制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法

專利名稱：制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條(strip)的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐試紙條的方法，該方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結(jié)合物并通過真空轉(zhuǎn)移將該結(jié)合物固定到多孔固體支撐上。
背景技術(shù)：
在確定疾病的遺傳因素、治療的恰當(dāng)性、生物鑒定等中利用核苷酸診斷。通常，用于分析從細(xì)菌或細(xì)胞分離的核苷酸樣品或者通過核苷酸聚合擴(kuò)增該樣品而獲得的產(chǎn)物中的特定核苷酸序列的技術(shù)被用于證實(shí)核苷酸的存在，該技術(shù)采用具有與要被分析的部分核苷酸特異性連接的互補(bǔ)堿基序列的核苷酸片段(即，核苷酸探針)，這基于它們之間的確存在連接。目前使用的用于分析特定核苷酸序列的方法的實(shí)例包括通過將探針粘附到微孔板表面的特定核苷酸探針與要被分析的核苷酸的雜交，包括在膜上固定探針并向其加入擴(kuò)增的核苷酸的特定核苷酸探針與核苷酸的雜交(逆向點(diǎn)/線印跡雜交)，以及包括在由如玻璃的材料制成的板上固定多種探針并向其加入擴(kuò)增的核苷酸的核苷酸雜交(DNA芯片)等寸。為了制備用于核苷酸雜交的診斷條，需要一種用于在固體支撐上固定核苷酸探針的方法。具體地，物理吸附、紫外線(UV)照射和包括共價(jià)連接的化學(xué)連接是將核苷酸粘附到固體支撐上的最常用的方法(參考R Lutgarde等人，Applied EnvironmentalMicrobiology,62，300-303，1996)。物理吸附是在固體表面物理吸附生物分子的方法，其在體外診斷中引起了極大的關(guān)注。生物分子被吸附到固體相的機(jī)制并不清楚。實(shí)際上，可能涉及到生物分子與表面之間的相互作用。這種相互作用可能通過5個(gè)步驟發(fā)生，S卩，1)分子向表面移動(dòng)，2)其吸附在表面，3)吸附分子的重排，4)吸附分子的潛在解吸附作用(latent desporption)，以及5)吸附分子離開表面的運(yùn)動(dòng)(參考W Norde，Advances in Colloid and InterfaceScience,25，267-340，1986)。該概要提示解吸附作用是潛在地固有的，但是，實(shí)際上，當(dāng)分子足夠大時(shí)，結(jié)合不可逆地發(fā)生(參考AW Adamson, “ The Solid-liquid Interface =Adsorption FromSolution " , in Physical chemistry of surfaces,5th ed. (Chichester, UK :ffiley,1990),421-459)。該行為的原因是，由于結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量隨著分子量的增加而增加，因此盡管一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)從表面解離，但其余的多個(gè)位點(diǎn)仍然保持結(jié)合狀態(tài)。就此而言，有報(bào)道稱核苷酸表現(xiàn)出與蛋白質(zhì)相同的作用。盡管核苷酸的結(jié)合力比蛋白質(zhì)的低，但大的核苷酸與膜結(jié)合良好。
但是，物理吸附存在的嚴(yán)重問題是固定在表面的核苷酸被重排并因此可能具有不適于與任何引入的堿基序列相互作用的構(gòu)造。具有長的堿基序列的核苷酸不會遇到問題，但當(dāng)核苷酸的堿基序列變短時(shí)，潛在活性的降低會成為嚴(yán)重的問題。當(dāng)堿基沒有保持能與溶液相互作用的游離形式并被固定在表面上時(shí)，由于變形的結(jié)構(gòu)，雜交不能正常發(fā)生。此外，核苷酸探針具有的分子大小對于直接施用真空轉(zhuǎn)移來說是小的，并且核苷酸探針具有的物理力(靜電力、疏水性相互作用等)對于將探針吸附到多孔固體支撐上來說也是相對弱的，因此，將核苷酸探針固定到多孔固體支撐上時(shí)相當(dāng)困難的。因?yàn)檫@個(gè)原因，除非進(jìn)行另外的固定，否則核苷酸探針可能未被均勻地涂覆，并且在檢驗(yàn)過程中會容易地解吸附，因此核苷酸探針在應(yīng)用于需要優(yōu)良的再現(xiàn)性和高敏感性的分子診斷的雜交檢驗(yàn)中是不利地?zé)o效的?？紤]到這些問題，廣泛地應(yīng)用采用UV的方法。UV交聯(lián)是將核苷酸探針與尼龍膜共價(jià)結(jié)合的最簡單的方法之一。連接主要通過胸腺嘧啶殘基(其他核苷出現(xiàn)得不是這么頻繁)來進(jìn)行。當(dāng)胸腺嘧啶殘基被激活時(shí)，它們與存在于尼龍膜上的胺反應(yīng)(GM Church and W Gilbert,PNAS,81,1991-1995,1984 ；I Saito等人，Tetrahedron Letters, 22, 3265-3268，1981)。這些堿基中的一部分與膜表面共價(jià)連接，因此在雜交過程中不參與反應(yīng)。當(dāng)膜過度暴露于UV時(shí)，UV連接必然會干擾雜交。因此，重要的是正確地確定UV的照射量。