本發明提供的利用檸檬明串珠菌SK24.002生產交替糖蔗糖酶的方法，其發酵時間短、費用低，安全性能可靠，可以進行液體深層發酵以及高密度細胞培養，適合于大規模生產。本發明所產交替糖蔗糖酶酶活達到10U/mg以上。其發酵產品無毒，可以直接用于生產許多有益生元功效的新型功能性碳水化合物。
文檔編號C12R1/01GK102492673SQ201110446400
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者周榴明, 張濤, 江波, 白愛娟, 繆銘, 賈敏 申請人:江南大學