專利名稱：檢測或輔助檢測ii類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的方法。
背景技術(shù)：
微生物在生長的過程中能夠自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調(diào)節(jié)其群體行為，這種現(xiàn)象稱為群體感應(Quorum sensing, QS),產(chǎn)生的信號分子叫做自誘導物(autoinducer, Al)。目前已知很多種類的細菌可以通過群體感應來調(diào)控生理行為。目前對一些G-細菌群體感應信號分子——N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHLs)的檢測已有很多研究報道和相關(guān)專利，如儲衛(wèi)華等“群體感應信號分子及其抑制劑快速檢測方法的建立”，郭秀春等“氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測海綿共棲細菌中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號分子”，曹廣霞等“細菌群體感應信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯的檢測”，周志剛等“水產(chǎn)病原菌群體感應信號分子的檢測方法及其專用試劑盒”。但對于許多產(chǎn)II類細菌素乳酸菌，其信號分子一般為寡肽，由于缺乏相關(guān)的遺傳背景，對其結(jié)構(gòu)和組成知之甚少，目前還沒有群體感應信號肽的檢測方法的專利。自誘導肽(AIP)類化合物是產(chǎn)II類細菌素乳酸菌群體感應中最重要的一類信號分子，調(diào)控包括其自身基因在內(nèi)的一系列細菌素合成調(diào)控基因以及結(jié)構(gòu)基因的表達。Saucier 等(Saucier L, Poon A, Stiles ME.1nduction of bacteriocin inCarnobacterium piscicola LV17.J Appl Mocrobiol, 1995, 78:684-690)的研究表明自誘導妝可以啟動細菌素的合成，Schmitz 等(Schmitz S, Hoffmann A, Szekat C, et al.Thelantibiotic mersacidin is an autoinducing peptide.Appl Environ Microbiol,2006,72:7270-7277)認為自誘導肽可以誘發(fā)細菌素提早合成。快速、簡便、有效地檢測細菌能否產(chǎn)生AIP，成為深入研究和了解產(chǎn)II類細菌素乳酸菌群體感應的重要手段。脫脂乳培養(yǎng)基是適合大多數(shù)乳酸菌生長的培養(yǎng)基，但許多乳酸菌在脫脂乳培養(yǎng)基中生長緩慢，以此培養(yǎng)基來檢測自誘導肽，周期長。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的方法。該方法包括如下步驟:先將II類細菌素產(chǎn)生菌懸浮于無菌生理鹽水中，接種于液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在達 到穩(wěn)定期之前的這一時間段中的任一時刻(上述培養(yǎng)體系此時不含有II類細菌素)，向所述液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中添加待檢測肽，繼續(xù)培養(yǎng)至10-16h，如13h，得到培養(yǎng)物；檢測所述培養(yǎng)物中是否存在所述II類細菌素，按照如下方法確定所述待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽:若所述培養(yǎng)物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽為或候選為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽；反之，則所述待檢測肽不含有或候選不含有所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽不為或候選不為所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽。所述II類細菌素產(chǎn)生菌產(chǎn)生II類細菌素受群體感應系統(tǒng)調(diào)控；所述待檢測肽來源于將所述II類細菌素產(chǎn)生菌在產(chǎn)生II類細菌素狀態(tài)下進行發(fā)酵得到的發(fā)酵上清液；所述改良脫脂乳培養(yǎng)基是在脫脂乳培養(yǎng)基中添加酵母浸粉得到的培養(yǎng)基，在所述改良脫脂乳培養(yǎng)基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml，如0.5g: Ilg: 100ml。在本發(fā)明的一個實施例中，所述將所述II類細菌素產(chǎn)生菌接種于液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為0.5% (體積比)，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)至指數(shù)期，時間為0-12h，如 8h。