換言之，當(dāng)將膜暴露于少量的UV時(shí)，未進(jìn)行有效的交聯(lián)，而當(dāng)將膜暴露于過量的UV時(shí)，雜交的效率下降。同時(shí)，與膜的UV照射相關(guān)的一個(gè)重要方面是膜水含量。水吸收UV，并且干燥步驟中的偏差造成交聯(lián)發(fā)生的水平高于或低于預(yù)期。就此而言，膜的UV照射存在的問題是，通過胸腺嘧啶堿基控制交聯(lián)水平具有相當(dāng)?shù)碾y度。同時(shí)，將可光敏化的化合物用于膜或探針的技術(shù)是改良的交聯(lián)方法(參考JKVeilleux and Lff Duran, IVD Technology 2，no. 2，洸_31，1996)。當(dāng)可光敏化的化合物(例如，光生物素)用于探針時(shí)，它們使探針具有正確的取向(方向性)和自由度，但很少應(yīng)用它們，因?yàn)樵趯⑵浔┞队赨V照射時(shí)常常會發(fā)生不可控的反應(yīng)。共價(jià)連接作為采用常規(guī)化學(xué)方法將核苷酸探針固定到固體支撐表面的方法獲得了關(guān)注。胺、羰基、羧基和巰基是多種化學(xué)連接方法中最常使用的。共價(jià)連接能夠控制探針取向，受控的化學(xué)連接在通過末端殘基控制核苷酸的同時(shí)使核苷酸發(fā)生粘附，并且通過引入具有合適大小的間隔可以進(jìn)行使固定的核苷酸與任何加入的探針的自由雜交(free hybridization)。探針和固體支撐等之間的共價(jià)連接通常應(yīng)用于微點(diǎn)陣系統(tǒng)，S卩，如玻璃片、小球等的形式，并且也可以應(yīng)用于如膜的多孔固體支撐。但是，采用探針和膜之間的直接共價(jià)連接的常規(guī)技術(shù)通常限于胺標(biāo)記的探針與被羧基活化(采用碳化二亞胺(如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC)試劑))的膜之間的共價(jià)連接。此外，以在膜上控制的連接的形式將核苷酸探針固定到膜上的方法本質(zhì)上是分批過程，其難以用于大規(guī)模生產(chǎn)和自動(dòng)化處理。此外，這些方法需要長時(shí)間周期和高成本。如上所述，由于與用于核苷酸雜交檢驗(yàn)的核苷酸探針涂覆的膜條的生產(chǎn)相關(guān)的物理和化學(xué)優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，能以簡單且快速的方式進(jìn)行正常雜交膜條的大規(guī)模生產(chǎn)受到限制。因此，為了在診斷領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)基于膜的核苷酸測試的廣泛應(yīng)用，對開發(fā)解決常規(guī)問題并因此確保可制造性的膜條的需要日益增加。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，考慮到上述問題而完成了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法通過使核苷酸探針與載體結(jié)合而能夠確保核苷酸探針的取向，避免固定到固體支撐表面上的核苷酸的重排，并且，由于要與靶堿基序列互補(bǔ)連接的探針的雜交堿基序列的一部分未被固定，從而防止了因降低的活性而發(fā)生的異常雜交。本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法有效地避免了在常規(guī)方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于該方法不采用常規(guī)方法(其中通過化學(xué)連接固定核苷酸探針)本身所需要的分批過程，因此實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)和自動(dòng)化處理。本發(fā)明的又一個(gè)目的為提供一種制備核苷酸探針檢驗(yàn)系統(tǒng)的方法，該方法采用低成本通過大規(guī)模生產(chǎn)以簡單的方式來快速實(shí)現(xiàn)，該方法具有再現(xiàn)性，防止膜表面干擾相互作用從而有利于靶堿基序列與核苷酸探針之間的雜交，并且表現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性和敏感性。技術(shù)方案因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結(jié)合物以及通過真空轉(zhuǎn)移將該結(jié)合物固定到多孔固體支撐上。對于應(yīng)用于體外診斷核苷酸實(shí)驗(yàn)的雜交，有多種方法用于將核苷酸探針固定到如膜的多孔固體支撐上，并且應(yīng)該在考慮多種因素的情況下識別這些方法。因此，就與檢驗(yàn)的性能和制備方法的方便性有關(guān)的結(jié)合效率而言，必然存在優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。以最低的成本用最容易的方式實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)是最重要的方面。就此而言，根據(jù)本發(fā)明的制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法通過將核苷酸探針與載體結(jié)合而有效地確保核苷酸探針的取向，避免固定在固體支撐上的核苷酸的重排，并且，由于要與靶堿基序列互補(bǔ)連接的探針的雜交堿基序列的一部分未被固定，從而防止了因降低的活性而發(fā)生的異常雜交。