專利名稱：一種重金屬鎘抗性相關的基因LakeGST1及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域和生物修復領域，具體涉及一種重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl及其應用。
背景技術：
隨著礦產資源的開發利用以及工業的發展，重金屬對環境造成的污染日趨嚴重， 土壤重金屬污染已經成為一個危害全球環境質量的問題。土壤重金屬會影響植物的生長發育，降低農作物的產量和質量，帶來了嚴重的經濟損失。此外，受土壤重金屬污染的作物在植物體中積累，并通過食物鏈富集到人體和動物體中，危害人畜健康，引發癌癥和其他疾病。治理重金屬污染刻不容緩，各種修復技術和措施正在研究和應用中。各國政府和科學家著力通過兩個途徑解決這一問題一為利用物理的、化學的方法試圖清除土壤或水體的重金屬污染二為利用現代生物技術清除污染。自從20世紀80年代以來，生物修復技術因其具有處理費用低、對環境影響小、效率高等優點，越來越受到廣大科技人員的廣泛關注。生物修復一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型，其中植物修復和微生物修復是研究的熱點。微生物修復就是利用微生物將環境中的污染物降解或轉化為其他無害物質的過程。近年來，基于微生物對重金屬的作用機理，以修復有毒有害金屬污染或回收有經濟價值重金屬為目的的生物處理技術日趨成熟。植物修復指利用植物去治理水體、土壤和底泥等介質中的污染的技術。然而用于重金屬污染修復的生物往往會受到重金屬的毒害，生長緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對植物和微生物的毒害作用是生物修復的主要限制因素。解決生物修復中重金屬對生物的毒害作用的根本途徑在于研究耐受重金屬的分子生物學機制，克隆對重金屬耐受的關鍵基因，通過基因工程手段獲得用于生物修復中性能優良的轉基因工程生物。由于技術上的原因，直到最近，對微生物基因資源的利用主要局限于可培養微生物。然而，已培養微生物僅占自然界中微生物的不到1%，因此各種生境中的微生物宏基因組是一個巨大而未發掘的基因資源庫。極端環境具有豐富的微生物資源，當中許多與逆境和關鍵生命過程相關的基因在長期的適應進化中獲得了更強的耐性潛能，發掘這些抗性基因已成為國際重要的研究熱點。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學研究的重要系統。 AMD來源于采礦活動使含硫礦物(主要為黃鐵礦，FeS2)暴露于空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產酸所致，其pH值一般在I- 4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和 Ni等重金屬，是采礦業面臨的最嚴重環境問題之一。在AMD中生存的原核微生物在長期的進化過程中逐漸形成了一些獨特機制，以應對低PH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環境協迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫。谷胱甘肽S轉移酶(GSTs，EC 2. 5. I. 18)是一個多功能蛋白家族，它在細胞對許多的外源和內源的毒性物質的解毒作用中起著重要作用。1970年，Frear和Swanson等人首次從玉米中發現了 GST，隨后研究者又從許多其他植物和高等生物中分離到了 GST。GST家族由許多細胞質GST，線粒體GST和MAPEG組成。GST廣泛分布在真核生物和原核生物中， 在不同生物內GSTs的類型也不同α，μ, ji , θ , σ , ζ和ω存在于哺乳動物中，Φ 和τ在植物體內存在，δ分布在昆蟲中，β存在于細菌中。哺乳動物的細胞質GSTs都由二聚體組成，每個GST亞基大小在22_30kDa之間，由氨基端的α/β結構域和羧基端的 α螺旋結構域組成。每個亞基上都有一個獨立的配體結合位點一個谷胱甘肽結合位點(G 位點)，一個疏水底物結合位點(H位點)。GSTs能催化GSH的巰基與多種親電底物的結合，生成水溶性的產物，從而降低底物的毒性。另外，GSTs還能充當過氧化物酶，異構酶和硫醇轉移酶的作用。Yang等在2001 年發現GSTs有助于細胞抵抗脂質過氧化作用。Cancado等人也發現玉米中GST27. 2對于抵抗鋁毒害發揮著重要作用。Adamis等人發現酵母在鎘脅迫下，GTTl和GTT2 (酵母中GTTl 和GTT2編碼有功能的GST)在鎘解毒機制中起著不同的作用相比野生型酵母，gtt2A表現出對鎘較高的抗性，而gttl Δ則表現出較低的抗性。Won最近發現沙蠶GSTs的表達量和活性隨著鎘濃度的升高而升高，這意味著GSTs可能在細胞抵抗鎘毒害過程中起著重要作用。然而，迄今為止GST基因在微生物中對重金屬鎘抗性究竟起什么作用仍不清楚， 也沒有從AMD微生物中克隆到GST基因的報道。AMD中重金屬含量極高，那么AMD微生物中哪些基因對重金屬抗性起著關鍵作用？ GST基因是否對AMD微生物的生長和生存起著重要的作用？這些問題仍然尚待解決。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種重金屬鎘抗性相關的基因 LakeGSTl，本發明的另一個目的是提供上述基因編碼的蛋白質即谷胱甘肽S轉移酶，本發明的進一步目的是提供上述基因及其編碼的蛋白質的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現
