表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的制作方法
專利名稱：表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的制作方法
技術領域：
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVF (其保藏號為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。
背景技術：
尼帕病腦炎是一種高度烈性人畜共患傳染病，其病原尼帕病毒屬于副粘病毒科， 亨尼帕病毒屬，同屬的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范圍非常廣泛，其中豬是重要的易感動物。尼帕病毒的自然宿主為果蝠[2]。該病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于馬來西亞首次爆發，發病例數高達265例，死亡105例，死亡率為38.5%。為了控制疾病的蔓延，馬來西亞政府屠殺了一百多萬頭豬，占該國養豬量40%。此后，該病又在印度、孟加拉等國陸續發生，而本病的致死率也呈現上升趨勢(67% -92% ) [3]。尼帕病毒給這些國家的畜牧業發展和人民健康造成了嚴重危害。我國目前雖然沒有該病爆發，但其已經對我國構成了巨大威脅。果蝠在東南亞地區廣泛分布，在我國南方地區分布較多，國內已有學者從我國南方地區的蝙蝠當中檢測到了尼帕病毒抗體的存在W]。由于我國周邊多個國家爆發該病，伴隨著貿易往來的不斷加深該病傳入我國的壓力也不斷增大。且我國養豬數量極大，養豬業已成為我國農業的重要支柱性產業之一，因此該病一旦爆發勢必會對我國的養豬業及人民群眾的正常生活和生命安全造成嚴重危害，防控形勢不容樂觀。因此，儲備可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的戰略意義。尼帕病毒的融合蛋白(F蛋白)是位于病毒粒子表面的I型跨膜糖蛋白，其主要功能是介導病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，從而使病毒基因組進入細胞。F蛋白是尼帕病毒的主要免疫保護性抗原，是誘導機體產生CTL(殺傷性T細胞)免疫反應的主要結構蛋白。 F蛋白也能使免疫動物產生中和抗體[5，6]。本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遺傳操作系統成功構建了表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒活載體疫苗-rLa-NiVF，并在小鼠和豬體內對rLa-NiVF的免疫效果進行了評價，證明此疫苗可以誘導機體產生良好的細胞和體液免疫反應，是防控尼帕腦炎病毒的優秀的候選疫苗，在我國應對尼帕病毒的潛在威脅中顯示了良好的應用前景，因而具有重要的戰略意義。
發明內容
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa-NiVF (其保藏號為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。具體地，本發明成功構建了表達尼帕病毒(Nipah virus，NiV)F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF (該疫苗株于2011年10月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，中國北京，中國科學院微生物研究所，100101)，并在小鼠和斷奶仔豬上系統評價了所述重組病毒產生的體液和細胞免疫反應。本發明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遺傳操作系統構建了表達尼帕病毒F 蛋白的重組新城疫病毒rLa-NiVF。用間接免疫熒光和特異性細胞融合實驗證實尼帕病毒 F蛋白的表達；將所述重組病毒免疫小鼠，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕腦炎病毒G/F蛋白偽型病毒粒子做中和試驗(VNA)以檢測重組病毒誘導的體液免疫水平；用流式細胞術(FACQ評價重組病毒產生的特異性細胞免疫。以rLa-NiVF免疫斷奶仔豬并檢測中和抗體水平。結果顯示，rLa-NiVF能夠正確表達尼帕病毒F蛋白。將重組病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫組小鼠可產生特異性IgG，病毒中和試驗顯示免疫小鼠可以產生針對尼帕病毒的中和抗體；流式細胞術表明免疫組小鼠能夠產生高水平的 F蛋白特異性CD8細胞免疫反應。豬免疫試驗表明，rLa-NiVF可以誘導豬產生較高水平的中和抗體。本發明的成果目前國內外均無報道，具有很強的創新性。rLa-NiVF作為一種具有前瞻性，創新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候選疫苗，對我國應對尼帕病毒潛在威脅具有重要的戰略意義。