此外，所述方法有效地避免了在常規(guī)方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于該方法不采用化學(xué)連接本身所需的分批過程，因此實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)和自動(dòng)化處理。所述核苷酸探針包括正義(正向)和反義(反向)核苷酸，其中包括DNA、RNA、 PNA(肽核苷酸)等正義靶基因序列。包括大片段0嫩、短DNA(包括cDNA) ,RNA和肽核苷酸(PNA)的四種類型的核苷酸探針可被固定到固體相上用于快速檢驗(yàn)的目的。這些用于固定不同分子的方法具有相同的性質(zhì)，但實(shí)際上由于分子結(jié)構(gòu)和大小的不同而彼此不同。用于在固體上固定大片段DNA的方法從不用于診斷試驗(yàn)，通常是用在固體上固定較短DNA序列的方法來代替。在此使用的核苷酸探針與載體之間的連接優(yōu)選化學(xué)結(jié)合，并且化合物學(xué)結(jié)合包括共價(jià)結(jié)合以及如離子相互作用和氫鍵的非共價(jià)結(jié)合。其中，優(yōu)選共價(jià)結(jié)合。可以使用通過親和結(jié)合的連接，盡管其不是共價(jià)連接，但表現(xiàn)出與共價(jià)連接相當(dāng)?shù)膹?qiáng)結(jié)合力。最常使用的是與親和結(jié)合相關(guān)的生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白鏈菌素固定技術(shù)，其能夠以 10-1 的結(jié)合常數(shù)形成強(qiáng)鍵。此外，在探針和固體支撐之間可以使用具有強(qiáng)親和結(jié)合力的谷胱甘肽-GST (谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)、組氨酸-金屬離子(Co、Ni、Cu)、 麥芽糖-MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白)、凝集素(例如，伴刀豆蛋白)-甘露糖/葡萄糖結(jié)合蛋白的偶聯(lián)。因此，為了使所有核苷酸探針的全部堿基序列參與雜交，優(yōu)選可以向核苷酸探針引入官能團(tuán)從而將探針與載體共價(jià)結(jié)合并且可以引入配體以實(shí)現(xiàn)核苷酸探針與載體之間的親和結(jié)合。使用如下所述的多種官能團(tuán)能夠完成實(shí)現(xiàn)核苷酸探針與固體支撐之間的共價(jià)連接的表面修飾羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中R表示H或C1-C6烷基)、 氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛(-CH0)、羥基(-0H)、環(huán)氧基、巰基等(參考2005 & 2010 Integrated DNATechnologies,Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports) 0這些官能團(tuán)可以單獨(dú)或者以兩種以上類型的組合使用。同時(shí)，用于實(shí)現(xiàn)核苷酸探針與固體支撐之間親和偶聯(lián)的技術(shù)可以通過如生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白鏈菌素、谷胱甘肽-GST、組氨酸-金屬離子、凝集素-糖蛋白、抗體-抗原等的多種系統(tǒng)來進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在氨基修飾的核苷酸探針的情況下，氨基直接連接到核苷酸探針上，或者通過帶有短碳鏈的氨基C6接頭(linker)或氨基C12接頭來連接。此外，在核苷酸探針的固定技術(shù)中，通過末端基團(tuán)的反應(yīng)最有效并且連接基團(tuán)優(yōu)選引入到核苷酸的5’或3’ -活性末端基團(tuán)。因此，核苷酸探針的5’ -端或3’ -端可以用能與載體共價(jià)結(jié)合的官能團(tuán)來修飾。 核苷酸探針的修飾可以在核苷酸探針的制備過程中或者在將其用于膜之前在溶液狀態(tài)中進(jìn)行。此外，核苷酸探針可以為，例如包括16至22個(gè)核苷酸的合成的低聚核苷酸。具體地，在能夠檢測結(jié)核分枝桿菌(TB)并識別對利福平和異煙胼的耐藥性的核苷酸探針的情況下，可以使用靶向?qū)Y(jié)核分枝桿菌菌種具有特異性的轉(zhuǎn)錄間間隔區(qū)(ITS， intertranscriptional spacer)基因位點(diǎn)的核苷酸探針用于識別結(jié)核分枝桿菌。為了確定對如利福平的抗結(jié)核藥物的敏感性和耐藥性，可以使用包含編碼RNA聚合酶β亞單位的基因的野生型-或突變型堿基序列的核苷酸探針。此外，為了確定對異煙胼的敏感性和耐藥性，也可以使用含有編碼katG(過氧化氫酶過氧化物酶)的基因位點(diǎn)以及inhA(烯酰基載體蛋白(ACP)還原酶)和ahpC(烷基過氧化物還原酶)的啟動(dòng)子位點(diǎn)的野生型或突變型堿基序列的核苷酸探針。