在本發(fā)明的實施例中，所述待檢測肽具體是通過包括如下步驟的方法制備得到的:用40% -80%，如60%飽和度的硫酸銨溶液過夜沉淀所述II類細菌素產(chǎn)生菌在產(chǎn)生II類細菌素狀態(tài)下的發(fā)酵上清液，進而得到所述待檢測肽。所述發(fā)酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產(chǎn)生菌接種于能使所述II類細菌素產(chǎn)生菌產(chǎn)生II類細菌素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期這一時間段中的任一時刻，如穩(wěn)定期末期(上述培養(yǎng)體系此時含有II類細菌素)，收集得到所述發(fā)酵上清液。在本發(fā)明的實施例中，所述能使所述II類細菌素產(chǎn)生菌產(chǎn)生II類細菌素的培養(yǎng)基具體為MRS培養(yǎng)基。實際操作中，所述發(fā)酵上清液的獲得方法包括如下步驟:將所述II類細菌素產(chǎn)生菌以體積百分比0.5 I %，或體積百分比0.5 %的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，30 37°C培養(yǎng)10-48h，或37°C培 養(yǎng)10-48h，或37°C培養(yǎng)24h后，收集獲得含有所述待檢測肽的所述發(fā)酵上清液。所述液體MRS培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、K2HPO4.3Η20、檸檬酸三銨、NaAC、葡萄糖、MgSO4.7H20、MnSO4.H2O和吐溫80 ;所述水、所述蛋白胨、所述牛肉膏、所述酵母浸粉、所述K2HPO4.3H20、所述檸檬酸三銨、所述NaAC、所述葡萄糖、所述MgSO4.7Η20、所述MnSO4^H2O和所述吐溫80 的配比為 100ml: IOg: IOg: 5g: 2g: 2g: 5g:20g: 0.58g: 0.25g: lmL。所述方法中檢測所述培養(yǎng)物中是否存在所述II類細菌素是通過檢測所述培養(yǎng)物對指示菌的抑菌作用實現(xiàn)的，如果所述培養(yǎng)物對指示菌有抑菌作用，所述培養(yǎng)物中含有所述II類細菌素，如果所述培養(yǎng)物對指示菌無抑菌作用，所述培養(yǎng)物中不含有所述II類細菌素。所述指示菌為其生長能被所述II類細菌素抑制的菌株，如單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)54002。在本發(fā)明的實施例中，檢測所述培養(yǎng)物對所述指示菌的抑菌作用的方法具體可包括如下步驟:首先，將經(jīng)過所述待檢測肽誘導培養(yǎng)10-16h，如13h的所述II類細菌素產(chǎn)生菌培養(yǎng)物的上清液過濾除菌，并調(diào)整pH至6.5 7.0。其次，取新鮮過夜培養(yǎng)的指示菌，用無菌生理鹽水稀釋至IO6 107CFU/mL，如106CFU/mL，取ImL與冷卻至45 55°C，如50°C的15 20ml MRS固體培養(yǎng)基混勻倒平板。待平板凝固后，放入牛津杯，分為實驗組和對照組。實驗組按照50 200 μ I/杯，如100 μ I/杯的用量，加入上述處理過的上清液，對照組中不加入上述待測液體。37°C培養(yǎng)18 36h，如24h，觀察抑菌效果。如果對照組無抑菌圈，而實驗組出現(xiàn)抑菌圈，則所述培養(yǎng)物對所述指示菌有抑菌作用，如果對照組無抑菌圈，而實驗組也未出現(xiàn)抑菌圈，則所述培養(yǎng)物對所述指示菌無抑菌作用。上述方法中的所述待檢細菌為乳酸菌，如乳桿菌。在本發(fā)明的實施例中具體為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) 31-1。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的培養(yǎng)基，為改良脫脂乳培養(yǎng)基。所述改良脫脂乳培養(yǎng)基是在脫脂乳培養(yǎng)基中添加酵母浸粉得到的培養(yǎng)基。在所述改良脫脂乳培養(yǎng) 基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為
0.5g: (8-12g): 100ml，如 0.5g:1lg: 100ml。本發(fā)明所提供的改良的脫脂乳培養(yǎng)基以脫脂乳培養(yǎng)基為基礎，添加酵母浸粉，力口快了乳酸菌的生長和產(chǎn)細菌素進程，使得自誘導的檢測更加簡便、快速。與MRS培養(yǎng)基相t匕，乳酸菌在此培養(yǎng)基中II類細菌素合成速度慢，在某一培養(yǎng)狀態(tài)下，自誘導肽對細菌素合成的誘導效應能夠被有效地監(jiān)測。多數(shù)乳酸菌均可在此培養(yǎng)基上生長，當接種量小于某特定閾值時，控制培養(yǎng)時間，使乳酸菌不產(chǎn)生細菌素，當加入自誘導肽后可恢復其產(chǎn)II類細菌素的能力。將產(chǎn)II類細菌素乳酸菌接種于該培養(yǎng)基，通過控制接種量和培養(yǎng)時間，控制乳酸菌的細菌素合成行為，使之處于不產(chǎn)細菌素的狀態(tài)，添加來自于該菌株自身的肽類提取物，控制培養(yǎng)時間，監(jiān)測II類細菌素的產(chǎn)生。該體系的建立有助于大規(guī)模高通量篩選產(chǎn)II類細菌素乳酸菌群體感應自誘導肽。本發(fā)明方法準確率高，沒有假陰性現(xiàn)象，易于定性定量分析，操作簡便，成本低，獲得結(jié)果迅速，適合大規(guī)模高效率檢測。