本發明從酸性礦山廢水(AMD)微生物中克隆了一個新的谷胱甘肽S轉移酶基因，命名為LakeGSTl，并對其對重金屬鎘的抗性進行了功能分析。本發明提供的一種重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl，其堿基序列如SEQ ID NO: I所示。本發明提供的一種上述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl編碼的蛋白質，為如下蛋白質⑴或(ii)
(i)由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
( )在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生與蛋白質(i)具有相同的功能的蛋白質。具體地，上述蛋白質為谷胱甘肽S轉移酶。本發明還提供了上述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl以及其編碼的蛋白質在治理環境鎘污染中的應用，具體來說可用于培育高生物量的重金屬超富集植物或微生物， 用于重金屬污染土壤和水體的生態修復。含有上述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl的表達載體,所述表達載體優選的出發載體為pET28a，即載體pET28a中插入重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl的編碼序列。一種基因工程菌，含有上述的表達載體，具體是由該表達載體轉染大腸桿菌得到
4的。該基因工程菌在治理環境鎘污染中的應用，如可以用于制備具有鎘離子抗性的轉基因植物或直接投放到環境鎘污染中。尤其是對于鎘離子濃度在200μΜ以下的環境治理效果最好。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明提供的基因及所編碼的蛋白質通過大腸桿菌轉化實驗證明可以提高大腸桿菌中對鎘的抗性，在200 μ M Cd2+濃度下，表達LakeGSTl基因的大腸桿菌在培養過程中都可以生長。本發明可用于提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性，進一步用于清除環境重金屬污染，為生物修復提供性能優良的生物資源，在提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性方面有著重大的應用價值。
圖I為LakeGSTl在大腸桿菌中的表達時相，M為蛋白分子量標準；
I 為攜帶空載體 pET28a 的 BL21 (DE3)菌株；2_9 為攜帶 pET28a_LakeGSTl 的 BL21 (DE3) 菌株誘導表達0-7小時后的電泳結果；
圖2為表達LakeGSTl的大腸桿菌在不同鎘濃度下培養12小時后的生長情況；
圖3為表達LakeGSTl的大腸桿菌在150μΜ鎘脅迫下的生長曲線。
具體實施例方式實施例I
LakeGSTl基因全序列的克隆 (一)野外微生物樣品采集
在云浮鉛/鋅礦選取不同酸化階段(pH值為2，4，6)的AMD，使用O. 22 μπι的濾膜收集 20L AMD里面的細胞。為了保持核酸的完整保存，保存樣品凍于液氮中，24小時內帶回實驗室，并放于_70°C冰箱長期保存。(二)核酸的提取
DNA提取采用SET方法，過程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30 min后，15000rpm離心15 min后用氯仿抽提2次,用異丙醇沉淀過夜后,用75 %乙醇清洗 2次,最后溶于滅菌水中。用Qiagen tip-100柱純化回收基因組DNA,用核酸蛋白分析儀檢測DNA質量及濃度。(三)基因組測序
用 Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 制備上機樣品。 使用Roche 454 Genome Seqencer FLX測序儀,通過進行測序,用Pyrobayer軟件獲取堿基序列。(四)基因組序列分析
去除低質量的測序結果后，對基因組進行如下分析
序列拼接使用Euler-SR及454公司的GS De Novo Assembler Software進行序列拼接。用N50指數評價拼接的效果。基因組注釋將拼接好的微生物的全基因組序列用MG和SEED系統進行基因組的注釋，發現新的基因。
(五)LakeGSTl基因片段的克隆
通過PCR方法，以從AMD中提取的DNA為模板，根據基因組測序并拼接得到的基因序列設計一對引物
LAKE111: ATGAAGTTATATTATAGCCCCGGC (SEQ ID NO:3)
LAKE111: TTAAGAACTCTGGATGAGCCCTT (SEQ ID NO:4)
PCR獲得一條600bp大小的條帶,并克隆到PCR2. I (購自invitrogen公司)載體中， 序列委托invitrogen公司測定。(六)LakeGSTl基因序列分析
測序結果表明GST基因大小為615bp (見圖I)，編碼204個氨基酸(見圖2)
實施例2
LakeGSTl基因的功能分析
本實施例中利用大腸桿菌轉化實驗分析LakeGSTl基因的功能。(一 )構建重組表達載體