同時(shí)，當(dāng)使用核苷酸探針來區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌(NTM)和結(jié)核分枝桿菌(TB)的菌種時(shí)，也可以使用靶向分枝桿菌屬特異性的轉(zhuǎn)錄間間隔區(qū)(ITS)基因位點(diǎn)的核苷酸探針。此外，所述核苷酸探針優(yōu)選含有能被分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)或化學(xué)方式直接或間接檢測的標(biāo)記，并且在內(nèi)部區(qū)域可以進(jìn)一步含有間隔區(qū)以提高雜交位點(diǎn)內(nèi)堿基序列(其能夠與靶堿基序列互補(bǔ)地結(jié)合)與載體之間的雜交效率。標(biāo)記的實(shí)例包括酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、放射性同位素(例如，32P)、熒光分子和化學(xué)基團(tuán)(例如，生物素)等。所述間隔區(qū)優(yōu)選為非特異性的聚T尾，其可以加在氨基修飾位點(diǎn)之后。作為間隔區(qū)使用的聚T尾的長度可為5至30個(gè)胸腺嘧啶堿基。例如，可將核苷酸探針設(shè)計(jì)成在5’ -端標(biāo)記氨基C6接頭，將作為間隔區(qū)的包括 10個(gè)胸腺嘧啶堿基的聚T尾與其連接，以及能與靶基因的核苷酸序列互補(bǔ)連接的雜交位點(diǎn)的堿基序列包括16至22個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中，所述載體可為，例如多糖、蛋白質(zhì)、合成聚合物等。其中，優(yōu)選多糖，并且特備優(yōu)選與核苷酸探針共價(jià)連接或親和結(jié)合的葡聚糖或其衍生物。在親和結(jié)合的情況下，例如，抗生物素/抗生物素蛋白鏈菌素、麥芽糖結(jié)合蛋白、 糖蛋白或金屬離子(Co、Ni、Cu等)等與載體連接，并且將能與其親和結(jié)合的作為配體的生物素、麥芽糖、凝集素、組氨酸或其衍生物標(biāo)記在核苷酸探針上。其中，更優(yōu)選生物素-抗生物素/抗生物素蛋白鏈菌素連接技術(shù)。由于葡聚糖具有多種活性基團(tuán)，所以每個(gè)葡聚糖分子能夠固定多個(gè)DNA探針，因此能夠固定多種配體，例如天門冬氨酸和低聚核苷酸(參考GoSS，Τ. Α.等人， J.Chromatogr. 508,279-287,1990 ；Schacht Ε. H ^ A, Modification of Dextran and application in prodrug design. In Industrial polysaccharide Engineering Genetic Engineering, Structure/Property Relations and Applications Yalpani, Μ. , Ed.； Elsevier Amsterdam, 1987)。此外，葡聚糖是長的且柔性的聚合物，因此相當(dāng)有利于促進(jìn)固定的DNA分子的雜交，消除因固體支撐的表面引起的空間位阻(參考=Goris J.等人，Can J Microbiol, 44,1148-1153,1998 ；Shepinov Μ· S等人，Nucleic Acids Res.，25，1155-1161， 1999 ；Gingeras Τ. R等人，15，p. 13，1987 ；Penzol G等人，Biotechnol Bioeng. 60，518-523， 1998)。最為一個(gè)代表性的實(shí)例，醛基-天門冬氨酸-葡聚糖是具有相當(dāng)大分子量的物質(zhì)， 其具有陰離子和醛基，因此能夠與氨化的DNA探針形成非常強(qiáng)的共價(jià)連接，其中，該連接非常穩(wěn)定從而能夠表現(xiàn)出對雜交混合物的極端PH、高溫或高濃度鹽、溶劑以及親核試劑的耐藥性(參考Fuentes Μ.等人，Biomacromolecules，5，883-888，2004)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述載體可為通過氧化葡聚糖能夠形成醛官能團(tuán)的多糖。例如，聚醛葡聚糖可以通過氧化43kDa的葡聚糖(與500kDa的葡聚糖相比，與核苷酸探針具有更高的結(jié)合效率)來制備。這種聚醛葡聚糖，例如，可通過以下步驟來制備將葡聚糖和1(104在預(yù)先確定的等摩爾量的62. 5mmol單位的葡萄糖中混合，以40rpm的速度旋轉(zhuǎn)該混合溶液，使該溶液靜置 6小時(shí)以上并用滅菌水透析該溶液三次(每個(gè)循環(huán)2小時(shí))。如上所述，所述載體可為如白蛋白或合成聚合物的蛋白質(zhì)。在這種情況下，官能團(tuán)可與蛋白質(zhì)或合成聚合物的氨基、巰基等共價(jià)連接，或者可將能與其親和結(jié)合的配體引入核苷酸探針。例如，聚醛葡聚糖載體與胺-標(biāo)記的核苷酸探針在室溫下pH值為11時(shí)反應(yīng)以形成希夫氏堿基(Schiff’ s base)的亞胺中間體，希夫氏堿基用例如硼氫化鈉的溫和的還原劑作為還原劑還原，促使不可逆的連接形成從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的共價(jià)連接。核苷酸本身缺乏穩(wěn)定性，但當(dāng)向其施加足夠的能量時(shí)獲得與其他基團(tuán)的反應(yīng)活性。