圖1為檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的流程圖。圖2為自誘導肽誘導II類細菌素產(chǎn)生的抑菌活性實驗結(jié)果。其中，A為對照組
I(用等量MRS液體培養(yǎng)基代替待檢測肽誘導的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)；B為實驗組(經(jīng)待檢測肽F22誘導的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)；(:為對照組2(待檢測肽F22的抑菌效果)山為對照組3 (培養(yǎng)物與待檢測肽相加的抑菌效果，與實驗組不同之處在于待檢測肽F22是在培養(yǎng)完成之后加入的)。圖3為利用液體脫脂乳培養(yǎng)基檢測或輔助檢測待檢細菌產(chǎn)生II類細菌素是否存在群體感應調(diào)控現(xiàn)象的流程圖。圖4為自誘導物誘導II類細菌素產(chǎn)生的抑菌活性實驗結(jié)果。其中，A實驗組* (經(jīng)自誘導物誘導的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)出為對照組I * (用等量MRS液體培養(yǎng)基代替自誘導物誘導的液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物的抑菌效果)；(:為對照組3* (對照組I *與等量的自誘導物混合后的抑菌效果)山為對照組2 * (自誘導物的抑菌效果)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。液體改良脫脂乳培養(yǎng)基:稱取脫脂乳(哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司原料乳)llg，酵母浸粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司貨號:01-012)0.5g，溶于IOOmL蒸懼水中，115°C滅菌 13min，pH 6.5 7.0。液體脫脂乳培養(yǎng)基:稱取脫脂乳llg，溶于IOOmL蒸餾水中，115°C滅菌13min，pH6.5 7.0。液體MRS培養(yǎng)基:稱取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，K2HPO4.3H20 2g，檸檬酸三銨 2g，NaAC 5g，葡萄糖 20g, MgSO4.7H20 0.58g，MnSO4.H2O 0.25g，吐溫 801mL，溶于 IOOmL 蒸餾水中，121°C滅菌 20min, ρΗ6.5 7.0。液體1/2MRS培養(yǎng)基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養(yǎng)基成分X 1/2，ρΗ6.5 7.0，121°C 滅菌 20min。 液體1/5MRS培養(yǎng)基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養(yǎng)基成分X 1/5，pH6.5 7.0，121°C 滅菌 20min。液體1/10MRS培養(yǎng)基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養(yǎng)基成分X 1/10，pH6.5
7.0,121°C滅菌 20min。固體MRS培養(yǎng)基:為液體MRS培養(yǎng)基加入15g/L瓊脂。實施例1、檢測或輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌L.pentosus 31-1的待檢測肽是否是群體感應信號肽戍糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus) 31-1 為 II 類細菌素產(chǎn)生菌(GuorongLiu, Yanni Lv,Pinglan Li,Kang Zhou,Jinglan Zhang.Pentocin 31-1,an anti—Listeriabacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1 isolated from Xuan-ffeiHam, a traditionalChina fermented meat product.Food Control,2008,19:353-359.Zhang Jinlan, Liu Guorong, Shang Nan, Cheng ffanpeng, Chen Shangwu, Li Pinglan二Purification and Partial Amino Acid Sequence of Pentocin 31-1,an Ant1-ListeriaBacteriocin Produced by Lactobacillus pentosus 31—1.Journal of FoodProtection, Volume 72，Number 12.2524-2529.)，經(jīng)鑒定其II類細菌素的產(chǎn)生存在群體感應調(diào)控現(xiàn)象(具體鑒定方法參見本實施例結(jié)尾處)。