設計以下一對弓丨物，在LakeGSTI基因5 ’引入BamHI酶切位點，3 ’引入XhoI酶切位點。LakeGSTl-F: 5’ CGCGGATCCATGGACACGGTATGTTCAGAAGG3’(SEQ ID NO:5); LakeGSTl-R: 5’ CCGCTCGAGTGATCCCTGCATCAACCATTGT3’ (SEQ ID N0:6)。以PCR2. I-LakeGSTl載體為模板進行PCR。分別將PCR產物和酵母穿梭表達載體 pET28a用BamHI和XhoI進行酶切，將酶切產物回收、連接、并轉化大腸桿菌DH5 α。經測序并酶切鑒定，得到了 pET28a-LakeGSTl重組子。(二)蛋白表達
將重組子pET28a-LakeGSTI轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3 )，通過PCR驗證篩選陽性克隆。挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養。將Iml 菌液加入到含100ml LB培養基(含Kan 50 μ g/ml), 37°C震蕩培養至0D600約為O. 4-1. O (最好O. 6，大約需2小時)。加入IPTG至終濃度為ImM進行誘導，每隔I小時收集Iml菌液，離心12000gX60s 收獲沉淀，用80μ1 (1冊20重懸，加入2(^1 5XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴 IOmin0取上清作為樣品做SDS-PAGE分析(見圖I)。(三)轉化子對重金屬鎘抗性的測定
挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養。將IOOul 菌加入至Ij IOml Cd2+濃度分別為0μΜ、50μΜ、100μΜ、150μΜ、200μΜ的LB培養基(含Kan 50 μ g/ml、IPTGlmM)中，37°C、200rpm 震蕩培養 12 小時，分別測定 0D600 值。根據實驗結果，選取Cd2+濃度為150 μ M作為脅迫條件，進行了生長曲線的測定。 挑取含重組質粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan 50 μ g/ml)中37°C過夜培養。將IOOul菌加入到 IOml Cd2+濃度為 150μΜ 的 LB 培養基(含 Kan 50 μ g/ml、IPTGlmM)中，37°C、200rpm 震蕩培養，每隔2小時測定0D600值。實驗結果表明，表達LakeGSTl基因的BL21 (DE3)在0-200 μ M Cd2+濃度下都可以正常生長，而空載體對照在Cd2+濃度超過150 μ M時便不能生長(見圖2)。在150 μ MCd2+濃度下，表達LakeGSTl基因的BL21 (DE3)在培養過程中都可以生長，而空載體對照的生長一直受到抑制(見圖3)。實驗結果說明，LakeGSTl對重金屬鎘的防御起著重要作用。
權利要求
1.一種重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl，其特征在于其堿基序列如SEQ ID NO: I所/Jn ο
2.—種權利要求I所述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl編碼的蛋白質，其特征在于為如下蛋白質⑴或(ii)(i)由SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；( )在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列經過取代、缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生與蛋白質(i)具有相同的功能的蛋白質。
3.權利要求I所述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl在治理環境鎘污染中的應用。
4.權利要求2所述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl編碼的蛋白質在治理環境鎘污染中的應用。
5.含有權利要求I所述重金屬鎘抗性相關的基因LakeGSTl的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體,其特征在于出發載體為pET28a。
7.一種基因工程菌，其特征在于含有權利要求6所述的表達載體。
8.權利要求7所述基因工程菌在治理環境鎘污染中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于環境鎘污染中的鎘離子濃度為200μΜ以下。
全文摘要
本發明公開了一種重金屬鎘抗性相關的基因LakeGST1及其編碼的蛋白質和應用。該重金屬鎘抗性相關的基因LakeGST1序列如SEQIDNO:1所示，編碼的蛋白質序列如SEQIDNO:2所示。轉化大腸桿菌實驗證明該基因在大腸桿菌中的表達可以提高其對重金屬鎘的抗性。本發明可用于提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性，進一步用于清除環境重金屬污染，為生物修復提供性能優良的生物資源。
文檔編號C12N15/54GK102604973SQ201110428450
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者俞陸軍, 廖斌, 束文圣, 胡敏, 謝麗娟, 陳亮 申請人:中山大學