專利名稱：一種快速分離辣椒疫霉菌的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬植物病理學技術領域，具體涉及一種快速分離辣椒annuumLinn)疫霉菌capsici Leonian)的方法及其專用培養基。
背景技術：
辣椒疫病是辣椒最重要的真菌性病害，在辣椒的整個生育周期內都可發病，除危害辣椒的根、莖、枝、葉和果實外，還危害番茄、茄子、黃瓜、甜瓜等作物，常引起大面積死株，一般田塊死株率為20% 30%，嚴重的達90%以上，可造成毀滅性損失，并在各種植區均有發生，高溫、高濕地區尤其猖獗，局部地區危害嚴重，減產率嚴重的高達60%，嚴重影響到農民的經濟收益和辣椒產業的發展。辣椒疫病是由疫霉屬(Phytophthora)卵菌，辣椒疫霉菌力ora capsiciLeonian)引起的辣椒病害。表現為葉水漬斑、幼苗猝倒、根莖腐、冠腐、枝干、果實潰瘍和腐爛等，植株受害部位產生邊緣不明顯的黑褐色水漬狀病斑，可迅速引起病部的壞死和腐爛，潮濕時，病部尤其是葉背面產生疏松的白色霉層，即病菌的孢囊梗和孢子囊。在對辣椒疫病的研究中，首先需對病原菌進行分離和培養，現有技術采用病莖處理分離培養方法存在所用時間長，分離到的菌株率低(61. 82%)，且易受雜菌污染，費工費時等問題。研究出新的簡便快速的分離方法是提高辣椒疫病基礎研究的重要環節，也是本領域急待解決的一個技術問題。本發明人歷經3年，做了大量的試驗研究，發明了一種快速分離辣椒病霉菌的方法及專用培養基，用于辣椒疫病的基礎研究。
發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有辣椒疫霉菌的分離培養過程中分離率低、費工費時的技術問題，其目的是提供一種經濟、簡易、快捷，且分離率高的一種快速分離辣椒疫霉菌的方法及其對辣椒疫霉菌分離培養效率高的專用培養基。為解決上述技術問題，本發明的技術方案如下1、一種快速分離辣椒疫霉菌的方法，按以下步驟進行(1)病樣編號分離前將采集辣椒植株上感染了辣椒疫病的病莖或病葉按不同采樣的地點、品種進行編號；
(2)病樣切取將編號后的病莖，以病樣的病部與健康部的交界處為中心，切取病健部分共長度為9 Ilcm的病樣，并使病樣中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病樣長度的1/2，用自來水清洗后晾干表面水分；
(3)病樣消毒將上述切取的病樣用質量分數為75%酒精噴霧，再用質量分數為1%次氯酸鈉液浸泡30秒，用無菌水清洗后晾干水分；
(4)專用培養基的配制
將蒸餾水1000ml、黑麥60g、蔗糖20g和瓊脂18g混合制成基本培養基，將所述的基本培養基高壓滅菌后冷至40 50°C時，加入IOmg的利福平和IOOmg劑型為70%五氯硝基苯粉劑，搖勻，即制成所述的專用培養基，然后倒入滅菌培養皿中備用；(5)無菌操作室分離
將步驟(3)的病樣在無菌操作臺內進行剪取分離培養，先剪去該病莖的四周，再以病樣的病部與健康部的交界處為中心，剪成長度為0. 4 0. 5cm的病莖塊，并使每塊病莖中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病莖塊長度的1/2，再用鑷子將所剪的0. 4 0. 5cm病樣接入步驟(4)配制的專用培養基中，每皿接入5塊病樣，放在20°C恒溫箱中培養，3-5天后長出辣椒疫霉菌菌絲再進行轉接純化。2、一種分離培養辣椒疫霉菌的專用培養基，通過下述方法制備得到
將蒸餾水1000ml、黑麥60g、蔗糖20g和瓊脂18g混合制成基本培養基，將所述的基本培養基高壓滅菌后冷至40 50°C時，加入IOmg的利福平和IOOmg劑型為70%五氯硝基苯粉劑，搖勻即制成所述的專用培養基。本發明的原理及其有益效果
