專利名稱：一種強(qiáng)化厭氧發(fā)酵制氫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵制氫領(lǐng)域，具體的說是一種強(qiáng)化厭氧發(fā)酵制氫的方法。
背景技術(shù)：
不斷增加的能源需求和化石燃料儲量枯竭之間的矛盾正在加劇，氫氣作為一種清潔、高效、可再生的能源載體，是一個非常有前景的替代能源。在眾多制取氫氣的方法中厭氧發(fā)酵制氫因其應(yīng)條件溫和、設(shè)備簡單而且可利用的原料來源廣泛而被認(rèn)為是一種具有廣泛前景的制氫方法。然而，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫由于原料轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)氫速率低，目前在制氫的成本上還不能與化學(xué)法制氫相抗衡。提高原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)氫速率以降低制氫成本是厭氧發(fā)酵制氣亟待關(guān)破的問題。厭氧發(fā)酵制氫中的產(chǎn)氫反應(yīng)是可逆的氧化還原反應(yīng)Η2^=±2ΙΓ+2ε , H2生
產(chǎn)速率同時受產(chǎn)氫速率和吸氫速率的影響。較低的胞內(nèi)氫氣分壓有利于產(chǎn)氫反應(yīng)向產(chǎn)氫方向進(jìn)行。另外，胞內(nèi)產(chǎn)生的H2要經(jīng)過細(xì)胞膜釋放到液體培養(yǎng)基，然后再擴(kuò)散到上方的氣相。因而減小氫氣釋放的阻力有利于降低胞內(nèi)的氫氣分壓從而強(qiáng)化產(chǎn)氫。Mandal通過降低發(fā)酵體系中培養(yǎng)基上方的氫氣分壓的方式成功強(qiáng)化產(chǎn)氫?？紤]到細(xì)胞膜的雙磷脂層的流動所引起的孔徑(不超過0. 5-1. Onm)與氫氣分子的直徑(近O. 3nm)相當(dāng)，推測胞內(nèi)產(chǎn)生的氫氣經(jīng)由細(xì)胞膜向胞外液體培養(yǎng)基釋放的速度可能受到細(xì)胞膜孔徑的影響。因此，我們推斷改善細(xì)胞膜通透性可降低氫氣由胞內(nèi)向胞外釋放的阻力，從而降低細(xì)胞內(nèi)H2的壓力，并最終提高產(chǎn)氫速率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于篩選一種能有效改善細(xì)胞膜的通透性又不影響產(chǎn)氫微生物生長和代謝的一種試劑，探索該試劑的作為厭氧發(fā)酵制氫添加劑的濃度條件，最終實(shí)現(xiàn)累計(jì)
產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率的強(qiáng)化。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為一種強(qiáng)化厭氧發(fā)酵制氫的方法，包含以下步驟按照體積比，在發(fā)酵容器中加入100份的培養(yǎng)基，并按照每升培養(yǎng)基中加入Img刃天青的比例加入刃天青,再加入5份質(zhì)量濃度為O. 2"O. 6g/L的十六燒基三甲基溴化銨溶液，混合均勻后，在121°C的條件下滅菌15min，然后接種5份取自牛糞發(fā)酵后的液體，再向發(fā)酵容器和與之相連的堿洗瓶中通入無菌氮?dú)庵敝涟l(fā)酵體系的顏色由粉色變?yōu)闊o色，然后密封無菌氮?dú)馔ㄈ肟?，?7°C恒溫、155r/min的條件下震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的氣體通過通氣管道進(jìn)入裝有濃度為2 4mol/L氫氧化鈉溶液的堿洗瓶中，然后收集從堿洗瓶中溢出的氣體即為發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣；
所述的培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氫二鉀、2g的硫酸銨、6 g的磷酸二氫鉀和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余為蒸餾水，配制好的培養(yǎng)基在使用前在121°C的條件下滅菌15min。