本發明提供制備表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構建重組轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉錄質粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構建轉錄輔助質粒系統，該輔助質粒系統包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷酸蛋白 (P)的cDNA序列的輔助質粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L) 的cDNA序列的輔助質粒pBSL ；(3)將步驟(1)的所述重組轉錄質粒PBRN-NiVF和步驟⑵的轉錄輔助質粒 pBSNP.pBSP.pBSL共轉染所述新城疫LaSota疫苗株復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和(4)收獲上清液，過濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。更具體地，制備表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下以人工合成的尼帕病毒F基因cDNA (SEQ ID No. 1，其編碼的F蛋白氨基酸序列為SEQ ID No. 2)為模板，利用PCR方法分別在F基因兩端插入新城疫病毒特異性基因起始和終止序列以及Riie I限制性酶切位點，測序鑒定無誤，將F基因插入到LaSota全長基因組質粒 (該質粒由本實驗室構建，構建方法可參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8， 發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭， 申請時間2005年9月2日)的P(磷蛋白)和M(基質蛋白)基因之間的Riie I位點，構建成全長重組質粒pBRN-NiVF，利用質粒提取試劑盒大量制備此重組質粒，同時以輔助質粒 pBSNP、pBSP、pBSL(所述輔助質粒的構建參見參考文獻[7])共同轉染BHK-21細胞(預先感染表達T7聚合酶的重組痘病毒)，72小時后以轉染的細胞上清接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種72小時后取接種雞胚的尿囊液做血凝試驗HA和新城疫血凝抑制試驗HI均呈陽性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重組病毒rLa-NiVF感染BHK-21細胞，并同時轉
4染表達尼帕病毒G蛋白的真核表達質粒PCAGG-NiVG，24小時后可以觀察到尼帕病毒F和G 蛋白共同表達介導的特異性細胞融合；另用鼠抗MV F蛋白單克隆抗體作一抗用間接免疫熒光檢測尼帕F蛋白在rLa-NiVF感染的BHK-21細胞中的表達，在熒光顯微鏡下可以觀察到特異性的強烈的熒光信號。細胞融合試驗與間接免疫熒光均證明重組病毒rLa-NiVF能夠正確表達尼帕病毒F蛋白。本發明所用的新城疫LaSota疫苗株為AV1615(中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，CVCC)，也由本實驗室制備，制備方法參見已獲得授權的專利申請號 200510097997. 8，發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭，申請時間2005年9月2日。本發明還提供所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株用于制備預防尼帕病腦炎的疫苗的應用，優選地，所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株為rLa-NiVF。所述應用還包括所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進行聯合免疫。本發明還提供用于預防尼帕病腦炎的疫苗，所述疫苗包含有效量的本發明所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。優選地，所述疫苗包含有效量的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF。另外，所述疫苗還可以包含藥用的佐劑或賦形劑等。本發明的用于預防尼帕病腦炎的疫苗可以用于預防哺乳動物中的尼帕病腦炎，所述哺乳動物包括，但不限于，豬、小鼠、犬，貓及馬等。本發明還提供用于預防哺乳動物中的尼帕病腦炎的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效量的包含本發明所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的疫苗，優選為rLa-NiVF。附圖簡述參考下述附圖，進一步描述本發明，在所述附圖中