本發明通過實驗研究發現常規分離方法在病樣切取和病樣分離培養時均采用小塊病莖(0. 5cm)，在消毒的過程中，如果消毒過重、病塊太小，消毒藥劑易滲透到病樣的內部，不但殺死了病樣表面的雜菌，也殺死了病樣內部需要分離和培養的疫霉菌，使疫霉菌難以培養，因此分離率較低；另外，如消毒不夠，在切取時傷口帶有雜菌等沒有消毒干凈，分離易受雜菌感染，難以分離純化；如果切取病樣晾干后放置時間過長，周圍傷口收縮，難以分離出來疫霉菌。本發明方法采用大塊處理，小塊分離的操作，先切取大塊病樣(9 Ilcm長病莖)、適宜的消毒時間，病樣晾干并即在無菌操作臺內將消毒處理的大塊病樣切成小塊病樣(0. 4 0. 5cm長病莖)隨即接種入培養基，使在消毒的過程中，消毒藥劑難于滲透到病樣的內部，只能殺死病樣表面的雜菌，疫霉菌很好的保存在組織內，在無菌操作臺內的操作使新傷口具有純度的辣椒疫霉菌，疫霉菌就能很好的生長起來，提高了分離培養率，在加之本發明適宜的專用培養基，使本發明的辣椒疫霉菌的分離率平均達到81. 99%，比對照方法分離率平均提高32. 6% ；(對照處理方法分離率平均為61. 82%)，分離用時平均僅需31. 6分鐘，分離時間比對照處理方法平均縮短了 31. 7分鐘(對照處理方法分離用時平均63. 3分鐘)，分離時間平均縮短50. 1%，效果特別顯著，并且操作簡便易行，易被同領域技術人員掌握。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步描述。實施例1
(1)病樣的采集和編號
本實施例作10個病樣，采樣地是云南省玉溪市澄江縣，品種為本地辣椒。編號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ；病樣材料均為新鮮病莖，各病樣處理設3次重復，每次重復4皿，每皿接5塊病樣，共60塊即總接種點數為60。(2)病樣切取將編號后的病莖，以病樣的病部與健康部的交界處為中心線，切取病健部分共長度為9 Ilcm的病樣，并使病樣中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病樣長度的1/2，用自來水清洗后晾干表面水分。(3)病樣消毒將上述切取病樣用質量分數為75%酒精噴霧，再用質量分數為1%次氯酸鈉液浸泡30秒，用無菌水清洗后晾干水分。
(4)專用培養基的配制
將蒸餾水1000ml、黑麥60g、蔗糖20g和瓊脂18g混合制成基本培養基，將所述的基本培養基高壓滅菌后冷至40 50°C時，加入IOmg的利福平和IOOmg劑型為70%五氯硝基苯粉劑，輕輕搖勻，即制成所述的專用培養基，然后倒入滅菌培養皿中備用。(5)無菌操作室分離
將步驟(3)消毒晾干的的病樣在無菌操作臺內進行剪取分離培養，先剪去該病莖的四周，再以病樣的病部與健康部的交界處為中心，剪成長度為0. 4 0. 5cm的病莖塊，并使每塊病莖中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病莖塊長度的1/2，再用鑷子將所剪的0. 4 0. 5cm病樣接入步驟(4)配制的專用培養基中，每皿接入5塊病樣，放在20°C恒溫箱中培養，3-5天后長出辣椒疫霉菌菌絲再進行轉接純化。對照采用常規方法，病樣材料及編號與實施例1相同，其中切取的病樣與分離培養的病樣均是0. 4 0. 5cm病樣。計算公式
分離率=(辣椒疫霉菌落數/總接種點數)X100%
表1 本發明方法與對照辣椒疫霉菌的分萬試驗效巢比較
