專利名稱：一種誘導產生Ⅲ型干擾素-λ1的方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導產生III型干擾素- λ ι的方法，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
III型干擾素(IFN)是最近發現和報道的一種新的干擾素家族，具有和I、II型干擾素類似的生物學活性。IFN-λ 1是III型干擾素的一種，基因位于人類19號染色體，轉錄得到的mRNA長度為856bp，開放式閱讀框為長60;3bp。IFN- λ 1通過作用于細胞表面受體發揮其生物學活性。IFN-λΙ的受體由兩條鏈構成，第一條鏈(IFNLRl)是IFNX特異的，第二條鏈(IL10R2)是IL-IO、IL-22和IL46受體共有的。IFN-λ s結合其受體后，主要激活JAK/ STAT通路。IFN- λ 1與受體復合物結合形成三聚體使得Janus激酶(Jakl和Jak2)活化， 隨后IFN-λ Rl I⑶酪氨酸磷酸化，激活潛在的轉錄因子(STAT1和STAT2)。最終啟動下游功能基因如2，，5，-OAS 1/2, MxA和PKR等的表達。IFN- λ 1的生物學功能主要包括三個方面第一，抗病毒活性。研究證明，IFN-λ 1 具有廣譜的抗病毒效果，對多種病毒的表達和復制有明顯的抑制作用，報道的病毒類型有， 乙型肝炎病毒(HBV)單純皰疹病毒-2 (HSV-2)西尼羅河病毒和丙型肝炎病毒(HCV)水皰性口炎病毒(VSV)甲型流感病毒(IAV)和漢坦病毒(HTNV)。IFN-λ 1還能降低多種病毒的復制或病毒感染引起的細胞病變效應。第二，IFN-λ s具有抗增殖活性和抗腫瘤作用，IFN-λ 1 能夠激活宿主抗腫瘤機制以抑制某些種類的腫瘤的生長。第三，免疫調節活性。IFN-λ 1免疫調節功能包括增加NK細胞和T細胞毒性，促進Thl反應，上調腫瘤細胞中的MHC I分子而促進抗原呈遞以及介導細胞凋亡。因此，I型干擾素如IFN-α、IFN-β等在臨床上的應用已經非常廣泛，而作為一種新發現的干擾素，IFN-λ 1在臨床上的應用還未完全推廣。基于 IFN-λ 1具有和I型干擾素相似的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節作用，但卻通過不同受體起作用，因此IFN-λ 1可作為除I型干擾素外另一治療選擇。且最近的研究表明IFN-λ 1沒有明顯的免疫介導作用，與I型干擾素相比引起的毒負所用更小。因此，IFN-λ 1在臨床上的具有非常廣闊的應用前景。IFN-λ 1主要是在病原微生物感染時在宿主的免疫反應過程中被誘導表達。人類的IFN-λ 1并非組成型表達的，通常情況下該基因是不表達的。單鏈RNA病毒如甲型流感、 仙臺病毒、新城疫病毒和雙鏈DNA病毒都能誘導IFN-λ 1基因表達；細菌感染時，細菌的脂多糖也能誘導機體的免疫細胞表達該基因；最近的研究顯示屋塵螨抗原刺激的原代支氣管上皮細胞所產生的IFN-λ 1水平與病毒誘導的相當。目前在體外產生IFN-λ 1的技術方法主要是原核表達。即利用分子生物學技術克隆IFN-λ 1基因編碼序列，構建到原核表達載體，在原核細胞內進行表達。用病源微生物誘導細胞表達IFN-λ 1，提取細胞總mRNA，逆轉錄PCR成cDNA，用設計好的特異性引物進行 PCR擴增，得到該基因的編碼區基因序列，構建到原核表達載體中，用原核生物進行表達。例如，將構建好的原核表達質粒轉化進大腸桿菌，然后大量培養該細菌，用原核表達的誘導劑如IPTG誘導，細菌即可表達產生IFN-λ 1。該方法的優點是，細菌培養的設備簡單、成本低，可大量表達IFN-λ 1。但有無法避免的諸多缺點一、細菌表達的蛋白分子存在于細菌的細胞內，要想得到表達的蛋白必須破細胞，細胞裂解液中存在全部的細菌自身蛋白，要從這種混合物中分離純化才能得到較為純凈的目的蛋白；二、為了分離純化的需要，表達的分子必須融合進標簽序列，即表達出來的蛋白是目的蛋白加標簽的組合體，這種標簽會影響產物的生物學活性；三、因原核生物與真核生物基因表達系統和機制的不同，會導致表達的產物產生錯誤折疊、錯誤修飾等直接影響產物的生物學活性，甚至完全沒有生物學活性。目前，在真核細胞中誘導表達IFN-λ 1的方法非常少，且有很大的局限性。