專利名稱：用于鑒定腸膜明串珠菌的引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及用于鑒定腸膜明串珠菌的引物及其應用。
背景技術：
腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)是乳酸菌中的明串珠菌屬的重要菌種，一般存在于植物體表，常用于發酵乳制品、青貯、泡菜和果酒中。它能夠降解葡苷聚糖為寡糖，發酵糖類產生多種酸和醇，具有高產酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等特性，已被廣泛應用于醫藥、食品和生化制劑等行業，還將有望成為新型微生態制劑。目前國內分離鑒定腸膜明串珠菌多采用平面培養法、生理生化試驗等傳統檢驗方法，上述方法存在檢出周期長、自動化程度低、準確性差等缺點。隨著分子生物學的發展， 16S rDNA序列分析逐漸被用于乳酸菌的分離鑒定。測序前PCR擴增是以堿裂解等方法抽提的DNA為模板，成功率高，然而顯得較為繁瑣。從大量樣品中定向篩選某種菌時，16S rDNA 序列測序分析成本也較高。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于鑒定腸膜明串珠菌的引物，該引物能夠特異性擴增腸膜明串珠菌16S rDNA的部分序列，擴增特異性高，時間短，能夠準確、快速鑒定腸膜明串珠菌。本發明的另一目的是提供該引物在鑒定腸膜明串珠菌中的應用，該引物用于鑒定腸膜明串珠菌過程簡單，鑒定方法穩定、高效。同時，采用菌落PCR方法，將樣品跳過DNA抽提這一步，而直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，不僅縮短了檢測時間，也降低了檢測成本。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供一種用于鑒定腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的引物， 其特征在于正向引物具有序列表中SEQ ID No :1所述的堿基序列，反向引物具有序列表中SEQ ID No :2所述的堿基序列。本發明所述的引物序列可用于鑒定腸膜明串珠菌，鑒定過程如下(1)使用所述的引物對待測菌株進行菌落PCR擴增；(2)利用電泳檢測PCR產物，在430bp處產生特異性擴增條帶的菌株，則判斷為腸
膜明串珠菌。其中，制備待測菌株的模板的過程如下用滅菌的牙簽或槍頭挑取微量待測菌株的單菌落至0. 5mL的離心管中，PCR擴增94°C變性時，菌體熱解后暴露的DNA即為模板。其中，菌落PCR擴增程序如下95°C預變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s， 72°C延伸30s，進行30次循環，最后72°C延伸IOmin。其中，所述的瓊脂糖凝膠為質量體積比為2%的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色。
其中，本發明制備待測菌株模板的過程中涉及的腸膜明串珠菌僅為實驗材料，本發明不限定特定菌株，可為現在國內外公開或可購買的任何一株腸膜明串珠菌，也可為任意的自行分離材料，無論任何一株腸膜明串珠菌均不影響本發明的實施。本發明的引物可為現在任何一株腸膜明串珠菌進行鑒定，與現有技術相比，本發明的技術方案具有如下優點本發明的用于鑒定腸膜明串珠菌的引物序列能夠特異性擴增腸膜明串珠菌16S rDNA的部分序列，擴增特異性高，能夠準確、快速鑒定腸膜明串珠菌。該引物用于鑒定腸膜明串珠菌的菌落PCR過程簡單，鑒定方法穩定、高效，不僅縮短了檢測時間，而且降低了檢測成本(表1)。本發明為腸膜明串珠菌種質資源鑒定提供了檢測方法，進而為篩選腸膜明串珠菌的優良菌株奠定了基礎。表1本發明的檢測方法與傳統檢測方法的比較
權利要求
1.用于鑒定腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)的引物，其特征在于正向引物具有序列表中SEQ ID No 1所述的堿基序列，反向引物具有序列表中SEQ ID No :2所述的堿基序列。
2.如權1所述的引物在鑒定腸膜明串珠菌中的應用，其特征在于鑒定過程如下(1)使用權1所述的引物對待測菌株進行菌落PCR擴增；(2)利用電泳檢測PCR產物，在430bp處產生特異性擴增條帶的菌株，則判斷為腸膜明串珠菌。
3.如權2所述的引物在鑒定腸膜明串珠菌中的應用，其特征在于菌落PCR的模板的制備過程如下用滅菌的牙簽或槍頭挑取微量待測菌株的單菌落至0. 5mL的離心管中，PCR擴增94°C變性時，菌體熱解后暴露的DNA即為模板。
4.如權2所述的引物在鑒定腸膜明串珠菌中的應用，其特征在于菌落PCR擴增程序如下95 °C預變性5min，94 V變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s，進行30次循環，最后72 °C 延伸lOmin。
5.如權2所述的引物在鑒定腸膜明串珠菌中的應用，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠為質量體積比為2 %的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色。
全文摘要
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及用于鑒定腸膜明串珠菌的引物及其應用。本發明的用于鑒定腸膜明串珠菌的引物能夠特異性擴增腸膜明串珠菌16S rDNA的部分序列，擴增特異性高，能夠準確、快速鑒定腸膜明串珠菌。該引物用于鑒定腸膜明串珠菌過程簡單，鑒定方法穩定、高效，不僅縮短了檢測時間，而且降低了檢測成本。本發明為腸膜明串珠菌種質資源鑒定提供了檢測方法，進而為篩選腸膜明串珠菌的優良菌株奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/04GK102433385SQ20111042947
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者劉婷, 劉瀅, 杜建濤, 王安如, 胡婷 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京科高大北農飼料有限責任公司, 哈爾濱大北農牧業科技有限公司