一種死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法及微生物肥料生產(chǎn)方法

專利名稱：一種死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法及微生物肥料生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物的發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體涉及一種芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法、及由該發(fā)酵液制得微生物肥料的方法。
背景技術(shù)：
近年來，極端天氣狀況頻發(fā)，尤其是干旱氣候，全國(guó)各地幾乎都不能幸免。2009年連續(xù)3個(gè)多月，華北、黃淮、西北、江淮等地15個(gè)省、市未見有效降水，冬小麥告急，大小牲畜告急，農(nóng)民生產(chǎn)生活告急；2011年，受長(zhǎng)江中下游50年來最嚴(yán)重旱情影響，長(zhǎng)江水位走低， 使上海在5月份出現(xiàn)了原本在冬季才會(huì)出現(xiàn)的罕見嚴(yán)重咸潮，部分供水區(qū)域因之告急。干旱對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響顯而易見，雖然國(guó)家出臺(tái)各種有效措施來平抑物價(jià)過快上漲，但是旱情猶如“蝴蝶效應(yīng)”，對(duì)主要農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格的推高作用逐漸顯現(xiàn)。此外，全國(guó)大范圍推廣節(jié)水灌溉農(nóng)業(yè)，“十二五”規(guī)劃中已明確，未來五年將完成70%以上的大型灌區(qū)和50%以上的重點(diǎn)中型灌區(qū)續(xù)建配套和節(jié)水改造任務(wù)；凈增農(nóng)田有效灌溉面積4000萬畝；新增高效節(jié)水灌溉面積5000萬畝。但是如何提高土壤田間持水量和植物對(duì)水分的利用率，僅僅靠改變灌溉方式是不夠的。所以開展抗旱、保水農(nóng)業(yè)研究不僅勢(shì)在必行，而且已經(jīng)迫在眉睫。Y-聚谷氨酸(簡(jiǎn)稱Y-PGA)是自然界中微生物發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多聚氨基酸， 其結(jié)構(gòu)為谷氨酸單元通過α-氨基和Y-羧基形成肽鍵的高分子聚合物，分子量分布在 IOOkDa到IOOOOkDa之間。、-PGA具有優(yōu)良的水溶性、超強(qiáng)的吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的保水劑。另外，Y-PGA可以作為植物增產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)素， 在淹水條件下，Y -PGA會(huì)在植株根毛表層形成一層薄膜，不但具有保護(hù)根毛的功能，更是土壤中養(yǎng)份、水份與根毛親密接觸的最佳輸送平臺(tái)，能很有效率的提高肥料中養(yǎng)分的溶解、存儲(chǔ)、輸送與吸收；阻止硫酸根、磷酸根、草酸根與金屬元素產(chǎn)生沉淀作用，使作物能更有效的吸收土壤中磷、鈣、鎂及微量元素；促進(jìn)作物根系的發(fā)育，加強(qiáng)抗病性。Y-PGA還可以平衡土壤酸堿值，避免長(zhǎng)期施用化學(xué)肥料所造成的酸性土質(zhì)；有效螯合有毒重金屬；增強(qiáng)植物抗病及抗逆能力；可使茶葉、瓜果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品快速增產(chǎn)，增產(chǎn)量可達(dá)10 20%。肥料與保水劑復(fù)合一體化使用是水肥調(diào)控的重要技術(shù)，是肥料研究的國(guó)際前沿。 目前，多數(shù)研究集中在將保水劑與無機(jī)礦物和尿素結(jié)合，制成保水緩控釋化肥。毛小云等利用淀粉_丙烯酸鹽接枝共聚物和無機(jī)礦物復(fù)合，制成有機(jī)_無機(jī)復(fù)合保水肥，不僅有助于作物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，更減少了礦質(zhì)元素的淋溶作用。