利用病源微生物或病源微生物的某一組分誘導細胞系或原代細胞可表達產生IFN-λ 1。例如，從血液中分離出單核細胞，用人源重組的粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4 (IL-4)刺激其分化為成熟的樹突狀細胞(DC)，再用A型流感病毒感染該細胞，被病毒感染的DC細胞會表達產生IFN-λ 1。用細菌的脂多糖(LPS)或模擬病毒雙鏈RNA的Poly I:C 刺激免疫細胞，如DC或PBMC，也可產生IFN- λ 1.該方法可產生具有完整生物學活性的 IFN-λ 1，其缺點是:Α、因需利用病源微生物或其致病成分作為誘導因素，應用過程中存在危險因素；B、該技術中被感染或刺激的細胞會產生復雜的天然免疫反應和炎癥反應，甚至發生凋亡，細胞在病理過程中其它的細胞因子也開始了大量表達，如腫瘤致死因子-α (TNF-α )、IFN-α、IFN-β、白介素-18 (IL-18), IFN-γ等，產生大量的雜副產物，增加了該技術的應用難度。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種在真核細胞中誘導表達IFN-λ 1的方法， 產物與現有技術相比更為較純凈。為了實現上述任務，本發明采用以下技術方案
以表達純化的人源重組白介素-32蛋白作為誘導劑，刺激人外周血單個核細胞或其衍生的細胞系用于產生干擾素-λ 1。更具體地，
從全血或血液利用后的廢棄組分中分離得到人外周血單個核細胞，并對其在體外進行培養；構建IL-32原核表達質粒，并誘導表達、純化、去內毒素；在人外周血單個核細胞培養體系中加入表達純化的人源重組白介素-32，刺激PBMC大量表達IFN-λ 1并分泌到細胞外的培養基中。作為優選的方案，IL-32蛋白的濃度在5ng/ml之上； IL-32蛋白刺激PBMC的時間在M小時之上。從血液利用后的廢棄組分中分離得到人外周血單個核細胞的過程如下
利用PBMC與血液廢棄組分中其他成分(血小板、紅細胞等)的密度不同，采用商用的人淋巴細胞分離液，用離心沉降的方法，從全血中將PBMC分離出來并洗滌。IL-32原核表達載體的構建、誘導表達、純化過程如下
設計特異性的引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，將IL-32的編碼序列構建到商用的原核表達載體petjSa中；將原核表達質粒轉化進大腸桿菌，用IPTG誘導表達IL-32.裂解細菌后，利用商用M柱純化，得到較為純凈的人源重組IL-32 ；利用商用去內毒素試劑， 除去內毒素；人源重組IL-32大小為15-27 kD,利用規格為10 kD和50 kD超濾管進行進一步的純化，得到純凈的人源重組IL-32 (圖2)。本發明在PBMC的體外培養體系中分別加入濃度分別為1、5、10 ng/ml (質量體積比)的人源重組IL-32，繼續培養M小時后，在收集到的PBMC培養基上清液中，我們采用酶聯免疫反應的方法利用商業化的IFN-λ 1檢測試劑盒，對誘導產生的IFN-λ 1蛋白絕對含量進行檢測，人源重組的IL-32濃度為5ng/ml (質量體積比)誘導M小時后，PBMC上清中IFN-λ 1含量高達160pg/ml (質量體積比)(圖5)。
誘導方法的特異性和效率檢測。將IFN-λ 1的啟動子和IL-32真核表達載體進行共轉染后發現IL-32可顯著性激活IFN-λ 1啟動子的活性，但不能激活IFN-β啟動子(圖3)。 分別用1、5、10 ng/ml (質量體積比)的人源重組IL-32刺激PBMC M小時后，收集PBMC 細胞，用TRIzoI溶解后，提取細胞總mRNA，利用IFN-λ 1特異性檢測引物進行real-time PCR,結果顯示IFN- λ 1的mRNA大量表達，當人源重組IL-32濃度為5ng/ml時，比誘導前水平高30倍以上，而IFN-α、IFN-β的mRNA水平均無明顯升高(圖4)。這說明該方法誘導 IFN- λ 1的高效性，也說明IL-32可作為的IFN-λ 1特異性誘導劑。產物活性檢測。蛋白質的多肽鏈在合成過程中折疊方式非常復雜，肽鏈合成后的空間構造受環境的影響會存在多變性，合成過程中會添加不同的修飾。無論是生物學方法誘導表達還是人工化學方法合成的蛋白質，雖然可以保證肽鏈線性序列的正確，但往往會因為技術的局限性而導致合成的蛋白分子折疊錯誤和修飾異常。