專利名稱：各類癌癥化療前耐藥基因(FBW7)mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與癌癥耐藥基因mRNA表達改變的相關檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數260萬，死亡人數近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區(qū)可能偏高，發(fā)達地區(qū)可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是I. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發(fā)明的創(chuàng)新點是提前做到預防性篩查，然后及時介入預防性調控和預防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發(fā)起的抗癌大戰(zhàn)進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗，結論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn)失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性(多態(tài)性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善(動物模型設計不科學)等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌癥的措施。癥藥物治療中的耐藥問題是個比較嚴重臨床問題。目前，臨床上有個性化基因SNP 突變點檢測，這還不夠，能夠發(fā)現一些與耐藥相關基因，查清楚突變的原因(發(fā)現與疾病相關的基因才是大方向)。有報道FBW7是腫瘤耐藥機制相關的基因?；熓悄咳缗R床上治療惡性腫瘤的最重要手段之一，然而由于腫瘤細胞常常會對化療藥物產生耐藥而導致患者對治療不再敏感，最終導致化療失敗甚至疾病復發(fā)。近年來科學家們針對腫瘤耐藥機制開展了大量的研究工作，研究結果表明腫瘤耐藥與藥物攝取減少，排出增多，活化減少，失活增加，DNA損傷修復增加，DNA甲基化以及信號傳導通路異常等多種機制相關。在最新一期的 《自然》(Nature)雜志上兩個研究小組將腫瘤的耐藥機制指向了同一基因——FBff70這一研究發(fā)現有助于腫瘤學家預測化療患者將對紫杉醇及類似活性藥物產生的藥物反應，并為癌癥治療指明了新的研究靶點。紫杉醇是目前臨床上應用最廣泛的一類化療藥物。紫杉醇可通過促進微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管導致細胞內大量微管積聚，從而最終干擾細胞的各種功能，使細胞分裂停止于有絲分裂其，阻斷細胞的正常分裂。大量研究表明紫杉醇對于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤等多種腫瘤有著廣譜的療效。然而近年來臨床亦有不少病例報道患者在接受紫杉醇治療后顯示藥物耐受，最終導致治療失敗。在第一篇論文中，Wertz和同事發(fā)現接受紫杉醇以及另一種抗微管藥物長春新堿治療后的反應細胞內的促存活蛋白MCLl顯著降低。在進一步的研究中，她們證實一種已知的腫瘤抑制因子FBW7在泛素-蛋白酶體介導的MCLl蛋白降解中發(fā)揮了關鍵性的作用。過去的研究證實FBW7缺陷與多種癌癥包括乳腺癌和結腸癌相關。Wertz等觀察到FBW7缺陷的卵巢癌和結腸癌細胞中表達高水平的MCLl蛋白，并且更易于對抗微管藥物產生耐受。在另一篇論文中，來自美國柏斯以色列狄肯尼斯醫(yī)學中心(Beth Israel Deaconess Medical Center) Wenyi Wei以及同事針對FBW7在T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)細胞中的效應進行了研究，發(fā)現FBW7缺陷的T-ALL細胞中JuruMyc及Jaddedl I蛋白呈高水平表達。 正常情況下這些蛋白高表達通常會誘導細胞發(fā)生凋亡，而FBW7缺陷的T-ALL細胞卻未表現出這一效應。Wenyi Wei與同事在進一步的研究中得到了與Wertz —樣的研究結論在缺失FBW7蛋白的情況下，細胞無法降解MCL1，從而使得細胞逃逸了凋亡。此外，Wenyi Wei和他的同事還證實了 FBW7與腫瘤藥物耐受之間的聯系。在實驗中,Wenyi Wei等嘗試用一種實驗性藥物處理FBW7缺陷的T-ALL細胞，發(fā)現細胞對藥物不敏感。而當他們利用索拉菲尼降低細胞中的MCLl水平后，發(fā)現這些細胞對實驗性藥物恢復了敏感性。弗萊德.哈欽森癌癥研究中心的腫瘤學家和分子生物學家Bruce Clurman對這一研究結果發(fā)表評論稱這是令人感到興奮的發(fā)現，但他同時強調目前取得的還僅是初步結果。他指出FWB7對腫瘤細胞中的多種蛋白均具有破壞效應，而不僅僅是MCLl?！爱斈銛_亂FBW7時，很難確定下游的哪些靶分子在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了怎樣的效應。這兩項研究重要集中研究了 FBW7對MCLl的調控作用，這有可能離完整的故事還有一定的距離，”Bruce Clurman說。阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院的腫瘤生物學家Hayley McDaid建議進一步研究紫杉醇類藥物治療癌癥患者的檔案。她認為如果Wertz等的結論確實成立的話，研究人員應致力探究FBW7與紫杉醇反應之間的相互關系?！皩@些樣本做一些序列分析是非常有必要的，”Hayley McDaid說道