有機(jī)抗旱肥料BGA是一種由城鄉(xiāng)有機(jī)廢棄物經(jīng)資源化處理后制得的有機(jī)肥料，其抗旱機(jī)理主要是增加土壤中有機(jī)碳，促進(jìn)了土壤中有機(jī)無機(jī)復(fù)合膠體的形成，以膠體的吸水性來提高土壤中水分含量。對(duì)于保水型生物肥料的研究，在國(guó)內(nèi)外都尚少。但是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長(zhǎng)期過分依賴于化學(xué)肥料，造成大量不可再生能源的浪費(fèi)，農(nóng)田土質(zhì)變壞，肥力下降，農(nóng)作物產(chǎn)品殘留、品質(zhì)降低以及食品和環(huán)境污染的問題日益突出。因此，單一依靠保水劑與無機(jī)肥料結(jié)合生產(chǎn)保水緩控釋肥料，不能滿足可持續(xù)農(nóng)業(yè)和綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的要求。y -PGA生產(chǎn)菌株按照是否需要外源性的L-谷氨酸，可分成L-谷氨酸依賴型和L-谷氨酸非依賴型。我國(guó)目前的研究對(duì)象主要是L-谷氨酸依賴型菌株。L-谷氨酸作為 Y-PGA發(fā)酵生產(chǎn)的前體，對(duì)發(fā)酵液中Y-PGA的積累具有重要的影響。目前，產(chǎn)Y-PGA的菌株主要集中在芽孢桿菌不同菌株之間，如枯草芽孢桿菌IF03335和TAM-4以及部分短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌菌株。Y -PGA產(chǎn)生菌大部分是從豆制品等材料中獲得的芽孢桿菌， 而從土壤和氨基酸廢料堆中篩選的并不多見。中國(guó)專利申請(qǐng)2010102585 17. 2公開了一種從土壤中分離得到的死谷芽孢桿菌以及其發(fā)酵培養(yǎng)方法，用這種方法得到的發(fā)酵液中菌體含量彡 lX109f/mL。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以得到更大菌體含量的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)其特征在于在所述發(fā)酵培養(yǎng)工序中，培養(yǎng)基的初始pH為6. 0 7. 0，菌株溫度30°C 37°C，氮源用量為5 10g/L，碳源用量為15 25g/L。所述死谷芽孢桿菌的培養(yǎng)基采用常規(guī)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一般為谷氨酸鈉10g/L， MgS04 · 7H20 0. 25g/L, CaCl2 · 2H20 0. lg/L, K2HPO4 2g/L。上述死谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 3478 (在專利申請(qǐng)201010258517. 2中首次提及)。主要生物學(xué)特性為菌株為長(zhǎng)桿狀，有莢膜和鞭毛，芽孢中生，革蘭氏染色為陽性，具有葡萄糖產(chǎn)酸，好氧，接觸酶陽性，石蕊牛奶還原陽性，明膠液化，分解酪素，不分解酪氨酸。根據(jù)本發(fā)明所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，優(yōu)選的是，所述氮源為酵母膏。根據(jù)本發(fā)明所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，優(yōu)選的是，所述碳源為蔗糖或糖化玉米粉。優(yōu)選的是，所述發(fā)酵培養(yǎng)工序中的裝液量為20% 30%。該裝液量可以更好地保持發(fā)酵罐的通氣性。優(yōu)選的是，48h發(fā)酵液中活菌或芽孢為3. 4 5. 1 X 1010CFU/mL以上。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種利用上述死谷芽孢桿菌生產(chǎn)微生物肥料的方法。一種含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，包括原料的處理和菌劑與原料的混合，該方法包括以下步驟(1)原料的處理將水解渣敲碎成粉末或小顆粒，與堿性物質(zhì)混合，使處理后的水解渣原料PH達(dá)到5. 5-8. 0 ；(2)采用上述的發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵死谷芽孢桿菌，得到的發(fā)酵液用吸附介質(zhì)吸附后得到菌劑，與步驟⑴所得的水解渣按菌劑水解渣=1-30 100的質(zhì)量比混合。