這種與生物體內自然產生的蛋白相比構象和修飾不同的合成蛋白質，有的導致了降低原本的生物學活性，有的完全失去甚至出現相反的生物學活性。因此，對誘導產生的IFN-λ 1蛋白的生物學活性進行檢測是至關重要的。我們將含有誘導產生的IFN-λ 1的PBMC上清液，在乙肝病毒穩定轉染細胞系 H印G2. 2. 15中進行抗病毒實驗.與對照組實驗相比，我們的方法誘導產生的IFN-λ 1能有效抑制乙肝病毒的DNA (圖6)以及乙肝病毒抗原(圖7)的水平。我們的方法誘導產生的IFN-λ 1，在人橫紋肌肉瘤細胞系RD中能有效降低腸道病毒-71的拷貝數(圖8)，在肝細胞系Huh7. 5. 1.中能有效抑制丙肝病毒的復制(圖9)，在人胚胎腎上皮細胞系四3冊1( 中能有效抑制艾滋病毒的相對復制水平(圖10)。因此我們可以確定，該方法產生的干擾素具有天然IFN-λ 1的生物學活性。該方法盡管是在體外的條件下誘導產生IFN-λ 1，但我們采用的誘導劑是人源的IL-32，誘導表達的細胞體系采用的是從健康人體內分離出的原代細胞PBMC，產生的IFN-λ 1與人體內自然產生的蛋白來源相同，這樣不僅保證了其生物學活性的完整性，而且避免在臨床應用中出現毒副作用。至此，我們確定該方法可有效、迅速、高效地誘導IFN-λ 1基因產物的產生。我們確定了該方法產生的IFN-λ 1具有很強的生物學活性，可有效抑制多種病毒的復制和表達。IL-32刺激PBMC表達產生IFN- λ 1的獨特的分子生物學機制使該方法誘導IFN-λ 1的特異性更高，即該方法獲得的產物相對現有的方法更為純凈。以此我們首次公開這一誘導IFN-λ 1產生的新方法。IFN-λ 1作為新的一類干擾素，對其表達調控、結構、生物學功能等方面的研究突飛猛進，對其生物學功能的描述日漸清晰，抗病毒和免疫調節方面的功效已經得到證實，臨床應用前景廣闊。本發明作為一種新的誘導IFN-λ 1的方法，應用前景有(1)將人源重組IL-32作為藥劑，在體內誘導PBMC表達IFN-λ1，從而達到代替 IFN- λ 1的藥物效果；
(2)用該方法體外誘導制備高效的IFN-λ1，經提純后生產IFN-λ 1的蛋白藥劑；
(3)用人源重組IL-32作為誘導劑刺激，在體外刺激PBMC或含有PBMC的全血，再將富含IFN-λ 1的細胞培養上清、血清、活細胞作為治療藥物；
(4)體外用IL-32γ誘導PBMC或PBMC的衍生細胞系，從而產生IFN- λ 1作為藥物。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
(1)本發明采用血液制品的廢棄物中提取的PBMC，原料變廢為寶，使血液利用率達到最大，體現了環保理念，契合科學發展觀。(2)本發明利用人源重組IL-32誘導產生IFN-λ 1的特異性高，產物與其他誘導劑 (如LPS等)相比更為較純凈(圖3、4、5)。(3)本發明采用健康人的PBMC原代細胞誘導產生的IFN-λ 1蛋白分子，與人體內自然產生的IFN-λ 1完全相同，不僅保證了其完整的生物學功能，而且避免了因引入異源性的成分而導致產生毒副作用。
圖1從健康人血液中分離出的外周血單核細胞(PBMC)在體外培養時的顯微照片，左圖為物鏡10倍放大圖，右圖為物鏡40倍放大圖2原核表達純化的白介素-32 γ的純度檢測，左邊為PAGE電泳考馬斯亮藍染色，右邊為 Western Blot ；
圖3白介素-32對干擾素-λ 1、干擾素-β啟動子的誘導效果； 圖4不同濃度人源重組白介素-32處理M小時的PBMC中干擾素-λ 1、干擾素-α、干擾素-β的mRNA水平檢測結果；
圖5不同濃度人源重組白介素-32處理M小時后，PBMC分泌到細胞培養基上清中的干擾素-λ 1蛋白分子含量測定；
圖6PBMC誘導分泌的干擾素-λ 1對乙肝病毒DNA的抑制活性檢測； 圖7PBMC誘導分泌的干擾素-λ 1對乙肝病毒s和e抗原的抑制活性檢測； 圖8PBMC誘導分泌的干擾素-λ 1對腸道病毒-71拷貝數的抑制活性檢測； 圖9PBMC誘導分泌的干擾素- λ 1對丙肝病毒拷貝數的抑制活性檢測； 圖10PBMC誘導分泌的干擾素- λ 1對艾滋病毒相對復制水平的抑制活性檢測。 圖11本方法技術路線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明具體應用方法。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件，如Sambrook等編，《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor laboratory Press, 2002)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的實驗條件。技術路線如圖11所示。