圖1. rLa-NiVF的構建示意圖；圖2. rLa-NiVF感染細胞的間接免疫熒光；圖3.尼帕病毒G、F蛋白共表達形成的合胞體；圖4.重組病毒的雞胚生長曲線；圖5.最大劑量重組病毒免疫后小鼠體重變化；圖6A. rLa-NiVF免疫小鼠血清中特異性IgG水平(ng/ml)，圖6B. rLa-NiVF免疫小鼠中和抗體水平，縱坐標表示血清稀釋的倍數；圖7.重組病毒免疫小鼠的特異性⑶8細胞免疫反應；圖8.重組病毒誘導豬產生抗尼帕病毒中和抗體。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。需要說明的是，本領域技術人員應該理解，下述實施例中所用的試劑、酶類等除特別說明外，均為可從試劑公司商購的分析純級別的試劑或酶類。1材料和方法
1. 1 材料1. 1. 1:毒株與質粒新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(GenBank登錄號 AY845400. 2，由本實驗室制備，制備方法參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8， 發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭， 申請時間2005年9月2日)，表達尼帕病毒F蛋白的重組桿狀病毒rBac-NiVF[8]由本實驗室保存(其詳細的構建方法參見參考文獻8)。表達T7聚合酶的重組痘病毒VTF7-3由美國NIH的Bernard Moss博士提供，其制備與滴定過程均按文獻[9]進行，滴定后的病毒于_70°C保存備用。LaSota全長基因組轉錄質粒pBRN_FL以及輔助質粒pBSNP、pBSP、pBSL 由本實驗室制備保存[7](參考文獻7詳細說明了上述質粒的制備方法)。另外LaSota疫苗株的反向遺傳操作系統參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8，發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭，申請時間2005 年9月2日。表達尼帕病毒G和F蛋白的真核表達質粒pCAGG-NiVG和pCAGG_NiVF均由本實驗室保存[10](參考文獻10詳細說明了上述質粒的制備方法)。用于制備囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白的表達綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎假病毒粒子(VSV Δ G^GFP-NiVG/ F)的重組VSV基因組cDNA克隆質粒pVSV Δ G*GFP及輔助表達質粒pBS-G、pBS-L、pBS_N和 PBS-P由美國田納西大學Michael Whitt博士提供[11](參考文獻11詳細說明了上述質粒的制備方法)。1. 1.2 細胞和血清細胞系BHK-21，Sf9昆蟲細胞(購自美國典型培養物保藏中心ATCC)并在本實驗室使用和保存。BHK-21細胞生長及維持液為含5%胎牛血清 (FBS)的DMEM(購自Gibco) ；SF9昆蟲細胞培養液為SF900II (購自Gibco)無血清培養液。1. 1.3單克隆抗體和多肽表位尼帕病毒F蛋白特異性單克隆抗體F2G1由本實驗室制備并保存，詳細制備方法參見文獻[12]；尼帕病毒F蛋白小鼠CD8細胞表位多肽F280 (VYFPILTEI, H2Kd) (VYFPILTEI是多肽的氨基酸序列，H2Kd是指小鼠的MHC I (I型主要組織相容性復合體)單倍體基因型)，人免疫缺陷病毒Gag蛋白小鼠CD8表位多肽 (AMQMLKETI, H2Kd)由北京中科亞光公司合成并由本實驗室保存。1. 1. 4 實驗動物6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物公司。四周齡斷奶仔豬購自哈爾濱獸醫研究所實驗動物基地并由哈爾濱獸醫研究所實驗動物基地繁殖并飼養。1. 2 表達NiV F基因的病毒基因組cDNA克隆的構建以PCAGG-NiVF為模板，通過PCR引物(見表1)在尼帕病毒F基因(其基因序列為SEQ ID No. 1，所編碼的蛋白序列為SEQ ID No. 2)開放閱讀框5'端引入Riie I限制性酶切位點識別序列(GTTTAAAC)和NDV自身聚合酶L識別的轉錄終止序列GE(TTAAGAAAAAA) 及轉錄起始序列GS (ACGGGTAGAA)，在3 ‘端引入Riie I限制性酶切位點；PCR產物經測序驗證后，末端用Rne I酶切后插入pBRN-FL-Pmel (即，經過Rne I酶切的pBRN_FL質粒)，構建成的重組全長基因組cDNA克隆命名為pBRN-FL-NiVF。表1擴增NiV F插入LaSota全長基因組的PCR引物
權利要求
1.一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
2.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No. 2。
3.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的基因序列為SEQ ID No. 1。
4.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中所述用于表達F蛋白的新城疫LaSota疫苗株是AV1615。