上述步驟⑴用堿性物質(zhì)的作用是調(diào)節(jié)水解渣原料的pH值，使其達(dá)到微生物肥料的范圍。該堿性物質(zhì)優(yōu)選為石灰、KOH或NaOH的一種。根據(jù)本發(fā)明所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，優(yōu)選的是，所述水解渣為氨基酸生產(chǎn)過程的發(fā)酵產(chǎn)物。進(jìn)一步地，所述步驟(2)中還可加入無機(jī)肥料和/或微量元素肥料。如果需要制造更高養(yǎng)分含量或者含微量元素的微生物肥料，可以在上述得到的微生物肥料中加入無機(jī)肥料或微量元素肥料，也可以同時(shí)加入無機(jī)肥料和微量元素肥料。氨基酸生產(chǎn)過程中的發(fā)酵產(chǎn)物水解渣(水解濾餅)由于其強(qiáng)酸性，隨水流失或棄于土壤會(huì)造成水質(zhì)、土壤酸化而造成污染，國(guó)家嚴(yán)禁排放；同時(shí)強(qiáng)酸性亦使得其無法有效利用而造成積壓。由于其產(chǎn)出量大，堆放場(chǎng)地大，是長(zhǎng)期困擾氨基酸生產(chǎn)企業(yè)的難題。經(jīng)過檢測(cè)，水解渣除酸性強(qiáng)外，還含有大量的有機(jī)質(zhì)、谷氨酸、腐殖酸和中微量元素，其中谷氨酸是生產(chǎn)Y-PGA的重要前體，因此，氨基酸水解渣是生產(chǎn)保水型微生物肥料的優(yōu)質(zhì)原料。本發(fā)明的技術(shù)原理是利用可產(chǎn)Y-PGA菌株發(fā)酵特性獲得大量菌體，與其他微生物復(fù)合成為保水型復(fù)合微生物菌劑，再與含有大量谷氨酸的有機(jī)原料混合成為保水型復(fù)合微生物肥料。施入土壤后，除保水型微生物肥料中本身所含Y-PGA外，微生物在土壤中利用有機(jī)物料以及養(yǎng)分繼續(xù)代謝過程，尤其是位于根際的微生物。這些微生物活動(dòng)不斷產(chǎn)生
Y-PGA，從而增加土壤保水抗旱能力。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)，可使發(fā)酵產(chǎn)生最大菌量，較以往芽孢桿菌48h發(fā)酵菌株量大約為1.0 5. OX 109CFU/mL增加了一個(gè)數(shù)量級(jí)。上述保水型復(fù)合微生物肥料是根據(jù)根際土壤微生態(tài)學(xué)和植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)原理，以產(chǎn)Y-PGA菌株為核心，與多種有益微生物(固氮菌、解磷菌、鉀細(xì)菌)復(fù)合，以優(yōu)質(zhì)氨基酸有機(jī)質(zhì)為載體，再配以少量的無機(jī)養(yǎng)分及微量元素加工而成的具有無污染、無公害，適于生產(chǎn)綠色食品的新型抗旱肥料。本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于(1)從氨基酸廢料堆及其堆放土壤中篩選產(chǎn)Y -PGA菌株，并首次用于生產(chǎn)氨基酸微生物肥料，使微生物在與自然態(tài)相似的環(huán)境中定殖，解決了菌株難以存活的問題，也為微生物肥料生產(chǎn)提供了新的菌種資源。(2)通過對(duì)菌株P(guān)GA23發(fā)酵條件優(yōu)化，保證菌株發(fā)酵過程可以高效獲得大量菌體。 以大量菌株為基礎(chǔ)，確保在肥料施入土壤后有充足的微生物進(jìn)行代謝活動(dòng)以獲得Y-PGA。(3)以富含谷氨酸的水解渣作為生產(chǎn)保水型復(fù)合微生物肥料的原料，確保微生物有充足谷氨酸前體利用。肥料中所含微生物在土壤中，可以利用谷氨酸為前體，代謝產(chǎn)生
Y-PGA，從而達(dá)到增加土壤水分含量，抗旱保水的作用。(4)保水型復(fù)合微生物肥料養(yǎng)分全面，不僅供給作物適量的無機(jī)營(yíng)養(yǎng)，而且提供有效活菌、有機(jī)質(zhì)、氨基酸、腐殖酸以及礦質(zhì)元素。在為作物生長(zhǎng)提供全面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，還起到抗旱、防病、促生和改良土壤的作用。(5)以味精生產(chǎn)廢料作為復(fù)合微生物原料，為氨基酸廢料資源化提供了一條嶄新的處置途徑，而且可獲得附加值較高的保水型復(fù)合微生物肥料，從而降低了水解渣處置成本。