一.健康人血液處理品的獲得以及PBMC的分離和培養1.從血站購買到血液利用后的處理物，其中包含了紅細胞，全部白細胞，血小板和少量的血漿。2.在15ml離心管中加入7_8ml淋巴細胞分離液(購自TBD科學公司，中國)；
3.血液制品處理物和RPMI1640等體積混勻，用滴管沿離心管管壁將7ml上述混合液緩慢疊加淋巴細胞分離液液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm，20分鐘。4.離心后管內分為三層，上層為皿漿和RPMI1640，下層主要為紅細胞和粒細胞。 中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以PBMC的白色云霧層狹窄帶。5.用小移液管吸取云霧層單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積 RPMI1640，水平離心1500rpm，10分鐘，洗滌細胞兩次。經過洗滌純化后，如圖1所示，在光學顯微鏡下視野中除PBMC細胞外，幾乎看不到雜質顆粒，即得到純凈的PBMC。6.末次離心后，棄上清，加入RPMI1640，重懸細胞，用血球計數器計算單位體積的 PBMC細胞個數。7.取IO7個細胞于一個IOcm的細胞培養皿中，并補充RPMI1640培養基至總體積為10ml，于37°C，含5% (體積比)的(X)2細胞培養箱中培養。
二、原核表達載體的構建和人源重組IL-32的原核表達和純化
1.設計特異性引物將IL-32編碼序列構建到原核表達載體pet-Wa中。構建引物序列分別為上游引物 5，-CAGCGAATTCAATGTGCTTCCCGAAGG-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 5’-GTCGAAGCTTTCATTTTGAGGATTGGG-3，(SEQ ID NO :2)。2.將構建好的原核表達載體質粒轉化進大腸桿菌BL21，(中國典型培養物保藏中心)中并進行PCR和酶切鑒定。克隆構建和轉化的具體方法和步驟見《分子克隆實驗室手冊〉〉(New York Co Id Spring Harbor laboratory Press，2002)。3.將轉化好的大腸桿菌進行大量擴增，當菌液濃度達到吸光值(OD)為2時，加入 IPTG (SIGMA公司，美國)，使其終濃度為160ug/ml (質量體積比).37°C誘導4小時。4.將所有菌液8000rpm離心，收集細菌，加200ml PBS振蕩重懸，超聲破碎細菌。5.將細菌裂解液過M柱純化，得到粗提純的IL-32蛋白。具體方法步驟見商用 Ni柱(Qiagen Germany)使用說明書。6.利用去類毒素試劑盒除去所得的蛋白里混有的內毒素。具體方法步驟見商用去內毒素試劑盒(Genmed Scientific Inc. USA)使用說明書。7.利用規格為50kD的超濾管，去除大分子量的雜質蛋白，用規格為IOkD的超濾管去除小分子雜質。具體方法步驟見商用超濾管(Millipore. USA)使用說明書。8.將得到的蛋白經PAGE電泳和Wfertern Blot檢測表達蛋白的正確性和純度。 PAGE*flfertern Blot具體方法和步驟見《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor laboratory Press,2002)
三、誘導特異性檢測
1.終濃度分別為為l、5、10ng/ml (質量體積比)人源重組IL-32，刺激PBMC細胞M小時后，收集PBMC細胞。2.提取細胞總mRNA，方法和步驟如下 1) Iml Trizol試劑溶解一個皿的PBMC ；2)按每ImlTrizol試劑加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩混勻10s，靜置lOmin，4 °C條件下， 12，000rpm，離心 15min ；