本細(^mm,小躲對照( ! 的小麵分萬耗時(分鐘〉病mm小 mm本發明比樣菌落數(個)分離率菌落數(個)分萬對照分離本發對照本發明總接辣椒(%)總接辣椒率(%)率提高明方比對照號種點疫霉菌菌種點疫蕃菌(%)法縮短時數落數數菌落^fc間H、1605083. 3603253. 3303565302604778. 3604066. ？11.630582B3604676-7603253. 323.42360324605083. 3603558. 3253165345605085604168. 316.73671356604168.3803456. 11.63268367604981.760396516.73064348605388. 3604473. 3153258369605591.7604168. 323. 428583010605083.360335528.3346632.平- 均81.9961.8220.1731.663. 331·
從表1表明，本發明的大塊消毒處理，小塊分離方法處理的疫霉菌分離率平均達到81. 99%，而對照(常規方法的小塊消毒處理，小塊分離)處理的疫霉菌分離率平均為61. 82%，比對照平均提高了 32. 6% ；分離時間平均縮短31. 7分鐘(對照處理平均需63. 3分鐘)，分離時間平均縮短了 50. 1%,效果特別顯著，并且操作簡便易行。
權利要求
1.一種快速分離辣椒疫霉菌的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)病樣編號分離前將采集辣椒植株上感染了辣椒疫病的病莖或病葉按不同采樣的地點、品種進行編號；(2)病樣切取將編號后的病莖，以病樣的病部與健康部的交界處為中心，切取病健部分共長度為9 Ilcm的病樣，并使病樣中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病樣長度的1/2，用自來水清洗后晾干表面水分；(3)病樣消毒將上述切取的病樣用質量分數為75%酒精噴霧，再用質量分數為1%次氯酸鈉液浸泡30秒，用無菌水清洗后晾干水分；(4)專用培養基的配制將蒸餾水1000ml、黑麥60g、蔗糖20g和瓊脂18g混合制成基本培養基，將所述的基本培養基高壓滅菌后冷至40 50°C時，加入IOmg的利福平和IOOmg劑型為70%五氯硝基苯粉劑，搖勻，即制成所述的專用培養基，然后倒入滅菌培養皿中備用；(5)無菌操作室分離將步驟(3)的病樣在無菌操作臺內進行剪取分離培養，先剪去該病莖的四周，再以病樣的病部與健康部的交界處為中心，剪成長度為0. 4 0. 5cm的病莖塊，并使每塊病莖中病部組織的長度和健康部組織的長度各占病莖塊長度的1/2，再用鑷子將所剪的0. 4 0. 5cm病樣接入步驟(4)配制的專用培養基中，每皿接入5塊病樣，放在20°C恒溫箱中培養，3-5天后長出辣椒疫霉菌菌絲再進行轉接純化。
2.一種分離培養辣椒疫霉菌的專用培養基，通過下述方法制備得到將蒸餾水1000ml、黑麥60g、蔗糖20g和瓊脂18g混合制成基本培養基，將所述的基本培養基高壓滅菌后冷至40 50°C時，加入IOmg的利福平和IOOmg劑型為70%五氯硝基苯粉劑，搖勻即制成所述的專用培養基。
全文摘要
本發明提供一種快速分離辣椒疫霉菌的方法及其專用培養基，屬植物病理學研究技術領域。該分離方法由病樣處理、消毒、培養基配制等步驟組成。病樣選用新鮮采集的病莖，以病樣的病部與健康部分的交界處為中心，取9～11cm的病樣組織，用自來水清洗后晾干表面水分，用75%酒精均勻噴霧，再用1%次氯酸鈉液浸泡30秒后用無菌水清洗，晾干后在無菌操作臺內將該大塊消毒處理的病樣剪成小塊，利用專用培養基進行分離培養。本發明方法使辣椒疫霉菌的分離率平均達到81.99%，比常規(小塊消毒處理，小塊分離)處理方法分離率平均提高32.6%；分離用時平均僅需31.6分鐘，分離時間平均縮短50.1%，并且操作簡便易行。
文檔編號C12R1/645GK102391957SQ201110426860
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者孫道旺, 曹繼芬, 李向東, 楊明英, 趙志堅 申請人:云南省農業科學院農業環境資源研究所