5.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名為rLa_NiVF，保藏號為 CGMCC No. 5401。
6.一種用于預防尼帕病腦炎的疫苗，其包含有效量的權利要求1所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
7.根據權利要求6所述的疫苗，其包含有效量的權利要求5所述的重組新城疫病毒 LaSota 疫苗株 rLa_MVF。
8.權利要求1-5中任一項所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota 疫苗株用于制備預防尼帕病腦炎的疫苗的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其還包括所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進行聯合免疫。
10.構建表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構建重組轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉錄質粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構建轉錄輔助質粒系統，該輔助質粒系統包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的 cDNA序列的輔助質粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列的輔助質粒PBSL;(3)將步驟(1)的所述重組轉錄質粒pBRN-NiVF和步驟的轉錄輔助質粒pBSNP、 pBSP、pBSL共轉染所述新城疫LaSota疫苗株復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和(4)收獲上清液，過濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。
全文摘要
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏號為CGMCC No.5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。
文檔編號C12R1/93GK102533675SQ20111043189
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者步志高, 溫志遠, 葛金英 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
技術領域：
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa_NiVF (其保藏號為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。
背景技術：
尼帕病腦炎是一種高度烈性人畜共患傳染病，其病原尼帕病毒屬于副粘病毒科， 亨尼帕病毒屬，同屬的只有亨德拉病毒[1]。尼帕病毒宿主范圍非常廣泛，其中豬是重要的易感動物。尼帕病毒的自然宿主為果蝠[2]。該病于1998年9月下旬至1999年6月中旬于馬來西亞首次爆發，發病例數高達265例，死亡105例，死亡率為38.5%。為了控制疾病的蔓延，馬來西亞政府屠殺了一百多萬頭豬，占該國養豬量40%。此后，該病又在印度、孟加拉等國陸續發生，而本病的致死率也呈現上升趨勢(67% -92% ) [3]。尼帕病毒給這些國家的畜牧業發展和人民健康造成了嚴重危害。我國目前雖然沒有該病爆發，但其已經對我國構成了巨大威脅。果蝠在東南亞地區廣泛分布，在我國南方地區分布較多，國內已有學者從我國南方地區的蝙蝠當中檢測到了尼帕病毒抗體的存在W]。由于我國周邊多個國家爆發該病，伴隨著貿易往來的不斷加深該病傳入我國的壓力也不斷增大。且我國養豬數量極大，養豬業已成為我國農業的重要支柱性產業之一，因此該病一旦爆發勢必會對我國的養豬業及人民群眾的正常生活和生命安全造成嚴重危害，防控形勢不容樂觀。因此，儲備可以有效防控尼帕病毒的疫苗具有非常重要的戰略意義。尼帕病毒的融合蛋白(F蛋白)是位于病毒粒子表面的I型跨膜糖蛋白，其主要功能是介導病毒囊膜與宿主細胞膜的融合，從而使病毒基因組進入細胞。F蛋白是尼帕病毒的主要免疫保護性抗原，是誘導機體產生CTL(殺傷性T細胞)免疫反應的主要結構蛋白。 F蛋白也能使免疫動物產生中和抗體[5，6]。本研究利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遺傳操作系統成功構建了表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒活載體疫苗-rLa-NiVF，并在小鼠和豬體內對rLa-NiVF的免疫效果進行了評價，證明此疫苗可以誘導機體產生良好的細胞和體液免疫反應，是防控尼帕腦炎病毒的優秀的候選疫苗，在我國應對尼帕病毒的潛在威脅中顯示了良好的應用前景，因而具有重要的戰略意義。
發明內容