3)將上清轉移到新的1.5mL離心管中，再加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，靜置 15min, 12000rpm, 4 0C 條件下，離心 15min ；
4)移去異丙醇，用100%的乙醇洗滌沉淀一次，再加入75%(體積比)的乙醇Iml洗鹽， 4 0C 條件下，7500rpm,離心 IOmin ；
5)除去75%(體積比)的乙醇，空氣干燥5min ；
6)加入適量的DEPC處理的無菌水，溶解RNA。3.逆轉錄PCR得到cDNA。取上述處理的細胞總RNA各lPg，依次加入引物Oligo dT μ , MMLV 酶 μ ，RNase 抑制劑 μ ，MMLV 酶 10XRT-PCR 反應緩沖液 μ ，dNTP μ , 用DEPC處理水定容至20μ1，混勻。反應條件42 0C, 1 h，72 0C, lOmin，終止反應。4.將逆轉錄產物使用針對IFN-λ 1、IFN-α、IFN-β和β -actin的特異性引物進行熒光定量PCR。 IFN- λ 1引物序列為上游引物，GAGACCTCAAATATGTGG (SEQ ID NO :3)下游引物，GCATAAATAAGGTGTGGG (SEQ ID NO :4)。IFN-α 引物序列為上游引物， TTTCTCCTGCCTGAAGGACAGC SEQ ID NO :5)，下游引物，GCTCATGATTTCTGCTCTGACA(SEQ ID NO: 6)。IFN-β 引物序列為上游引物 TGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAA (SEQ ID NO 7)
下游引物，TCCTTGGCCTTCAGGTAATGCAGA (SEQ ID NO :8)。β-actin 引物序列為上游引物 GCACCACACCTTCTACAATGAG (SEQ ID NO :9)下游引物，ACAGCCTGGATGGCTACGT (SEQ ID NO :10)。反應體系sybe green Mix ΙΟμΙ, H2O 8μ1,逆轉錄產物 μ ，引物 μ 。反應條件如下95°C 5min，l 個循環；95°C 15s，55°C 15s，72°C 15s，40 個循環；95°C持續降溫至40°C。5.使用Roch software軟件進行結果分析，根據Ct值得到相對的mRNA拷貝數， 其中β-actin作為內參。四、IFN- λ 1的誘導表達和表達量的檢測
1.經細胞計數器計數后的IO7個PBMC細胞于IOcm的細胞培養皿中培養4小時，吸棄培養基，加入IOml新鮮的RPMI1640培養基培養。2.加入表達純化的人源重組IL-32，使其終濃度為5ng/ml (質量體積比)， IFN-λ 1即開始被誘導表達，并開始分泌到細胞外。Μ小時后，收集PBMC細胞培養基上清。3.酶聯免疫反應(ELISA)的方法進行檢測，或采用人IFN-λ 1檢測試劑盒進行檢測。ELISA法檢測IFN-λ 1蛋白表達量方法如下
1) PBMC細胞培養上清或者細胞裂解液樣品按1 :50(體積比)用PBS (PH 7. 4)稀釋， 取100μ1加入到ELISA板小孔中，37°C包被一小時或者4°C包被過夜。2)用PBS洗ELISA板5次(每次洗過盡量把液體拍干凈，以保證盡量洗干凈)。3)配3% (質量體積比)脫脂奶粉，用PBST溶解，按每孔100μ1加入到ELISA板上， 37°C封閉一小時或者4°C封閉過夜。4)用PBST洗5次以上。5) IFN-λ 1抗體(R & D公司，美國)用PBST按1 :500 (體積比)稀釋，每孔加 100μ1，37 —小時。
6)用PBST洗5次以上。7)辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔IgG用PBST按1 :5000稀釋，37°C半小時。8)用PBST洗5次以上。9)加酶結合物，每孔一滴，37°C半小時 10)用PBST洗5次。11)每孔分別加入顯色液A和B (Milipore公司提供的顯色試劑盒)，各一滴，37°C 避光顯色5分鐘。12)每孔加終止液(2mol/L mol體積比)一滴，酶標儀讀數。