本實施例將詳述如何利用本發(fā)明的方法檢測或輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌L.pentosus 31-1的待檢測肽是否是群體感應信號肽(實驗流程如圖1所示)。具體按照如下步驟進行:1、待檢測肽的提取將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (體積比)的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h(L.pentosus 31-1處于穩(wěn)定期末期，IlOOOXg離心5min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH至6.5 7.0，過濾除菌，制備發(fā)酵上清液。用60%飽和度硫酸銨過夜沉淀，IlOOOXg冷凍離心IOmin,收集沉淀,冷凍干燥。將上述樣品用0.02M的Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)復溶至終濃度為0.5g/ml。用NMWL3000(截留相對分子質(zhì)量為3000，美國Millipore，NMWL 3000), NMWL 1000(截留相對分子質(zhì)量為1000，，美國Millipore，NMWL 1000)濾膜超濾，分別收集> 3000Da和1000 3000Da的組分。過辛基-瓊脂糖凝膠(Octyl Sepharose 4FF)柱(北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司HA-0670-01，層析柱規(guī)格30cm(柱長)X 1.0cm(內(nèi)徑))，進行疏水層析，具體按如下操作:用 0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 加(NH4)2SO4 的平衡緩沖液(0.02mol/L ρΗ7.0的 Na2HPO4-NaH2PO4 溶液的配方為:61ml 濃度為 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 39ml 濃度為 0.2mol/L的NaH2PO4，用蒸餾水定容至1000ml) ((NH4)2SO4在上述平衡緩沖液中的終濃度為lmol/L)平衡洗去雜質(zhì)，以1.5ml/min的流速勻速上樣，上樣量為0.5ml，待樣品上完后，再用0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脫液(配方為:61ml 濃度為 0.2mol/L Na2HPO4, 39ml 濃度為
0.2mol/L NaH2PO4，用蒸餾水定容至1000ml)洗下目標產(chǎn)品。測定OD22tl值(用HD-5型電腦紫外檢測儀進行在線檢測，上海青浦滬西儀器廠)，根據(jù)圖形波峰波谷的情況，分別收集在220nm有吸收的各個洗脫峰，再把收集的每個洗脫峰對應的收集液用真空冷凍干燥機冷凍干燥(FD-1博醫(yī)康冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，共得到2份粗品待檢測肽(每一份粗品待檢測肽對應所收集的一個洗脫峰)，分別命名為Fl和F2。將上述獲得的粗品待檢測肽(Fl和F2)分別用0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4 (配方為:61ml濃度為0.2mol/L的Na2HPO4, 39ml濃度為0.2mol/L的NaH2PO4,用蒸懼水定容至1000ml)復溶至終濃度為5mg/ml。再將其過Sephadex G-1O柱((0.7cmX 18.5cm)，柱填料購自北京拜爾迪生物公司(Pharmacia 17-0010-01)，進行凝膠過濾層析，上樣量為0.5ml,流速為 0.3ml/min,用 0.02mol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脫。測定 OD220 值(用 HD-5 型電腦紫外檢測儀進行在線檢測，上海青浦滬西儀器廠)，根據(jù)圖形波峰波谷的情況，分別收集在220nm有吸收的各個洗脫峰，再把收集的每個洗脫峰對應的收集液用真空冷凍干燥機冷凍干燥(FD-1博醫(yī)康冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，共得到4份待檢測肽(每一份待檢測肽對應 所收集的一個洗脫峰)。由粗品待檢測肽Fl得到的待檢測肽分別命名為F11、F12 ；由粗品待檢測肽F2得到的待檢測肽分別命名為F21和F22。其中，一個待檢測肽F22所對應的洗脫峰的保留時間是60min。2、誘導時間的確定將懸浮于無菌生理鹽水中的L.pentosus 31-1 (109cfu/ml)以0.5% (體積比)的接種量分別接種到液體改良脫脂乳培養(yǎng)基、液體脫脂乳培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，每a檢測上述兩種液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中是否存在II類細菌素，記錄出現(xiàn)細菌素活性的時間。具體方法為:分別收集上述兩種液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，13800Xg離心5min，取上清液過濾除菌，調(diào)節(jié)pH至6.5 7.0,取100 μ I備用。