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株rLa-NiVF (其保藏號為CGMCC No. 5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。具體地，本發明成功構建了表達尼帕病毒(Nipah virus，NiV)F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF (該疫苗株于2011年10月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，中國北京，中國科學院微生物研究所，100101)，并在小鼠和斷奶仔豬上系統評價了所述重組病毒產生的體液和細胞免疫反應。本發明采用新城疫病毒LaSota弱毒株反向遺傳操作系統構建了表達尼帕病毒F 蛋白的重組新城疫病毒rLa-NiVF。用間接免疫熒光和特異性細胞融合實驗證實尼帕病毒 F蛋白的表達；將所述重組病毒免疫小鼠，用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和水泡性口炎病毒囊膜嵌合尼帕腦炎病毒G/F蛋白偽型病毒粒子做中和試驗(VNA)以檢測重組病毒誘導的體液免疫水平；用流式細胞術(FACQ評價重組病毒產生的特異性細胞免疫。以rLa-NiVF免疫斷奶仔豬并檢測中和抗體水平。結果顯示，rLa-NiVF能夠正確表達尼帕病毒F蛋白。將重組病毒免疫Balb/c小鼠，ELISA表明免疫組小鼠可產生特異性IgG，病毒中和試驗顯示免疫小鼠可以產生針對尼帕病毒的中和抗體；流式細胞術表明免疫組小鼠能夠產生高水平的 F蛋白特異性CD8細胞免疫反應。豬免疫試驗表明，rLa-NiVF可以誘導豬產生較高水平的中和抗體。本發明的成果目前國內外均無報道，具有很強的創新性。rLa-NiVF作為一種具有前瞻性，創新性，并且高效安全的防控尼帕病毒的候選疫苗，對我國應對尼帕病毒潛在威脅具有重要的戰略意義。本發明提供制備表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構建重組轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉錄質粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構建轉錄輔助質粒系統，該輔助質粒系統包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷酸蛋白 (P)的cDNA序列的輔助質粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L) 的cDNA序列的輔助質粒pBSL ；(3)將步驟(1)的所述重組轉錄質粒PBRN-NiVF和步驟⑵的轉錄輔助質粒 pBSNP.pBSP.pBSL共轉染所述新城疫LaSota疫苗株復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和(4)收獲上清液，過濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。更具體地，制備表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法描述如下以人工合成的尼帕病毒F基因cDNA (SEQ ID No. 1，其編碼的F蛋白氨基酸序列為SEQ ID No. 2)為模板，利用PCR方法分別在F基因兩端插入新城疫病毒特異性基因起始和終止序列以及Riie I限制性酶切位點，測序鑒定無誤，將F基因插入到LaSota全長基因組質粒 (該質粒由本實驗室構建，構建方法可參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8， 發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭， 申請時間2005年9月2日)的P(磷蛋白)和M(基質蛋白)基因之間的Riie I位點，構建成全長重組質粒pBRN-NiVF，利用質粒提取試劑盒大量制備此重組質粒，同時以輔助質粒 pBSNP、pBSP、pBSL(所述輔助質粒的構建參見參考文獻[7])共同轉染BHK-21細胞(預先感染表達T7聚合酶的重組痘病毒)，72小時后以轉染的細胞上清接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，接種72小時后取接種雞胚的尿囊液做血凝試驗HA和新城疫血凝抑制試驗HI均呈陽性，初步表明病毒拯救成功。以拯救得到的重組病毒rLa-NiVF感染BHK-21細胞，并同時轉