在如亞甲藍(lán)的光敏劑存在下將核苷酸暴露于可見光時(shí)，或者沒有任何光敏劑時(shí)將其暴露于UV，其能夠直接與蛋白質(zhì)交聯(lián)(參考R Lalwani等人，J. Photochemistry and Photobiology 7,57-73,1990 Jff Hockensmith φ A, Methods in Enzymology,208, 211-236，1991)。通過制備活化的固體多孔支撐(例如，活化膜)來直接交聯(lián)核苷酸的方法存在兩個(gè)問題。第一個(gè)問題是損失活性。換言之，膜的化學(xué)活性表面與空氣反應(yīng)并因此損失其活性。當(dāng)化學(xué)活性增加時(shí)，即，當(dāng)與靶的交聯(lián)速度提高時(shí)，活性損失的速度提高。為了解決這些問題，最近，制造商使用較低活性的基團(tuán)，特異性地與靶探針本身反應(yīng)。典型的實(shí)例為醛與胺之間的反應(yīng)，這兩者均是相對穩(wěn)定的。由于與生產(chǎn)、儲存和處理相關(guān)的活性固體的內(nèi)在問題，活性膜根本不能用于與探針共價(jià)連接的目的。通常使用具有能與探針特異性地結(jié)合、同時(shí)表現(xiàn)出較低活性，并在儲存過程中活性隨著時(shí)間降低較慢的表面化學(xué)性質(zhì)的膜。這種膜通常在其表面帶有胺或醛基。用醛活化表面的優(yōu)勢在于通過希夫氏堿基的形成就可以形成重要的連接而無需加入任何其他試劑。希夫氏堿基是相對穩(wěn)定的，但在生理?xiàng)l件下可以逆轉(zhuǎn)。因?yàn)檫@個(gè)原因，應(yīng)該用硼氫化鈉作為溫和還原劑來還原希夫氏堿基從而形成不可逆的連接(MB Meza, “ Covalent Binding in Diagnostic Test Design" in The latex Course，2000)。第二個(gè)問題是在使用前應(yīng)該封閉非特異性的連接和活化膜。如果不這樣，樣品則會與膜連接。封閉步驟應(yīng)該簡單、快速并相當(dāng)有效。理想的是，作為封閉結(jié)果，在膜的表面形成親水的不帶電荷的殘基。當(dāng)在膜的表面形成保護(hù)膜(鈍化)時(shí)，引入新的化學(xué)官能團(tuán)并且該膜可不具有對核苷酸的反應(yīng)活性。但是，由于樣品連接或檢測系統(tǒng)的電荷吸引力或疏水吸引力會增加，而非特異性信號也會因此增加。除二硫鍵以外的大多數(shù)共價(jià)連接本身為分批過程，其包括將靶與膜連接然后封閉膜，因此需要大約30分鐘至數(shù)小時(shí)。這樣的偏差使自動(dòng)化控制和大規(guī)模生產(chǎn)變得困難。光敏連接化學(xué)使大規(guī)模生產(chǎn)變得簡單，但增加了成本并且不實(shí)用。另一方面，本發(fā)明，例如，通過特異性地與聚醛葡聚糖(通過活化(氧化)作為載體的葡聚糖)反應(yīng)的氨基修飾的核苷酸探針的共價(jià)結(jié)合而解決了這些問題，因此使大規(guī)模生產(chǎn)成為可能，并且不另外需要其他有毒試劑，這從通過使用1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳化亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC)的胺基和羧基之間的共價(jià)連接可以看出，因此降低了與使用有機(jī)溶劑相關(guān)的成本。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述多孔固體支撐可為膜并且其基底(substrate)可為纖維素或尼龍。用于核苷酸固定的固體支撐的實(shí)例包括膜(硝化纖維素或尼龍膜)、玻璃珠(可控孔度玻璃珠)、丙烯酰胺凝膠、聚苯乙烯基體、活化的葡聚糖、抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠和玻璃等，并且將這些不同的固體支撐用于DNA診斷(參考Saiki R.K et al,PNAS, 86,6230-6234,1989 ；Meinkoth Jet al, Anal. Biochem,138,267-284,1984 ；Ghosh S. S et al, Nucl. Acids Res. , 15, 5353-5372,1987 ；Rasmussen S. R 等人，Anal. Biochem, 198, 138-142,1991 ；Gingeras Τ. R, Nucl. Acids Res.，15，5373-5390，1987 ；Lund V.等人，Nucl. Acids Res. ，16，10861-10880，1988)。本發(fā)明主要研究了將多種靶物質(zhì)固定到多孔固體支撐上的機(jī)制，在這些多種固體支撐中特別研究了膜。所述膜包括能用于核苷酸固定的大范圍的物質(zhì)。具體地，所述膜的實(shí)例包括常規(guī)的鑄膜，例如硝化纖維素和尼龍；新型膜，例如陶瓷或徑跡蝕刻膜；以及用于微點(diǎn)陣的基底型膜(substrate-type membrance)。應(yīng)該確定用于核苷酸固定的多種建議的膜的最佳連接狀態(tài)。在任何一種連接技術(shù)中，核苷酸可以以不可控的方式加到膜上。在這種情況下，由于核苷酸探針不會排列成其主要的方向，所以反應(yīng)能夠潛在地受限。因此，在大多數(shù)情況下，定向吸附，即本申請中的固定核苷酸的末端連接是優(yōu)選的。硝化纖維素的主要優(yōu)點(diǎn)為可快速適用性，但除非通過烘干聚酯涂覆硝化纖維素， 否則該性能較弱，并且與其他膜相比具有較低的結(jié)合力。