將FBW7基因的mRNA作為癌癥患者化療用藥前的早期篩查有非常重要的臨床診斷意義。FBW7的mRNA在肺癌和乳腺癌化療耐藥病人中低表達或零表達，能指導臨床醫(yī)師對化療藥物篩選有重要作用。目前對FBW7基因的研究都采用高通量基因芯片、Northern Blot、蛋白譜分析技術，而這些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，而檢測mRNA比基因分析更科學(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性體現)，比蛋白分析更可靠(mRNA與蛋白轉錄有時候不同步)。根據現有的文獻資料FBW7基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。本發(fā)明人在針對創(chuàng)新性發(fā)明的要求，采用了用原位雜交技術進行檢測，結果表明肺癌和乳腺癌耐藥病人FBW7基因低表達或零表達，表明FBW7基因是癌癥耐藥相關基因。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點，但是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響(因為，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與癌癥患者化療耐藥相關基因的原位雜交檢測方法。為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術方案如下
本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針為SEQ ID NO. I所示序列，是FBW7基因中得一段序列，從200到IOOObp取得，FBW7 基因序列號AY033553，為SEQ ID NO. 2所示序列，基因的核苷酸序列長度是2063bp，⑶S是 97……1980bp。(在探針標記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用⑶S的序列來設計探針，如果CDS的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進行臨床意義的分析)。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括增強劑。本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的癌變前期FBW7基因篩查試劑盒應用價值在于，能在mRNA水平，對癌癥患者化療前耐藥基因檢測，進一步配合和指導臨床治療。本發(fā)明還提供一種FBW7基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和
(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優(yōu)選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自癌癥患者。本發(fā)明所述的檢測方法，其中優(yōu)選地是，所述的臨床各類癌癥患者化療前檢測標本。
本發(fā)明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以FBW7基因的一級轉錄功能產物mRNA為檢測對象，合成探針是FBW7基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供FBW7基因的半定量或定量表達程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，肺癌和乳腺癌病人FBW7基因低表達，即小量顯色或不顯色，FBW7基因在癌癥耐藥病人表達量都低，大部分耐藥病人零表達。在正常人群是高表達，大量細胞染色。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業(yè)內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例的方案是以FBW7基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點， 還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的FBW7 基因表達量，用來觀察癌癥患者耐藥基因的mRNA變化量，預測癌癥患者耐藥情況。因為 FBW7基因在正常人中高表達，如果癌癥患者FBW7基因表達量低，說明患者有耐藥，從而獲得癌癥患者耐藥的信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的臨床意義是化療前期檢測耐藥基因，能指導臨床醫(yī)師化療用藥。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
圖I是本發(fā)明FBW7基因原位雜交技術流程圖。圖2是本發(fā)明實施例中肺癌病人FBW7表達降低圖片。圖3是本發(fā)明實施例中乳腺癌病人FBW7表達降低圖片。 圖4是本發(fā)明實施例中正常人FBW7表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發(fā)明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護范圍。實施例I
按照常規(guī)方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以FBW7基因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種FBW7基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細胞標本選自癌癥患者。
10.FBW7基因在制備檢測各種癌癥病變原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與癌癥化療藥物耐藥有密切相關的腫瘤抑制因子FBW7基因一級轉錄產物mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測FBW7基因的表達量，能指導臨床醫(yī)師對癌癥病人實施有效治療。同時，本發(fā)明的檢測方法簡單方便，成本低，便于縣區(qū)級醫(yī)院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102605050SQ20111044299
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權日2011年12月27日
發(fā)明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司