4染表達尼帕病毒G蛋白的真核表達質粒PCAGG-NiVG，24小時后可以觀察到尼帕病毒F和G 蛋白共同表達介導的特異性細胞融合；另用鼠抗MV F蛋白單克隆抗體作一抗用間接免疫熒光檢測尼帕F蛋白在rLa-NiVF感染的BHK-21細胞中的表達，在熒光顯微鏡下可以觀察到特異性的強烈的熒光信號。細胞融合試驗與間接免疫熒光均證明重組病毒rLa-NiVF能夠正確表達尼帕病毒F蛋白。本發明所用的新城疫LaSota疫苗株為AV1615(中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，CVCC)，也由本實驗室制備，制備方法參見已獲得授權的專利申請號 200510097997. 8，發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭，申請時間2005年9月2日。本發明還提供所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株用于制備預防尼帕病腦炎的疫苗的應用，優選地，所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株為rLa-NiVF。所述應用還包括所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進行聯合免疫。本發明還提供用于預防尼帕病腦炎的疫苗，所述疫苗包含有效量的本發明所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。優選地，所述疫苗包含有效量的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF。另外，所述疫苗還可以包含藥用的佐劑或賦形劑等。本發明的用于預防尼帕病腦炎的疫苗可以用于預防哺乳動物中的尼帕病腦炎，所述哺乳動物包括，但不限于，豬、小鼠、犬，貓及馬等。本發明還提供用于預防哺乳動物中的尼帕病腦炎的方法，所述方法包括給所述哺乳動物施用有效量的包含本發明所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的疫苗，優選為rLa-NiVF。附圖簡述參考下述附圖，進一步描述本發明，在所述附圖中
圖1. rLa-NiVF的構建示意圖；圖2. rLa-NiVF感染細胞的間接免疫熒光；圖3.尼帕病毒G、F蛋白共表達形成的合胞體；圖4.重組病毒的雞胚生長曲線；圖5.最大劑量重組病毒免疫后小鼠體重變化；圖6A. rLa-NiVF免疫小鼠血清中特異性IgG水平(ng/ml)，圖6B. rLa-NiVF免疫小鼠中和抗體水平，縱坐標表示血清稀釋的倍數；圖7.重組病毒免疫小鼠的特異性⑶8細胞免疫反應；圖8.重組病毒誘導豬產生抗尼帕病毒中和抗體。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明。但是應該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發明的范圍和精神。需要說明的是，本領域技術人員應該理解，下述實施例中所用的試劑、酶類等除特別說明外，均為可從試劑公司商購的分析純級別的試劑或酶類。1材料和方法
1. 1 材料1. 1. 1:毒株與質粒新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株(GenBank登錄號 AY845400. 2，由本實驗室制備，制備方法參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8， 發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭， 申請時間2005年9月2日)，表達尼帕病毒F蛋白的重組桿狀病毒rBac-NiVF[8]由本實驗室保存(其詳細的構建方法參見參考文獻8)。表達T7聚合酶的重組痘病毒VTF7-3由美國NIH的Bernard Moss博士提供，其制備與滴定過程均按文獻[9]進行，滴定后的病毒于_70°C保存備用。LaSota全長基因組轉錄質粒pBRN_FL以及輔助質粒pBSNP、pBSP、pBSL 由本實驗室制備保存[7](參考文獻7詳細說明了上述質粒的制備方法)。另外LaSota疫苗株的反向遺傳操作系統參見已獲得授權的專利申請號200510097997. 8，發明名稱為“新城疫LaSota疫苗株反向遺傳操作系統及其應用”，發明人步志高，陳化蘭，申請時間2005 年9月2日。表達尼帕病毒G和F蛋白的真核表達質粒pCAGG-NiVG和pCAGG_NiVF均由本實驗室保存[10](參考文獻10詳細說明了上述質粒的制備方法)。用于制備囊膜嵌合尼帕病毒G和F蛋白的表達綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎假病毒粒子(VSV Δ G^GFP-NiVG/ F)的重組VSV基因組cDNA克隆質粒pVSV Δ G*GFP及輔助表達質粒pBS-G、pBS-L、pBS_N和 PBS-P由美國田納西大學Michael Whitt博士提供[11](參考文獻11詳細說明了上述質粒的制備方法)。1. 1.2 細胞和血清細胞系BHK-21，Sf9昆蟲細胞(購自美國典型培養物保藏中心ATCC)并在本實驗室使用和保存。BHK-21細胞生長及維持液為含5%胎牛血清 (FBS)的DMEM(購自Gibco) ；SF9昆蟲細胞培養液為SF900II (購自Gibco)無血清培養液。1. 1.3單克隆抗體和多肽表位尼帕病毒F蛋白特異性單克隆抗體F2G1由本實驗室制備并保存，詳細制備方法參見文獻[12]；尼帕病毒F蛋白小鼠CD8細胞表位多肽F280 (VYFPILTEI, H2Kd) (VYFPILTEI是多肽的氨基酸序列，H2Kd是指小鼠的MHC I (I型主要組織相容性復合體)單倍體基因型)，人免疫缺陷病毒Gag蛋白小鼠CD8表位多肽 (AMQMLKETI, H2Kd)由北京中科亞光公司合成并由本實驗室保存。