本發(fā)明中，所述的加入刃天青的作用是用于觀察培養(yǎng)基中的厭氧指標(biāo)。本發(fā)明中，所述的牛糞發(fā)酵后的液體實(shí)際上為一種混和菌液。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的十六烷基三甲基溴化銨，即CTAB，混合菌的生長代謝沒有受到明顯抑制作用，混合菌的細(xì)胞膜的通透性得到明顯改善，CTAB對微生物的影響實(shí)驗(yàn)如下
一、CTAB對細(xì)胞膜通透性的影響
混合菌取自牛糞發(fā)酵的沼氣罐，其細(xì)菌細(xì)胞密度為1.8^2. 2 ；
培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基中含有1Og木糖、5g蛋白胨、14g磷酸氫二鉀、2 g (NH4)2S04、6 g磷酸二氫鉀和O. 2 g MgSO4 ·7Η20，其余為蒸餾水，配制好的培養(yǎng)基在使用前在121°C的條件下滅菌15min ；
細(xì)胞懸浮液制備混合菌群在培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24 h，離心取沉淀，然后用pH為7、100毫摩爾的磷酸鉀緩沖液洗凈，加入適量的緩沖液(600 nm下光密度值0D_等于3. 31)保存。CTAB對細(xì)胞膜通透性的影響:分別配制0，0. 1，O. 2，O. 3，O. 4，O. 6，O. 8，1. 2 g/L的CTAB溶液；取4mL細(xì)胞懸浮液和O. 2 mL CTAB溶液加入7mL的血清瓶中，在37°C條件下保持15min，然后離心取上清，在280nm下測定其吸光度值(A28tl)以估算蛋白質(zhì)滲出量和細(xì)胞膜的通透性。為分析CTAB的作用時間對蛋白滲出量的影響，將細(xì)胞懸浮液和CTAB溶液在血清瓶中的作用時間延長為90min和135min重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。為排除CTAB在280nm的波長條件下有吸收而對檢測造成影響，做不含細(xì)胞懸浮液的對照實(shí)驗(yàn)取一個血清瓶加入4mL的緩沖液和O. 2mL濃度分別為0，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4，O. 6,0. 8，1. 2 g/L的CTAB溶液保持135 min檢測其吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示CTAB在280nm條件下無吸收，實(shí)驗(yàn)檢測到A28tl即為胞內(nèi)滲出蛋白的吸光度；CTAB和細(xì)胞的作用時間為15min時隨著CTAB濃度增加A28tl增加，表明CTAB可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白類物質(zhì)的滲出；延長CTAB和細(xì)胞的作用時間對細(xì)胞滲出量的影響不大；從而，得出CTAB可促進(jìn)混合菌細(xì)胞通透性的增加。二、CTAB對微生物生長的影響
發(fā)酵終端的生物量用終端發(fā)酵液在600nm的光密度值(0D_)表征。CTAB對微生物生長的影響如附圖2所示，如下表所示CTAB的存在使得微生物在發(fā)酵的前12h生長緩慢，但12h之后微生物生長快速，在發(fā)酵終端時生物量與未加CTAB的生物量相當(dāng)。有益效果本發(fā)明為生物發(fā)酵制氫領(lǐng)域開創(chuàng)一個嶄新的思路，從降低細(xì)胞胞內(nèi)氫氣分壓的原理出發(fā)，篩選出一種既能有效增加細(xì)胞膜的通透性又對微生物生長無明顯抑制的表面活性劑CTAB作為添加劑，克服了目前生物厭氧發(fā)酵制氫的成本居高不下，產(chǎn)氫效率低下的問題，成功實(shí)現(xiàn)累計(jì)產(chǎn)氫量提高38%，最大產(chǎn)氫速率提高44%的效果。本發(fā)明操作簡單，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)。
圖1為不同濃度的CTAB對細(xì)胞膜通透性的影響；
圖2為不同濃度的CTAB對微生物生長的影響；圖3為實(shí)施例所用的實(shí)驗(yàn)裝置；
圖4為實(shí)施例I的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比 圖5為實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比 圖6為實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例I