圖1是氨基酸水解渣的制造工藝流程圖。圖2是保水型微生物菌劑的制備流程圖。圖3是粉狀保水型微生物肥料的制備流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例11、菌株發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為谷氨酸鈉 10g/L, MgSO4 · 7H20 0. 25g/L，CaCl2 · 2H20 0. lg/L，K2HPO4 2g/L時(shí)，死谷芽孢桿菌菌株發(fā)酵條件為溫度32°C，裝液量為20%，培養(yǎng)基初始PH為6. 5，以酵母膏為氮源，用量為5g/L，糖化玉米粉為碳源，用量為15g/L時(shí)發(fā)酵，發(fā)酵48h后可獲得菌量為3. 9X 101(lCFU/mL ；2、氨基酸廢料取樣水解渣取自河南省蓮花氨基酸股份有限公司；3、pH調(diào)理在水解渣中加入氫氧化鉀8%混合，用鏈條粉碎機(jī)碎至80目后堆放 8-12h，讓其充分反應(yīng)。處理后水解渣的基本性狀見表1 ；表1處理后水解渣(粉狀)的基本性狀
權(quán)利要求
1.一種死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)工序，其特征在于 在所述發(fā)酵培養(yǎng)工序中，培養(yǎng)基的初始PH為6. 0 7. 0，菌株溫度30°C 37°C，氮源用量為 5 10g/L，碳源用量為15 25g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述氮源為酵母膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述碳源為蔗糖或糖化玉米粉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)工序中的裝液量為20% 30%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于48h發(fā)酵液中活菌或芽孢為3. 4 5. 1 X 1010CFU/mL以上。
6.一種含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，包括原料的處理和菌劑與原料的混合，其特征在于該方法包括以下步驟(1)原料的處理將水解渣敲碎成粉末或小顆粒，與堿性物質(zhì)混合，使處理后的水解渣原料PH達(dá)到5. 5-8. 0 ；(2)采用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵死谷芽孢桿菌，得到的發(fā)酵液用吸附介質(zhì)吸附后得到菌劑，與步驟(1)所得的水解渣按菌劑水解渣=1-30 100的質(zhì)量比混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述堿性物質(zhì)為石灰、KOH或NaOH的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述水解渣為氨基酸生產(chǎn)過程的發(fā)酵產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含死谷芽孢桿菌的微生物肥料的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(2)中還可加入無機(jī)肥料和/或微量元素肥料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種死谷芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)工序，在所述發(fā)酵培養(yǎng)工序中，培養(yǎng)基的初始pH為6.0～7.0，菌株溫度30℃～37℃，氮源用量為5～10g/L，碳源用量為15～25g/L。此外，還提供了用發(fā)酵得到的菌液利用水解渣為原料生產(chǎn)微生物肥料的方法。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)方法得到的48h發(fā)酵液中活菌或芽孢為3.4～5.1×1010CFU/mL以上，比常規(guī)方法至少高一個(gè)數(shù)量級(jí)，且微生物肥料的生產(chǎn)方法有效地利用了廢棄資源，具有環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102492641SQ201110425478
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者閆龍翔, 陳芳, 陳露 申請(qǐng)人:上海綠樂生物科技有限公司