1. 1. 4 實驗動物6周齡雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物公司。四周齡斷奶仔豬購自哈爾濱獸醫研究所實驗動物基地并由哈爾濱獸醫研究所實驗動物基地繁殖并飼養。1. 2 表達NiV F基因的病毒基因組cDNA克隆的構建以PCAGG-NiVF為模板，通過PCR引物(見表1)在尼帕病毒F基因(其基因序列為SEQ ID No. 1，所編碼的蛋白序列為SEQ ID No. 2)開放閱讀框5'端引入Riie I限制性酶切位點識別序列(GTTTAAAC)和NDV自身聚合酶L識別的轉錄終止序列GE(TTAAGAAAAAA) 及轉錄起始序列GS (ACGGGTAGAA)，在3 ‘端引入Riie I限制性酶切位點；PCR產物經測序驗證后，末端用Rne I酶切后插入pBRN-FL-Pmel (即，經過Rne I酶切的pBRN_FL質粒)，構建成的重組全長基因組cDNA克隆命名為pBRN-FL-NiVF。表1擴增NiV F插入LaSota全長基因組的PCR引物
權利要求
1.一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
2.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No. 2。
3.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中尼帕腦炎病毒F蛋白的基因序列為SEQ ID No. 1。
4.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其中所述用于表達F蛋白的新城疫LaSota疫苗株是AV1615。
5.根據權利要求1所述的重組新城疫病毒LaSota疫苗株，其命名為rLa_NiVF，保藏號為 CGMCC No. 5401。
6.一種用于預防尼帕病腦炎的疫苗，其包含有效量的權利要求1所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株。
7.根據權利要求6所述的疫苗，其包含有效量的權利要求5所述的重組新城疫病毒 LaSota 疫苗株 rLa_MVF。
8.權利要求1-5中任一項所述的表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota 疫苗株用于制備預防尼帕病腦炎的疫苗的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其還包括所述表達尼帕病毒F蛋白的重組新城疫病毒 LaSota疫苗株與表達尼帕病毒G蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株進行聯合免疫。
10.構建表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株的方法，所述方法包括下述步驟(1)構建重組轉錄質粒，該轉錄質粒包括其中插入尼帕病毒F基因的所述新城疫 LaSota疫苗株的基因組cDNA序列，將所述重組轉錄質粒命名為pBRN_NiVF ；(2)構建轉錄輔助質粒系統，該輔助質粒系統包括編碼所述新城疫LaSota疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列的輔助質粒pBSNP、編碼所述新城疫LaSota疫苗株的磷蛋白(P)的 cDNA序列的輔助質粒pBSP、和編碼所述新城疫LaSota疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列的輔助質粒PBSL;(3)將步驟(1)的所述重組轉錄質粒pBRN-NiVF和步驟的轉錄輔助質粒pBSNP、 pBSP、pBSL共轉染所述新城疫LaSota疫苗株復制許可的宿主細胞，培養轉染后的宿主細胞；和(4)收獲上清液，過濾后接種雞胚尿囊腔拯救重組病毒株。
全文摘要
本發明提供一種表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株及其制備方法和應用。具體而言，本發明提供表達尼帕腦炎病毒F蛋白的重組新城疫病毒LaSota疫苗株rLa-NiVF(其保藏號為CGMCC No.5401)及其在制備用于預防尼帕病腦炎的疫苗中的應用。
文檔編號C12R1/93GK102533675SQ20111043189
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者步志高, 溫志遠, 葛金英 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
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0訪客 來自[中國] 2023年12月16日 23:45個人感染了尼帕病毒可以用這種藥嗎？謝謝
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