500mL錐形瓶中作為批式反應(yīng)器，在其中加入IOOmL的培養(yǎng)基、O. Img的刃天青，再加入5mL質(zhì)量濃度為O. 2g/L的十六烷基三甲基溴化銨溶液，混合均勻后，在121°C的條件下滅菌15min，然后接種5mL取自牛糞發(fā)酵后的液體，再向錐形瓶和與之相連的堿洗瓶中通入無菌氮?dú)庵敝涟l(fā)酵體系的顏色由粉色變?yōu)闊o色(通氣時間約為lOmin)，然后密封無菌氮?dú)馔ㄈ肟?，?7°C恒溫、155r/min的條件下?lián)u瓶震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的氣體通過通氣管道進(jìn)入裝有濃度為2mol/L氫氧化鈉溶液的堿洗瓶中，然后收集從堿洗瓶中溢出的氣體即為發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣；
所述的培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氫二鉀、2g的硫酸銨、6 g的磷酸二氫鉀和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余為蒸餾水，配制好的培養(yǎng)基在使用前在121°C的條件下滅菌15min ；
所述的取自牛糞發(fā)酵后的液體，其細(xì)菌細(xì)胞密度為I. 8^2. 2。實(shí)驗(yàn)裝置如附圖3所示。采用氣相色譜檢測氫氣含量，具體條件為Porapak Q不銹鋼填充柱，柱溫80°C，載氣為氮?dú)?，流速?0 mL/min，進(jìn)樣室溫度為80°C，檢測室熱導(dǎo)檢測器(TCD)，檢測室溫度120 °C，橋電流 150 mA。產(chǎn)氫速率的計(jì)算方法修正的Gompertz方程能較好地描述間歇實(shí)驗(yàn)中微生物生長隨時間的變化規(guī)律，其表達(dá)式為
權(quán)利要求
1.一種強(qiáng)化厭氧發(fā)酵制氫的方法，其特征在于，包含以下步驟按照體積比，在發(fā)酵容器中加入100份的培養(yǎng)基，并按照每升培養(yǎng)基中加入Img刃天青的比例加入刃天青，再加入5份質(zhì)量濃度為O. 2^0. 6g/L的十六烷基三甲基溴化銨溶液，混合均勻后，在121°C的條件下滅菌15min，然后接種5份取自牛糞發(fā)酵后的液體，再向發(fā)酵容器和與之相連的堿洗瓶中通入無菌氮?dú)庵敝涟l(fā)酵體系的顏色由粉色變?yōu)闊o色，然后密封無菌氮?dú)馔ㄈ肟冢?7°C恒溫、155r/min的條件下震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的氣體通過通氣管道進(jìn)入裝有濃度為2 4mol/L氫氧化鈉溶液的堿洗瓶中，然后收集從堿洗瓶中溢出的氣體即為發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣； 所述的培養(yǎng)基的組成為每升培養(yǎng)基中含有IOg的木糖、5g的蛋白胨、14g的磷酸氫二鉀、2g的硫酸銨、6 g的磷酸二氫鉀和O. 2 g的MgSO4 · 7H20，其余為蒸餾水，配制好的培養(yǎng)基在使用前在121°C的條件下滅菌15min。
全文摘要
一種強(qiáng)化厭氧發(fā)酵制氫的方法，在發(fā)酵容器中加入培養(yǎng)基刃天青和十六烷基三甲基溴化銨溶液，混合均勻后，滅菌然后接種取自牛糞發(fā)酵后的液體，再向發(fā)酵容器和與之相連的堿洗瓶中通入無菌氮?dú)庖灾脫Q空氣，然后密封無菌氮?dú)馔ㄈ肟诤銣卣鹗幣囵B(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生的氣體經(jīng)過堿洗后收集起來得到氫氣。本發(fā)明通過在發(fā)酵基質(zhì)中添加十六烷基三甲基溴化銨，克服了目前生物厭氧發(fā)酵制氫的成本居高不下，產(chǎn)氫效率低下的問題，成功實(shí)現(xiàn)累計(jì)產(chǎn)氫量提高38%，最大產(chǎn)氫速率提高44%的效果。本發(fā)明操作簡單，成本低廉，易于實(shí)現(xiàn)。
文檔編號C12P3/00GK102876723SQ20111043119
公開日2013年1月16日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者任云利, 趙爽, 劉振, 王鍵吉, 尹衛(wèi)平 申請人:河南科技大學(xué)