以可被L pentosus 31-1所產(chǎn)II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(L.Plantarum) PL2 (武朋朋，劉國榮,暢曉淵，張香美，李平蘭.抗豬鏈球菌戊糖乳桿菌素的純化及特性研究.中國農(nóng)業(yè)大學學報，2011，16 (5):121-126)為指示菌用杯碟法測定上述兩種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養(yǎng)物中是否含有II類細菌素。具體操作為:取過夜培養(yǎng)的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C的20ml的MRS固體培養(yǎng)基混勻倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經(jīng)上述處理的上清液，37°C培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。結(jié)果顯示，加入了液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中> 14h(指數(shù)期末期)培養(yǎng)物上清液的平板均產(chǎn)生了抑菌圈，而加入液體脫脂乳培養(yǎng)基中的直至72h的培養(yǎng)物上清液的平板也未產(chǎn)生抑菌圈。這一結(jié)果表明，所述兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)物上清液在指數(shù)期中期(< 14h)這一時段均不存在II類細菌素，進而說明在指數(shù)期中期(< 14h)這一時段(L.pent0SUS31-l菌株未產(chǎn)生II類細菌素的時間段)均可用于檢測自誘導肽。3、誘導將步驟I制備的共4份待檢測肽分別添加到步驟2培養(yǎng)有L.pentosus 31-1 (L.pentosus 31-1處于指數(shù)期，培養(yǎng)8h)的上述兩種液體培養(yǎng)基中進行誘導，使待檢測肽的濃度為0.5 μ g/ml (實驗組)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間(脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)至13h或60h，改良脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)至13h)。同時，每種培養(yǎng)基均設置以等量液體MRS培養(yǎng)基替代待檢測肽進行誘導的對照(對照組I)。4、檢測收集步驟3中兩種液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，13800 Xg離心5min，取上清液過濾除菌，調(diào)節(jié)pH至6.5 7.0,以可被L.pentosus 31-1所產(chǎn)II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(Lplantarum)PL2為指示菌，用杯碟法測定上述兩種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養(yǎng)物中是否含有II類細菌素，進而判定所述L.pentosus 31-1經(jīng)待檢測肽處理后，是否恢復產(chǎn)生II類細菌素。具體操作為:取過夜培養(yǎng)的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C左右的20ml的MRS固體培養(yǎng)基混勻倒 平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經(jīng)上述處理的上清液，同時以100 μ I待檢測肽(所述待檢測肽溶于MRS培養(yǎng)基中，使其終濃度與誘導所用濃度相同，即待檢測肽終濃度為0.5 μ g/ml)(對照組2)，以及100 μ I L.pentosus31-1培養(yǎng)物(脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)至13h或60h，改良脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)至13h)與待檢測肽(終濃度為0.5 μ g/ml)的混合物，與實驗組不同之處在于待檢測肽F22是在培養(yǎng)完成之后加入的(對照組3)作為對照，37°C培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。結(jié)果顯示:(I)對于脫脂乳培養(yǎng)基(加入待檢測肽后繼續(xù)培養(yǎng)至13h組)，添加了不同待檢測肽的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現(xiàn)；(2)對于脫脂乳培養(yǎng)基(加入待檢測肽后繼續(xù)培養(yǎng)至60h組)，添加了 F22的3個對照組無抑菌圈出現(xiàn)，而實驗組出現(xiàn)抑菌圈；添加了 Fl1、F12、F21的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現(xiàn)；(3)對于改良脫脂乳培養(yǎng)基(加入待檢測肽后繼續(xù)培養(yǎng)至13h組)，添加了 F22的3個對照組無抑菌圈出現(xiàn)，而實驗組出現(xiàn)抑菌圈(圖2);添加了 F11、F12、F21的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現(xiàn)。