五、誘導產生的IFN-λ 1的生物學活性檢測 IFN-λ 1活性檢測方法和步驟如下
l、5ng/ml的人源重組IL-32 γ處理PBMC細胞M小時后，收集細胞培養基上清，未處理的PBMC細胞上清也收集起來作為對照。2、將H印G2. 2. 15細胞培養基上清吸干，加入以上收集的上清，培養M小時和48 小時，后分別收集細胞和上清。細胞用于提取乙肝病毒DNA，并用Taqman法檢測乙肝病毒 DNA含量。上清用乙型肝炎s和e抗原檢測試劑盒，檢測兩種抗原的表達量，與對照組比較， 從而得出誘導的IFN-λ 1抗乙肝病毒的活性。3、將人橫紋肌肉瘤細胞系RD細胞，用腸道病毒-71感染4小時后，加入步驟1收集的細胞培養基上清，12小時后收集上清，檢測腸道病毒-71的RNA拷貝數，與對照組相比， 分析出誘導的IFN-λ 1抗腸道病毒-71的活性。4、用丙肝病毒感染人肝癌細胞系Huh7. 5. 1,24小時后吸干培養基，加入步驟1收集的細胞培養基上清，并培養M小時，收集上清，用丙肝病毒拷貝數檢測試劑盒檢測其中的丙肝病毒的拷貝數，與對照相比分析誘導的IFN-λ 1抗丙肝病毒的活性。5、在人胚胎腎上皮細胞系中轉染含有重組艾滋病毒基因組和報告基因的質粒，12 小時后，去上清，加入步驟1收集的培養基上清，培養M小時后，檢測細胞里的熒光素酶活性活性，并與對照組比較分析分析誘導的IFN-λ 1抗艾滋病毒的活性。經以上實施例的方法和步驟后，能得到說明書附圖1-10的效果，說明利用該方法快速獲得了大量具有生物學活性的IFN-λ 1。
權利要求
1.一種誘導產生IFN- λ 1的方法，其特征在于，以表達純化的人源重組白介素-32蛋白作為誘導劑，刺激人外周血單個核細胞或其衍生的細胞系用于產生干擾素-λ 1。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，從全血或血液利用后的廢棄組分中分離得到人外周血單個核細胞，并對其在體外進行培養；構建IL-32原核表達質粒，并誘導表達、純化、去內毒素；在人外周血單個核細胞培養體系中加入表達純化的人源重組白介素-32，刺激PBMC大量表達IFN- λ 1并分泌到細胞外的培養基中。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，IL-32蛋白的濃度在5ng/ml之上。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，IL-32蛋白刺激PBMC的時間在M小時之上。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，從血液利用后的廢棄組分中分離得到人外周血單個核細胞的過程如下利用PBMC與血液廢棄組分中其他成分的密度不同，采用人淋巴細胞分離液，用離心沉降的方法，從全血中將PBMC分離出來并洗滌。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，IL-32原核表達載體的構建、誘導表達、純化過程如下設計特異性的引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，將IL-32的編碼序列構建至Ij 原核表達載體petjSa中；將原核表達質粒轉化進大腸桿菌，用IPTG誘導表達IL-32.裂解細菌后，利用商用M柱純化，得到較為純凈的人源重組IL-32 ；利用商用去內毒素試劑， 除去內毒素；再利用規格為10 kD和50 kD超濾管進行進一步的純化，得到純凈的人源重組 IL-32。
全文摘要
本發明公開了一種誘導產生Ⅲ型干擾素-λ1的方法。用合適濃度的原核表達純化的人白介素-32作為誘導劑，在以人外周血單個核細胞或其衍生的細胞系的細胞模型中，誘導表達干擾素-λ1。刺激適當的時間后，該細胞的培養體系中會快速地、特異性地表達產生大量的具有生物學活性的干擾素-λ1。所產生的天然干擾素具有廣譜抗病毒活性。
文檔編號C12R1/91GK102559818SQ20111043428
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者吳建國, 朱應, 李永奎 申請人:武漢大學