近來，尼龍具有更高的物理強(qiáng)度和更高的結(jié)合力，其具有更寬范圍的可用表面化合性質(zhì)，能夠最優(yōu)化核苷酸的粘附，并因此促使其成為用于核苷酸連接的基底。將核苷酸與硝化纖維素連接最常使用的是物理吸附，而尼龍膜上的固定是通過物理吸附、UV交聯(lián)或化學(xué)活化來實(shí)現(xiàn)的。如上所述，本發(fā)明能夠解決常規(guī)物理吸附工藝的問題。但是，就生產(chǎn)和制造效率而言，物理吸附是相當(dāng)簡單和粗糙的技術(shù)(參考=TC Tisone, IVDTechnology 6，no. 3，43-60， 2000)。當(dāng)在干燥過程中通過連續(xù)工藝將材料用于連接時(shí)，基于膜的系統(tǒng)的簡單生產(chǎn)是最容易的。可將可固定的材料用于連續(xù)工藝，并且通過簡單且控制良好的工藝(即，干燥)來進(jìn)行連接。如果解決了物理吸附的特定問題，S卩，加強(qiáng)物理吸附從而使更強(qiáng)的直接連接成為可能，作為用于核苷酸診斷試驗(yàn)的大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)，物理吸附是有益的。就此而言，本發(fā)明可進(jìn)一步包括在載體與多孔固體支撐的孔之間通過干燥形成的物理吸附結(jié)合物。大多數(shù)加強(qiáng)的物理吸附技術(shù)不僅提高與非常短的探針的結(jié)合效率，而且也使探針的重要堿基序列排列成在遠(yuǎn)離固體表面的方向上突出。結(jié)果，在加入的樣品與重要的堿基序列之間可以發(fā)生自由的相互作用。特別是即使使用短探針，由于提高了選擇性和敏感性， 物理吸附技術(shù)也相當(dāng)有效。
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就此而言，根據(jù)本發(fā)明，核苷酸探針的重要堿基序列具有通過共價(jià)連接將它們排列成遠(yuǎn)離多孔固體支撐表面的方向的取向。在本發(fā)明中，所述真空轉(zhuǎn)移優(yōu)選包括在自動(dòng)線印跡裝置(automatic line blotter)的核苷酸狹縫線(slit line)上裝入核苷酸探針-載體結(jié)合物以及采用真空泵將結(jié)合物吸附到多孔固體支撐上。本發(fā)明還提供了由所述方法制備的核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條本身具有特定的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過如上所述的特定制備工藝而與常規(guī)支撐條區(qū)分開來。有益效果從上文中可以明顯地看出，本發(fā)明通過將核苷酸探針與載體結(jié)合而有效地確保了核苷酸探針的取向，避免了固定在固體支撐表面上的核苷酸的重排，并且由于與靶堿基序列互補(bǔ)連接的雜交堿基序列的一部分未被固定，所以防止了由于降低的活性而引起的異常雜交。此外，本發(fā)明有效地避免了常規(guī)方法中涉及的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于所述方法不采用常規(guī)方法(其中通過共價(jià)連接固定核苷酸探針)本身所需要的分批過程，因此實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)和自動(dòng)化處理。換言之，本發(fā)明有效地制備核苷酸-探針檢驗(yàn)系統(tǒng)，其能夠采用低成本通過大規(guī)模生產(chǎn)以簡單的方式來快速實(shí)現(xiàn)，其具有再現(xiàn)性，防止膜表面干擾靶堿基序列與核苷酸探針之間的相互作用，從而有利于這兩者之間的雜交并且表現(xiàn)出優(yōu)良的穩(wěn)定性和敏感性。


聯(lián)系附圖從下文詳細(xì)描述中將會更清晰地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特點(diǎn)和其他優(yōu)點(diǎn)，在附圖中圖1為圖示制備條的整個(gè)過程的視圖，包括通過共價(jià)連接將核苷酸低聚核苷酸探針與作為載體的葡聚糖結(jié)合以及通過真空轉(zhuǎn)移將該結(jié)合物固定到膜上；圖2為顯示其中將核苷酸探針與專利藍(lán)色V染料(作為藍(lán)色染料)一起涂覆在膜條上的狀態(tài)的圖，其中，上部的探針為根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式檢測對利福平、異煙胼的敏感性/ 耐藥性的探針，下部的探針為根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式識別和檢測分枝桿菌屬的探針；圖3為顯示由用于利福平和異煙胼敏感性/耐藥性樣本的PCR和反向雜交線印跡檢驗(yàn)而得到的圖；以及圖4為顯示由用于分枝桿菌樣本和對照(陰性、陽性)組的PCR和反向雜交線印跡檢驗(yàn)而得到的圖。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在，將參照下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于解釋說明本發(fā)明而不應(yīng)用于限制本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。