本實施例的實驗結(jié)果表明，加入待檢測肽F22(保留時間為60min)繼續(xù)培養(yǎng)(改良脫脂乳培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至13h，脫脂乳培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至60h)后使L.pentosus 31-1啟動II類細菌素合成(相應的培養(yǎng)物上清中存在II類細菌素)，則說明待檢測肽F22 (保留時間為60min)為L.pentosus 31_1菌株產(chǎn)生II類細菌素群體感應的自誘導肽。與脫脂乳培養(yǎng)基(加入自誘導肽后培養(yǎng)至60h)相比，選用改良脫脂乳培養(yǎng)基(加入自誘導肽后培養(yǎng)至13h)可以快速地甄別群體感應自誘導肽，縮短檢測時間。上述實施例中，鑒定L pentosus 31_1產(chǎn)生II類細菌素存在群體感應調(diào)控現(xiàn)象的具體方法如下(實驗流程如圖3所示):具體按照如下步驟進行:I)制備自誘導物(發(fā)酵上清液)將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的戍糖乳桿菌(L.pentosus) 31-1以0.5% (體積比)的接種量接種到液體MRS培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)24h(戊糖乳桿菌(L.pentosus) 31-1處于穩(wěn)定期末期)，13800 Xg離心5min,收集發(fā)酵上清液,作為自誘導物。2)獲得具有不產(chǎn)II類細菌素細胞表型的L.pentosus 31-1將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (體積比)的接種量分別接種到液體脫脂乳培養(yǎng)基(同時設置如下四種液體培養(yǎng)基作為液體脫脂乳培養(yǎng)基的對照:液體MRS培養(yǎng)基、液體1/2MRS培養(yǎng)基、液體1/5MRS培養(yǎng)基和液體1/10MRS培養(yǎng)基)中，并在37°C條件下培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h后，分別檢測此時五種液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中是否存在II類細菌素。具體方法為:分別收集不同培養(yǎng)時間的五種液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，13800 X g離心5min，取上清液過濾除菌，調(diào)節(jié)pH至6.5 7.0，取100 μ I備用。以可被所述待檢細菌所產(chǎn)II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(L.plantarum)PL2為指示菌用杯碟法測定上述不同培養(yǎng)時間的五種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養(yǎng)物中是否含有II類細菌素。具體操作為:取過夜培養(yǎng)的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C的20ml的MRS固體培養(yǎng)基混勻倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經(jīng)上述處理的上清液，37°C培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。結(jié)果顯示，經(jīng)過72h培養(yǎng)，加入了液體脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)物上清液的平板仍未產(chǎn)生抑菌圈，而加入作為對照的四種液體培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基、1/2MRS培養(yǎng)基、1/5MRS培養(yǎng)基和1/10MRS培養(yǎng)基)平板均產(chǎn)生抑菌圈(表I)。這一結(jié)果表明，包括對照培養(yǎng)基在內(nèi)的共五種培養(yǎng)基中，只有所述液體脫脂乳培養(yǎng)基的培養(yǎng)物上清液中不存在II類細菌素，進而說明利用所述液體脫脂乳培養(yǎng)基獲得了不產(chǎn)II類細菌素細胞表型的L.pentosus 31_1。表I不同培養(yǎng)基對L.pentosus 31-1合成II類細菌素的影響
權(quán)利要求
1.檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的方法，包括如下步驟: 先將II類細菌素產(chǎn)生菌接種于液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在到達穩(wěn)定期之前的這一時間段中的任一時刻，向所述液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中添加所述待檢測肽，繼續(xù)培養(yǎng)至10-16h，得到培養(yǎng)物；檢測所述培養(yǎng)物中是否存在所述II類細菌素，按照如下方法確定所述待檢測肽是否含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽:若所述培養(yǎng)物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽，或所述待檢測肽為或候選為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽；反之，則所述待檢測肽不含有或候選不含有所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽不為或候選不為所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽；所述II類細菌素產(chǎn)生菌產(chǎn)生II類細菌素受群體感應系統(tǒng)調(diào)控；所述待檢測肽來源于將所述II類細菌素產(chǎn)生菌在產(chǎn)生II類細菌素狀態(tài)下進行發(fā)酵得到的發(fā)酵上清液；所述改良脫脂乳培養(yǎng)基是在脫脂乳培養(yǎng)基中添加酵母浸粉得到的培養(yǎng)基，在所述改良脫脂乳培養(yǎng)基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產(chǎn)生菌接種于能使所述II類細菌素產(chǎn)生菌產(chǎn)生II類細菌素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，如穩(wěn)定期末期，，收集得到所述發(fā)酵上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產(chǎn)生菌接種于MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，如穩(wěn)定期末期，收集得到所述發(fā)酵上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的 方法，其特征在于:所述發(fā)酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產(chǎn)生菌以體積百分比0.5 1%，或體積百分比0.5%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，30 37°C培養(yǎng)10-48h，或37°C培養(yǎng)10_48h，或37°C培養(yǎng)24h后，收集獲得含有所述待檢測肽的所述發(fā)酵上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產(chǎn)生菌為乳酸菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產(chǎn)生菌為乳桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產(chǎn)生菌為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) 31-1。
8.檢測II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的培養(yǎng)基，為改良脫脂乳培養(yǎng)基，其特征在于:所述改良脫脂乳培養(yǎng)基是在脫脂乳培養(yǎng)基中添加酵母浸粉得到的培養(yǎng)基；在所述改良脫脂乳培養(yǎng)基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基，其特征在于:在所述改良脫脂乳培養(yǎng)基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: Ilg: 100ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產(chǎn)生菌代謝物的待檢測肽是否含有或為II類細菌素產(chǎn)生菌群體感應信號肽的方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟先將II類細菌素產(chǎn)生菌接種于液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在到達穩(wěn)定期之前這一時段中的任一時刻，向所述液體改良脫脂乳培養(yǎng)基中添加待檢測肽，繼續(xù)培養(yǎng)至10-16h，得到培養(yǎng)物；檢測所述培養(yǎng)物中是否存在所述II類細菌素；若所述培養(yǎng)物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有，或是或候選是所述II類細菌素產(chǎn)生菌的群體感應信號肽。本發(fā)明選用改良脫脂乳培養(yǎng)基可以甄別群體感應自誘導肽，且與脫脂乳培養(yǎng)基相比，更加快速，大大縮短了檢測時間。
文檔編號C12Q1/02GK103173513SQ201110431610
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者李平蘭, 張香美, 張寶, 劉麗莎 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學