下面的實(shí)驗(yàn)涉及通過真空轉(zhuǎn)移將核苷酸探針固定到膜上來制備條的方法以及證實(shí)下列有效性的實(shí)驗(yàn)(i)檢測結(jié)核分枝桿菌和確認(rèn)對利福平和異煙胼藥物的耐藥性的實(shí)驗(yàn)，( )采用兩個(gè)具體實(shí)施例中使用膜條的反向雜交線印跡檢驗(yàn)法來進(jìn)行檢測和識別分支桿菌的實(shí)驗(yàn)，即，在痰液、支氣管沖洗液、腦脊液、尿液、組織、全血和培養(yǎng)菌株中區(qū)分結(jié)核分枝桿菌(TB)和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。實(shí)施例1 制備聚酵葡聚糖(PAD)(1)所需試劑和儀器的準(zhǔn)備使用葡聚糖(Sigma，D-4133，Mr 43kDa)、KIO4 (Aldrich, 32242-3, F. W230. 00)、 纖維素透析膜截留 12000 :Spectra/Por,MWCO 12-14000)、鹽酸羥胺(NH2OH-HCl = 69. 49)、 甲基橙粉末、ION鹽酸、酸度計(jì)、0. IN氫氧化鈉(NaOH)、冷凍干燥機(jī)和真空離心蒸發(fā)濃縮器寸。(2)氧化葡聚糖的制備將0. 5g的葡聚糖(Sigma, D-4133, Mr 43kDa/相當(dāng)于62. 5mmol的葡萄糖)完全溶解在熱壓處理過的D. W中從而將總體積調(diào)節(jié)至10ml。向其中加入0. 72g的KIO4(相當(dāng)于 62. 5mmol 的相同當(dāng)量)(參考Azzam T 等人，J. Med. Chem.，45，1817-1824，2002 ；Azzam T 等人，Macromolecules, 35,9947-9953, 2002 ；Azzam T 等人，J. Controlled Release, 96, 309-323,2004 ；Hosseinkhani H. et al, . Gene Therapy，11，194-203，2004)。將得到的混合物保持6至12小時(shí)同時(shí)在40rpm的速度下旋轉(zhuǎn)。將氧化葡聚糖加到纖維素透析膜上，在2L滅菌三蒸水中0/N透析一次并繼續(xù)透析，總共三次，每次透析2小時(shí)并更換滅菌蒸餾水。透析后，準(zhǔn)確測量聚醛葡聚糖的體積。根據(jù)Huiru Zhao等人在期刊中報(bào)道的公開方法(Pharmaceutical Research, 8, 400-402，1991)來測量氧化葡聚糖中醛基的量。首先，通過將1. 75g的干燥鹽酸羥胺溶解于 15ml的滅菌蒸餾水中來制備0.25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH4. 0)試劑。單獨(dú)地，制備0.6ml 的終濃度為0. 05%的甲基橙試劑并將其加入鹽酸羥胺溶液。將ION HCl緩慢加入制得的混合物中以調(diào)節(jié)pH值至4.0，并用滅菌蒸餾水稀釋該溶液以制備IOOml的0. 25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH 4. 0)試劑。用0. IN NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液對聚醛葡聚糖進(jìn)行氧化-還原滴定。透析后，將1. 25ml的 0. 25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH 4. 0)溶液加入到100 μ L制得的聚醛葡聚糖中，接著在室溫下進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)，同時(shí)在40rpm下旋轉(zhuǎn)。然后，用0. IN NaOH作為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。準(zhǔn)確測量在氧化-還原滴定中加入的NaOH的體積(yL)并且可以從顏色的變化(顏色從紅色變?yōu)辄S色)看出滴定終點(diǎn)。聚醛葡聚糖的氧化-還原反應(yīng)和醛基的取代水平的計(jì)算顯示在下面的公式中，并且計(jì)算在透析后測量的聚醛葡聚糖(PAD)的總體積中存在的醛基的總摩爾數(shù)并將其顯示在下表1中。葡聚糖-(CHO)η+Η2Ν-0Η · HCl =葡聚糖 _(CH = N_0H)n+H20+HCl (1)HCl+NaOH = NaCl+H20(2)醛基的取代水平
(SaQH體積(mL) χ NNaOH) χ 10'3 mol_ CHO的摩爾數(shù)
樣品重量(g) χ 葡聚糖(MW)葡聚糖的摩爾數(shù)[表1]
權(quán)利要求
1.一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，其包括將核苷酸探針與載體連接以制備結(jié)合物；以及通過真空轉(zhuǎn)移將所述結(jié)合物固定在多孔固體支撐上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針為選自DNA、RNA和PNA中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針與所述載體之間的連接為共價(jià)連接，或者為具有與共價(jià)連接相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合力的親和結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針的5’-端或3’ -端用能與載體共價(jià)連接或親和結(jié)合的官能團(tuán)或配體修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述官能團(tuán)為選自羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中，R為H或C1-C6烷基)、氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛基(-CH0)、羥基(-0H)、環(huán)氧基和巰基中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述配體為選自生物素、谷胱甘肽、麥芽糖、組氨酸、凝集素及其衍生物中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述氨基直接與所述核苷酸探針連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述配體直接與所述核苷酸探針連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述氨基為具有短碳鏈的氨基C6接頭或氨基C12接頭。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針包含能被分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)或化學(xué)的方式直接或間接檢測的標(biāo)記。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針為合成的低聚核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述合成的低聚核苷酸包含16至22個(gè)核苷酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述核苷酸探針包含間隔區(qū)以提高在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的雜交效率。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述間隔區(qū)為非特異性聚T尾。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體為選自多糖、蛋白質(zhì)和合成聚合物中的至少一種。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述載體為葡聚糖或葡聚糖衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述葡聚糖衍生物為氧化葡聚糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述氧化葡聚糖為聚醛葡聚糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述結(jié)合物通過胺-標(biāo)記的核苷酸探針與作為載體的聚醛葡聚糖反應(yīng)以形成希夫氏堿基的亞胺中間體并采用還原劑還原該希夫氏堿基以引發(fā)不可逆的連接來制備。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述多孔固體支撐為膜。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述膜由硝化纖維素或尼龍組成。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述載體和所述多孔固體支撐之間物理吸附所述結(jié)合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述真空轉(zhuǎn)移包括在自動(dòng)線印跡裝置的核苷酸狹縫線上裝入所述核苷酸探針與載體的結(jié)合物；以及采用真空泵將該結(jié)合物吸附到多孔固體支撐上。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括用預(yù)雜交緩沖液預(yù)處理所述固體支撐。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述預(yù)雜交緩沖液為含有登哈特溶液、SSC、SDS和變性的鮭精DNA的組合物。
26.一種核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條，其由根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的方法制備。
全文摘要
本申請公開了一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法。所述方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結(jié)合物并通過真空轉(zhuǎn)移將該結(jié)合物固定到多孔固體支撐上。
文檔編號C12Q1/68GK102559877SQ201110431650
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者俞恩珠, 吳宰勛, 姜鎮(zhèn)錫, 樸榮石, 權(quán)準(zhǔn)徹 申請人:株式會社Lg生命科學(xué)